小鼠TPO cDNA转染前后骨髓基质细胞TPOmRNA表达情况的研究

目的研究小鼠促血小板生成素(TPO)cDNA转染骨髓基质细胞(BMSCs)前后BMSCs中TPOmRNA表达的情况.方法以脂质体介导法将TPOcDNA真核表达质粒转染至BMSCs,用RT-PCR方法检测TPOmRNA的表达.结果转染TPOcDNA的BMSCs 其TPOmRNA表达量明显高于空载体组(P< 0.01)及未转染组(P<0.01).结论阳离子脂质体能有效介导TPOcDNA真核表达质粒转染BMSCs,且转染后BMSCs 中TPOmRNA的表达显著上调.     

脂质体介导的hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 观察脂质体介导的人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein-2,hBMP-2)基因转染兔骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后mRNA及其蛋白的表达.方法 采用脂质体介导的真核细胞转染技术,将含hBMP-2编码序列的真核表达质粒转染兔BMSCs,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化及免疫印迹法(Western blot)等手段检测转染后hBMP-2 mRNA及其蛋白的表达.结果 通过脂质体介导的真核转染方法能成功将外源hBMP-2基因转入兔BMSCs,并经RT-PCR、免疫组化和蛋白印迹法证实,转染pcDNA3.1-hBMP-2 后的兔BMSCs内有大量hBMP-2 mRNA 的转录和蛋白的表达.结论 通过脂质体介导的真核转染方法可以将外源hBMP-2基因转染BMSCs,并使其获得较为稳定的表达.     

脉冲电场介导AT2R基因在血管局部表达及其对血管新生内膜的影响

目的研究脉冲电场对血管紧张素2型受体(AT2R)基因在血管局部表达的作用,探讨AT2R基因在体转染对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜增生的作用。方法大鼠颈动脉球囊损伤后,用脉冲电穿孔法介导AT2R cDNA真核表达质粒或空质粒载体在动脉局部表达,于术后3、7 d和21 d用免疫组织化学、HE染色等方法,进行AT2R在颈动脉壁中表达的变化及定量组织形态学分析。结果免疫组织化学染色结果显示:脉冲电场介导AT2R cDNA真核表达质粒表达后,3 d时可见内膜、中膜、外膜大量AT2R的棕色阳性着色,7 d时可见少量棕色阳性着色,21 d棕色阳性着色几乎消失,未转染组及空质粒转染组未见AT2R的棕色阳性着色,表明脉冲电穿孔能有效导入AT2R基因,并在动脉壁获得稳定表达。在21 d时,AT2R cDNA真核表达质粒组的内膜面积与中膜面积比显著低于未转染组和空质粒载体组[分别为(0.76±0.08)、(1.39±0.08)、(1.32±0.10),P<0.01],空质粒转染组和未转染组间无统计学差异(P>0.01)。结论脉冲电穿孔可介导AT2R基因在血管局部有效表达,AT2R在体转染可抑制球囊损伤后大鼠颈动脉平滑肌细胞增殖和新生内膜增生。     

人SPOP真核表达质粒的构建及其在胃癌细胞中的表达

目的 构建人pUB6/V5-HisB-SPOP真核表达质粒及稳定表达外源性人SPOP基因的人胃癌AGS细胞系.方法 采用基因重组技术将人SPOP cDNA插入真核表达载体pUB6/V5-HisB,构建人pUB6/V5-HisB真核表达质粒.脂质体介导空载体pUB6/V5-HisB和表达质粒pUB6/V5-HisB-SPOP分别转染人胃癌AGS细胞株,杀稻瘟菌素筛选阳性克隆,扩大培养,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测SPOP mRNA和蛋白表达.结果 双酶切和基因测序结果均证实人pUB6/V5-HisB-SPOP真核表达质粒构建成功.SPOP转染组与空白对照组、空载体组比较,SPOP蛋白表达显著上调(P＜0.05).结论 成功构建人SPOP真核表达质粒并获得稳定表达SPOP基因的胃癌AGS细胞系,为进一步研究SPOP基因在胃癌发生发展中作用奠定实验基础.     

人AQP5真核表达质粒的构建及其在胃癌细胞中的表达

目的构建人pcDNA3.1-AQP5/myc-His真核表达质粒,观察水通道蛋白5(AQP5)基因在胃癌AGS细胞中的稳定表达。方法采用基因重组技术将人AQP5cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His,构建人pcDNA3.1-AQP5/myc-His真核表达质粒。脂质体介导空载体pcDNA3.1/myc-His和表达质粒pcDNA3.1-AQP5/myc-His分别转染人胃癌AGS细胞株,G418筛选,挑取阳性克隆,扩大培养,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)分别检测AQP5mRNA和蛋白表达。结果双酶切和基因测序结果均证实人pcDNA3.1-AQP5/myc-His真核表达质粒构建成功。AQP5转染组与空白对照组、空载体组比较,AQP5mRNA表达显著增加(P<0.05),AQP5蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论成功构建人AQP5真核表达质粒并获得稳定表达AQP5基因的胃癌AGS细胞系,为进一步研究AQP5蛋白对胃癌恶性表型的影响奠定实验基础。     

粉尘螨变应原第2组分真核表达载体的构建及其在小鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建含粉尘螨变应原第2组分(Der f 2)基因真核表达载体,并观察其在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达.方法 提取粉尘螨总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法扩增Der f 2基因,测序鉴定后将Der f 2基因克隆入pcDNA3.0质粒中,构建真核表达载体pcDNA3.0-Der f 2.将小鼠BMSCs分3组进行实验,包括pcDNA3.0-Der f 2转染组、pcDNA3.0空质粒转染组及未转染组,分别利用RT-PCR、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Der f 2基因及蛋白在3组BMSCs中的表达.结果 扩增的Der f 2基因序列与GenBank的参考序列完全一致,Der f 2基因正确克隆至真核表达载体pcDNA3.0中.转染BMSCs 48 h后,RT-PCR、Western blot检测结果显示,未转染组和pcDNA3.0空质粒转染组未检测到Der f 2基因表达,pcDNA3.0-Der f 2转染组检测到特异性条带,且大小与预期相符.结论 pcDNA3.0-Der f 2真核表达载体构建成功,Der f 2的mRNA和蛋白能在小鼠BMSCs中正确表达.     

乙型肝炎病毒X基因对正常肝细胞HL7702凋亡影响的初步探讨

目的 研究乙型肝炎病毒X基因(HBX基因)对HL7702肝细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响.方法 用脂质体转染法将HBx真核表达载体pcDNA3.1( )-X瞬时转入HL7702细胞,以转染空质粒pcDNA3.1( )的细胞及未转染的HL7702细胞为对照.转染后72 h收集细胞标本,作以下处理:RT-PCR法检测HBX mRNA的表达,免疫荧光鉴定HBx蛋白的表达;流式细胞术检测细胞凋亡率;以β-actin为内参,半定量RT-PCR法检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2 mRNA的表达量变化.结果 转染72h后,转染pcDNA3.1( )-X真核表达载体的HL7702细胞经RT-PCR扩增出HBX片段,免疫荧光结果 显示细胞内出现HBx蛋白的较强荧光;而转染空质粒组及未转染对照组经RT-PCR法及免疫荧光检测均显示无HBx表达.通过流式细胞术和半定量RT-PCR法检测细胞凋亡情况,结果 显示:转染HBX的细胞凋亡率(3.38%±0.67%)相对于转染空质粒组(1.25%±0.30%)及未转染质粒组(1.40%±0.37%)凋亡率增高, 差异均有显著性意义(P<0.05);转染HBx的细胞Bax mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差异均有显著性意义(P<0.05),Bcl-2 mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显降低,差异均有显著性意义(P<0.05).转染空质粒组和未转染质粒组之间,对细胞凋亡率、Bax mRNA、Bcl-2 mRNA进行比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论成功将HBX转染入HL7702细胞,并在细胞中表达;转染后72 h HBx可上调Bax表达,而下调Bcl-2表达,表明HBx能促进HL7702细胞凋亡.     

人类抗凋亡基因bcl-xL的克隆及其在大鼠心肌细胞内的高效表达

[目的]克隆人类抗凋亡基因bcl-xL cDNA,构建两种不同的真核表达载体,评价大鼠心肌细胞表达外源性bcl-xL的效果,并比较不同转染方法对bcl-xL表达的影响.[方法]]RT-PCR法从人肝脏组织获取bcl-xL cDNA,连接至pTargeTTM载体,并亚克隆至真核表达载体pEGFP-C1上;细菌内同源重组构建重组腺病毒质粒,腺病毒纯化试剂盒获取高滴度的重组腺病毒;脂质体和腺病毒介导分别转染体外培养的大鼠心肌细胞,荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR和免疫细胞化学染色法检测bcl-xL mRNA和bcl-xL蛋白的表达.[结果]获取的bcl-xL cDNA测序正确,成功克隆真核表达质粒pEGFP-bcl-xL;病毒颗粒滴度高达5.3×1012 pfu/L;脂质体和腺病毒转染心肌细胞效率分别为40.3%和95.4%,转染后bcl-xL mRNA和bcl-xL蛋白的表达均增加,但两种方法之间差异有统计学意义(P＜0.01).[结论]成功获取人类bcl-xZ基因并制备真核表达质粒和重组腺病毒,心肌细胞能高效表达外源性bcl-xL,并以腺病毒介导更为理想.为bcl-xL基因治疗缺血性心脏病提供实验基础.     

人DNA聚合酶δ2真核载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人DNA聚合酶δ2(DNA Polδ2)真核表达载体,转染人胚胎肾细胞(HEK293)并观察其表达水平。方法用逆转录PCR(RT-PCR)方法从人胚肺成纤维细胞(WI38细胞)扩增目的基因DNA Polδ2cDNA片段,与pMD-18T载体连接,构建质粒pMD-18T-Polδ2;将目的片段DNA Polδ2从质粒pMD-18T-Polδ2切下,与真核表达载体pcDNA 3.1(+)连接,构建正义及反义真核表达载体pcDNA 3.1-Polδ2。应用脂质体转染试剂,分别将正义、反义真表达载体pcDNA 3.1-Polδ2,空载体pcDNA3.1(+)转染至HEK293细胞,同时设置阴性对照;用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因DNA Polδ2mRNA及蛋白表达水平。结果正义和反义DNA Polδ2真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2中插入的目的片段与GENEBANK上DNA Polδ2cDNA序列完全一致。RT-PCR方法显示正义及反义真核表达载体转染组细胞的目的基因DNA Polδ2mRNA表达均明显高于空载体转染组及阴性对照组;Western blot显示正义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达明显增强,反义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达阴性。结论人DNA Polδ2正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2构建成功。     

TIMP-3-pcDNA3.0转染平滑肌细胞及其在大鼠心肌梗死瘢痕中的存活与表达

目的 探讨基质金属蛋白酶抑制因子3(TIMP-3)基因转染平滑肌细胞的效果及移植的转染细胞能否在大鼠心梗瘢痕中存活并表达目的 蛋白.方法 植块法培养大鼠主动脉中层平滑肌细胞并鉴定;脂质体介导法以"TIMP-3基因质粒转染平滑肌细胞;RT-PCR和Western blot检测转染细胞的基因水平和蛋白表达;通过BrdU移植检测移植细胞的存活与增殖情况.实验大鼠随机分成单纯PBS注射、单纯平滑肌细胞移植和转染平滑肌细胞移植3组(每组7只实验大鼠),将移植物注射人(五点法)心梗大鼠的室壁内.1周后,提取其左心室组织mRNA和蛋白,分别进行RT-PCR和Western blot检测,鉴定其.TIMP-3基闪含量和表达情况.结论 植块法培养可以获得高纯度的平滑肌细胞;脂质体介导法可以使TIMP-3基因转染平滑肌细胞并获得TIMP-3蛋白的表达;移植的转染细胞能够在心梗缀痕中存活并增殖;转染细胞组大鼠左心室组织中TIMP-3 mRNA含量明显多于单纯平滑肌细胞移植组(P<0.01)及单纯PBS注射组(P<0.01);转染细胞移植组大鼠左心室组织中TIMP-3蛋白含量明显多于平滑肌细胞移植组(P<0.01)及单纯PBS注射组(P<0.01).结论TIMP-3基因可以通过脂质体介导法转染平滑肌细胞,且转染细胞可以在大鼠梗死心肌中存活、增殖并表达TIMP-3蛋白.     

人骨形态发生蛋白-2真核表达质粒的制备、转染及表达

目的 制备含人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）基因的真核表达质粒，获得可稳定高效表达BMP-2的兔骨髓基质细胞，为进一步研究BMP-2在骨牵张区的成骨作用作准备。方法 制备携带有hBMP-2的全长真核表达质粒pcDNA3.1-BMP2。通过脂质体法将所得到的重组真核质粒转染到兔骨髓基质细胞中，用G418进行梯度筛选，从而得到能够稳定表达hBMP-2的细胞克隆。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测骨髓基质细胞（MSCs）hBMP-2 mRNA的表达。结果 重组质粒通过EcoRI酶切后，电泳图示约1.5kb的hBMP-2的目的片段及5.5kb的载体片段，经测序显示核苷酸序列正确无误。经RT-PCR检测hBMP-2在转录水平mRNA的表达情况，提示转染组hBMP-2的mRNA量较空白对照组明显增加。结论 成功制备了含hBMP-2基因的真核表达质粒，转染后获得了高效表达hBMP-2的兔骨髓基质细胞。     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞的表达

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞并鉴定

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

核基质蛋白SAFB真核表达载体的构建及其鉴定

目的构建人SAFB基因真核表达载体,为SAFB基因功能研究提供研究基础。方法设计人SAFB特异性引物,提取人正常结直肠上皮组织总RNA,应用RT-PCR方法提取人SAFBcDNA,通过双酶切及测序鉴定,将SAFB克隆至pcDNA3.1（-）,构建人SAFB基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）/SAFB,转染SW480细胞,用WesternBlot技术检测目的蛋白的表达。结果成功扩增人SAFB全长cDNA,双酶切鉴定和测序结果证实成功构建pcDNA3.1（-）/SAFB真核表达载体,转染细胞后,可检测出分子量约为140KD的目的蛋白。结论获得人SAFB基因全长cDNA并成功构建了SAFB真核表达载体,证实pcDNA3.1（-）/SAFB转染SW480细胞后可表达SAFB蛋白,为深入研究SAFB基因在肿瘤发生发展中的作用提供了基础。     

人granzyme B基因在HeLa细胞中的表达

目的 构建携带人granzyme B基因的真核表达载体，并将其在HeLa细胞中的表达。方法 用反转录PCR获取人granzyme B全长cDNA序列，将其活性型序列克隆进pcD-NA3重组表达质粒。脂质体法转染HeLa细胞，间接免疫荧光检测目的蛋白表达，HE染色观察其对转染HeLa细胞形态的影响。结果工成功获得了野生型granzyme B cDNA，构建了编码活性型granzyme B的真核表达载体pcDNA3-G。转染HeLa细胞后观察到目的的蛋白表达，转染细胞形态发生变化，出现多核大细胞及固缩小细胞。结论 活性型granzyme B哺乳动物表达系统的建立，为进一步研究granzyme B的生物学效应奠定了基础。     

MAGE-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建MAGE-1基因重组真核表达质粒并在细胞系NIH-3T3中高效表达。方法用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌（HCC）组织全RNA中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）,构建pcDNA3．1-MAGE-1重组质粒．重组质耗用脂质体转染NIH-3T3细胞,经RT-PCR和Western-blot鉴定转化细胞中MAGE-1的表达。结果RT-PCR获得长度为927bp的MAGE-1基因,经T载体和pcDNA3．1（＋）真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实重组质粒构建正确,并存转化细胞中检测到了MAGE-1的表达。结论 真核表达质粒pcDNA3．1-MAGE-1构建成功,并建立了稳定表达人MAGE-1的NIH-3T3细胞株。     

人真核表达质粒载体pcDNA3.1-hOPG的构建及体外表达

目的 构建表达人骨保护素基因（hOPG）的真核表达质粒pcDNA3．1-hOPG,并检测其在体外的表达,为治疗破骨细胞功能异常引起的骨吸收提供实验基础。方法 从MGC：29565上获得hOPG基因片段并用PCR方法扩增,将其连接于真核表达质粒pcDNA3．1（-）,测定序列后,用脂质体包裹转染C2C12细胞,采用免疫组化和骨吸收抑制实验检测OPG的表达及功能。结果 经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染C2C12细胞后可表达功能性OPG蛋白。结论成功构建的pcDNA3．1-hOPG重组质粒能在体外表达OPG蛋白。     

mic2/CD99基因克隆及在霍奇金淋巴瘤L428细胞株中表达

目的克隆mic2/CD99基因并表达于L428细胞株。方法通过PCR及双酶切方法,从Jurkat细胞基因组RNA中获得mic2/CD99全长基因编码序列,克隆到pcDNA3.1（＋）质粒载体上,构建包含mic2/CD99全长基因载体;用脂质体转染法将mic2/CD99全长基因载体转染至L428细胞系;并从分子水平验证其存在。结果RT-PCR方法扩增出大小为558bp片段,序列测定其编码序列正确,酶切鉴定亚克隆序列正确。结论成功构建了mic2/CD99全长基因载体,并稳定转染于L428细胞株中。