体外测定抗氯喹恶性疟原虫方法的改进

近年来,我国云南省及广东省海南岛均发现对氯喹有抗药性的恶性疟原虫。为调查抗性虫株的分布及其抗性程度,并寻找新药,我们采用液氮冻存法将海南岛一恶性疟原虫虫株带回实验室复苏,参照Trager及Jenaen的蜡烛缸培养法培养,用微量法以减虫率作观察指标,测定原虫对药物的敏感性。证明该株对氯喹已产生抗药性,体外培养两个月左右仍有明显抗药性,经连续转种培养3～4个月,抗性自行消失。现将结果     

恶性疟原虫红内期的体外培养及其影响因素

液氮内保存的FCC—1株恶性疟原虫红内期用蜡烛缸—平皿法体外连续培养40天。疟原虫复苏后培养的第3天原虫密度开始上升.第11天达到最高峰,其中一皿的红细胞含虫率高达20.56%。影响恶性疟原虫体外培养的有关因素如RPMI—1640培养液,血清和红细胞,本文进行了讨论。     

恶性疟原虫肝期抗原1基因3＇端的克隆及序列分析

[目的]克隆并测定恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)肝期抗原1基因(LSA-1)3＇端序列,比较FCC1/HN株与国外分离株LSA-13’端序列的差异.[方法]应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增LSA-13’端序列,用T-A克隆法将其克隆入pMD18-T载体.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR扩增鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用DNASTAR软件进行不同分离株LSA-13’端序列的同源性分析.[结果]PCR扩增得到特异的FCC1/HN LSA-13’端序列.酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-LSA-1重组质粒.测序表明,所克隆的LSA-1 3 ＇端大小为795bp,编码264个氨基酸.序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的NF4、T9/96、KEN、PNG及BRA株LSA-13’端编码的氨基酸序列只在3个位点存在不同.[结论]克隆了恶性疟原虫FCC1/HN LSA-13’端片段.序列测定及同源性分析表明,FCC1/HNLSA-1 3＇端序列与其它分离株有高度的同源性.     

恶性疟原虫FCC-1/HN株3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的序列测定

目的：对恶性疟原虫FCC-1/HN株的3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因进行序列测定。方法：恶性疟原虫FCC-1/HN株体外培养物提取总RNA和基因组DNA，从总RNA合成cDNA。分别用基因组DNA和cDNA作模板在体外用特异引物扩增GAPDH基因，并直接对其进行序列测定。结果：恶性疟 原虫GAPDH基因含一个约300bp的内含子，该基因的开放阅读框共1011bp,编码一个337氨基酸残基的蛋白质。结论：我国恶性疟原虫FCC-1/HN株的GAPDH基因序列与泰国K1株的GAPDH基因序列一致。     

恶性疟原虫肝期抗原1基因3′端的克隆及序列分析

【目的】克隆并测定恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)肝期抗原 1基因 (LSA 1) 3′端序列 ,比较FCC1/HN株与国外分离株LSA 13′端序列的差异。【方法】应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增LSA 13′端序列 ,用T A克隆法将其克隆入pMD18 T载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR扩增鉴定后 ,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNASTAR软件进行不同分离株LSA 13′端序列的同源性分析。【结果】PCR扩增得到特异的FCC1/HNLSA 13′端序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的 pT LSA 1重组质粒。测序表明 ,所克隆的LSA 13′端大小为 795bp ,编码 2 6 4个氨基酸。序列分析表明 ,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的NF5 4、T9/ 96、KEN、PNG及BRA株LSA 13′端编码的氨基酸序列只在 3个位点存在不同。【结论】克隆了恶性疟原虫FCC1/HNLSA 13′端片段。序列测定及同源性分析表明 ,FCC1/HNLSA 13′端序列与其它分离株有高度的同源性。     

恶性疟原虫红内期p41-3基因真核表达重组质粒的构建及序列分析

[目的]构建恶性疟原虫海南(FCC1/HN)株p41-3基因真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3;测定p41-3基因序列,并了解FCC1/HN株与其它分离株p41-3序列的差异.[方法]根据p41-3基因已知序列设计合成2对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增p41-3基因;将p41-3基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;用酶切,PCR扩增鉴定筛选到的重组质粒阳性克隆.以正确的重组质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定p41-3基因序列,应用软件辅助分析p41-3序列及进行同源性比较.[结果]PCR扩增得到特异的FCC1/HN株p41-3基因;正确的pcD-NA3-p41-3重组质粒被筛选和鉴定.测序表明,FCC1/HN株p41-3基因大小为2 137 bp,编码375个氨基酸.恶性疟原虫FCC1/HN株与FCBR株p41-3基因核苷酸序列同性为98.98%,编码氨基酸序列同源性为99.73%.[结论]从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中获取p41-3基因,成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3,并测定了FCC1/HN株p41-3基因的序列;FCC1/HN株与其它分离株p41-3基因有高度的同源性.     

恶性疟原虫红内期p41—3基因真核表达重组质粒的构建及序列分析

目的 构建恶性疟原虫海南（FCC1／HN）株p41-3基因真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3,测定p41-3基因序列,并了解FCC1/HN株与其它分离株p41-3序列的差异。方法 根据p41-3基因已知序列设计合成3对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增p41-3基因;将p41-3基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;用酶切,PCR扩增鉴定筛选到的重组质粒阳性克隆。以正确的重组质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定p41-3基因序列,应用软件辅助分析p41-3序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1/HN株p41-3基因;正确的pcDNA3-p41-3重组质粒被筛选和鉴定。测序表明,FCC1／HN株p41-3基因大小为2137bpo,编码375个氨基酸,恶性疟原虫FCC1/HN株与FCBR株p41-3基因核苷酸序列同性为98．98％,编码氨基酸序列同源性为99．73％。结论 从恶性疟原虫FCCl/HN株 基因组DNA中获取p41-3基因,成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3,并测定了FCC1／HN株p41-3基因的序列;FCC1／HN株与其它分离株p41-3基因有高度的同源性。     

利用RT—PCR的方法检测恶性疟原虫海南株FCC1／HN CT基因在红细胞内期的表达及CTP基因真核表达载体的构建

目的 利用反转录PCR（RT-PCR）的方法检测CTP基因是否在恶性疟原虫红内期表达。并构建CTP因的真核表达载体,以便进一步研究其功能。方法 按常规方法体外培养红内期恶性疟原虫,用Trizol试剂提取红内期疟原虫总RNA,通过RT-PCR方法扩增恶性疟原虫FCC1/HN株CTP编码基因并构建CTP基因的真核表达载体。结果获得了恶性疟原虫CTPcDNA的全编码区序列并将其克隆入真核表达载体pcDNA3。结论 CTP基因在恶性疟原虫FCC1/HN株红细胞内期表达并成功地构建了CTP基因的重组表达质粒。     

恶性疟虫肝期抗原1基因3′端的克隆及序列分析

目的：克隆并测定恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）肝期抗原1基因（LSA－1）3′端序列,比较FCC1／HN株与国外分离株LSA－1,3′端序列的差异。方法：应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增LSA－1,3′端序列,用T－A克隆法将其克隆入pMD18－5载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR扩增鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNASTAR软件进行不同分离株LSA－1,3′端序列的同源性分析。结果：PCR扩增得到特异的FCC1／HN LSA－1,3′端序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pT－LSA－1重组质粒。测序表明,所克隆的LSA－1,3′端大小为795bp,编码264个氨基酸。序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1／HN株国外的NF54、T9／96、KEN、PNG及BRA株LSA－1,3′端编码的氨基酸序列只在3个位点存在不同。结论：克隆了恶性疟原虫FCC1／HN LSA－1,3′端片段。序列测定及同源性分析表明,FCC1／HNLSA－1,3′端序列与其它分离株有高度的同源性。     

恶性疟原虫红内期在体外存活时间的实验观察

目的 观察恶性疟原虫红内期在体外存活时间，分析其培养虫血的感染活力。方法 采用Tragers等常规体外培养方法，待恶性疟原虫体外连续培养的原虫率达到15％～20％时，吸取含虫血于保存液置4℃贮存，以后每天吸取少量虫血培养，24h观察原虫生长情况。结果 恶性疟原虫血4℃贮存2d疟原虫减虫率80．6％，10d几乎为100％；11d已未发现疟原虫。结论 估算体外培养的恶性疟原虫红内期在体外4℃贮存，存活时间不超过11d。     

恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 了解恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）谷氨酸脱氢酶（GDH）基因全编码区核苷酸序列变异情况。方法 PCR扩增恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）GDH基因全编码区,产物经EcoRI SalI酶切后,定向克隆至pGEX-4T-1质粒,采用Sanger双脱氧链末端终止法测序,与其它生物GDH进行同源性分析。结果 成功扩增了恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）GDH编码基因,大小为1410bp,无内含子,与Thailand株GDH基因相比,两有2个碱基不同,推导的氨基酸序列完全相同;与蓝氏贾第鞭毛虫,克鲁氏锥虫和梭状芽孢杆菌GDH的同源性分别为57.90%(260/449),56.51%(243/430),42.05%(164/390);与人的GDH-1,GDH-2的同源性分别为29.02%（101/348）,28.73%(100/348)。结论 FCC1/HN株与Thailand株GDH高度同源,疟原虫GDH明显不同于其它生物GDH。     

恶性疟原虫MESA基因的克隆和测序

目的克隆、测定恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)成熟疟原虫感染红细胞表面抗原(MESA)基因序列，并进行序列分析。方法根据恶性疟原虫palo-alto株MESA基因已知序列，设计合成四对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出4个部分序列重叠的MESA基因片段，分别克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定这4个基因片段的序列，拼接得到全长MESA基因序列。应用DNAstar、AnthProt软件辅助进行序列同源性比较和抗原表位区预测。结果PCR扩增得到特异的恶性疟原虫FCC1／HN株MESA基因片段，酶切及PCR鉴定获得了包含MESA基因片段的重组质粒。测序结果表明，FCC1／HN株MESA全基因编码区长4102bp，A T含量为72．11％，G C含量为27．89％，有1个内含子；编码1323个氨基酸残基，分子量为154470u。序列分析表明，FCC1／HN株与Palo-aho、D10株MESA蛋白在长度和序列组成上呈多态性，序列差异较大区域位于MESA蛋白的氨基酸重复区1、3、4、5和7。经多参数综合分析，有7个潜在的抗原表位区。结论测定、分析了恶性疟原虫FCC1／HN株MESA基因序列。FCC1／HN株MESA基因与其它分离株的MESA基因编码的氨基酸序列存在一定差异。     

HRPII双抗夹心ELISA检测恶性疟原虫体外敏感性研究

目的验证富组蛋白2双抗夹心酶联免疫吸附法（Histidine—Rich Protein 2 Double—Site Sandwich Enzyme—Linked Immunosorbent Assay,HRPII—ELISA）在恶性疟原虫体外敏感性检测中的适用性。方法运用HRPII-ELISA测定氯喹、咯萘啶、青蒿琥酯、蒿甲醚及双氢青蒿素等五种抗疟药物对体外培养的恶性疟原虫氯喹敏感株与氯喹抗性株的体外敏感性,并对所测得的量效曲线（dose-response curves）及50％有效抑制浓度（IC50）与WHO推荐的Rieklnann体外微量法比较。结果HRPH—ELISA法测定的五种药物对恶性疟原虫氯喹敏感株的IC50值依次为4．7nmol/L、2．90nmol／L、3．38nmol／L、4．64nmol／L、2．72nmol／L,对恶性疟原虫氯喹抗性株的IC50值依次为110．4nmol／L、3．85nmol／L、4．39nmol／L、3．90nmol／L、3．27nmol／L;同时,将上述结果与体外微量法所得的结果进行相关性分析,R2=0．96,P〈0．001,两种方法结果基本一致。结论HRPII—ELISA法可用于恶性疟原虫对抗疟药物的体外敏感性检测。     

恶性疟原虫FCC1/HN株MSA1抗原Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ保守区基因的亚克隆及序列分析

P190系恶性疟原虫裂殖子表面抗原1(MSA1),是很有希望的疟疾疫苗候选抗原。根据该基因现有序列,我们设计了3对引物,在5′端引物和3′端引物前分别设有BamHI和XbaI酶切位点序列,在每个酶切位点前设有保护性碱基GC,用固相亚磷酸酰胺法在ABI391型DNA自动合成仪上自动合成引物,合成的引物氨解、冷冻干燥后经HPLC纯化。采用聚合酶链反应(PCR)方法扩增了恶性疤原虫FCC1/HN株P190第3、4保守区和第2保守区部分序列的基因片段,分别定名为P190CR3、P190CR4和P190CR2-2,各片段均连接到pUC18载体上,用双脱氧末端终止法测定了克隆片段的DNA序列,结果表明这3个区域的DNA序列与MAD20(采自巴布亚-新几内亚)、Wellcome(采自西非)、K1(采自泰国)及CAMP(采自马尔加什)株恶性疟原虫P190相应区域比较也是高度保守的。在该基因第2保守区核苷酸第81位(相当于MAD20的732位)发生了碱基替换,由T替代了C,但未发生氨基酸的改变。     

恶性疟原虫子孢子表面蛋白2基因的克隆与序列分析

目的：克隆恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)子孢子表面蛋白2(PfSSP2)基因，并进行序列分析。方法：根据PfSSP2基因已知序列设计合成一对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出PfSSP2基因，并克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测序，用DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果：PCR扩增得到特异的FCC1／HN株PfSSP2基因序列，酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-PfSSP2重组质粒。测序表明，所克隆的PfSSP2基因大小为1680bp，编码559个氨基酸残基。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的3D7、DD2、FCR3、HB3A、K1、Thai814、Thai838、Thai842、Thai947及7G8株PfSSP2的氨基酸序列在33个位点存在氨基酸替代，1处氨基酸序列增加；各株间PfSSP2的氨基酸序列同源性都在95.7％以上。结论：克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株PfSSP2基因。序列测定及同源性分析表明，恶性疟原虫不同分离株间有高度的同源性。     

抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的研制与胶体金免疫层析方法的建立

OBJECTIVE: To prepare a monoclonal antibodies (mAbs) against glutamate dehydrogenase (GDH) of Plasmodium falciparum (FCC1/HN strain) and establish colloidal gold-immunochromatographic assay (GICA) for diagnosis of Plasmodium falciparum malaria. METHODS: Recombinant GDH was used to immunize Balb/C mice and the mAbs against GDH were prepared using hybridoma technique followed by identification of IgG isotype and its affinity. Protein-G affinity chromatography was employed to purify the antibodies, which were labeled with colloidal gold for establishment of GICA for Plasmodium falciparum detection. RESULTS: Six mAbs were obtained and identified as IgG1(kappa) of IgG isotypes with affinity constants (Kaff) ranging from 1 x 10(-8) to 2.8 x 10(-10). GICA had a sensitivity of 86.66%; and specificity of 96.43%; for Plasmodium falciparum detection compared with routine microscopic examination. CONCLUSION: The established GICA is rapid and accurate for Plasmodium falciparum detection with such potential utility as for instant diagnosis of Plasmodium falciparum malaria.     

Sequence determination of exp- 1 Gene of Plasmodium Falciparum Isolate FCC1／HN

目的 测定恶性疟原虫FCCl／HN株exp-1基因序列。方法 根据exp-1基因已知序列设计合成1对引物，用PCR技术从FCCl／HN株基因组DNA中扩增exp-1基因；将exp-1基因克隆入pMD-18T载体，转化大肠杆菌JMl09感受态细胞，铺x—gal LB平板；挑取阳性菌落，用酶切，PCR扩增进行鉴定。以正确的重组质粒为模板，用双脱氧链末端终止法测定exp-1基因序列。结果 从恶性疟原虫FCCl／HN株基因组DNA中获取exp-1基因，成功克隆入pMD-18T载体；测序表明FCCl／HN株exp-1基因全长937bp，编码162个氨基酸。结论 克隆了恶性疟原虫FCCl／HN株exp-1基因，并测定了其核苷酸序列，为进-步研究其功能奠定基础。     

In vitro potentiation of antimalarial activities by daphnetin derivatives against Plasmodium falciparum

Objective To screen the antimalarial compounds of daphnetin derivatives against Plasmodium falciparum in vitro. Method Plasmodium faciparum （FCC1） was cultured in vitro by a modified method of Trager and Jensen. Antimalarial compounds were screened by microscopy-based assay and microfluorimetric method. Results DA79 and DA78 showed potent antimalarial activity against Plasmodiumfalciparum cultured in vitro. Conclusion Though the relationship between the structures of daphnetin derivatives and their antimalarial activities has not been clarified yet, this study may provide a new direction for discovery of more potential antimalarial compounds.