mOX40-Fc的真核表达及其对混合淋巴细胞反应的影响

构建重组pcDNA3.1-mOX40-Fc真核表达载体,在CHO细胞中表达,并初步研究融合蛋白mOX40-Fc对MLR中细胞增殖的影响。克隆编码hIgG1Fc基因片段,与编码小鼠OX40胞外段的基因融合,构建mOX40-Fc融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3.1-mOX40-Fc;转染CHO细胞构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株,用RT-PCR及夹心ELISA检测其表达,纯化后经SDS-PAGE及Western blot法对其进行鉴定,混合淋巴细胞反应(MLR)测定其生物学活性。结果:核苷酸序列测定显示构建的mOX40胞外段和hIgG1Fc段基因序列与GenBank序列一致、阅读框完整;RT-PCR、ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达;功能实验提示mOX40-Fc能抑制MLR中的细胞增殖。成功构建mOX40-Fc真核表达载体并获得高效表达,该重组蛋白可在体外通过抑制OX40/OX40L共刺激通路抑制淋巴细胞增殖。     

人OX40-Fc分子的构建、真核表达及活性研究

目的构建人OX40-Fc基因的真核表达质粒，并表达有生物学活性的纯化人OX40-Fc融合蛋白。方法从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法扩增OX40膜外区cDNA编码基因，并导入真核表达载体pcDNA3中。测序证实后，进行酶切并与人IgG1Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中，采用脂质体法稳定转染COS-7细胞，用夹心ELISA检测其表达情况，经蛋白A亲和纯化，用SDS-PAGE与Western blotting进行鉴定。检测其对活化后Jurkat细胞增殖的抑制活性。结果测序证实构建的OX40膜外区与OX40-Fc cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；ELISA证实OX40-Fc蛋白的表达；SDS-PAGE与Western blotting证实其为OX40-Fc蛋白。增殖实验证明其对活化后的Jurkat细胞有抑制增殖作用。结论成功构建了人OX40-Fc真核表达载体，并使有生物学活性的OX40-Fc融合蛋白在COS-7细胞上获得了稳定表达。为进一步研究该蛋白在自身免疫性疾病治疗中的作用及调节免疫自稳机制中的地位奠定了基础。     

可诱导共刺激分子和小鼠免疫球蛋白融合基因的分泌表达及生物学活性

目的：为获得重组可诱导共刺激分子胞外段与小鼠免疫球蛋白的融合蛋白（ICOS-Ig）并研究其生物学活性，以探讨它作为免疫拮抗剂阻断ICOS／B7RP-1共刺激通路的作用。方法：克隆编码人可诱导共刺激分子（ICOS）胞外片段，与编码小鼠免疫球蛋白IgG恒定片段（Ig）的基因融合，构建ICOS-Ig融合基因及其分泌型真核表达载体pSecTag2／Hygro A-ICOS-Ig；构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株，用Western blot和ELISA法检测其表达、流式细胞仪（FACS）检测其配体结合活性、混合淋巴细胞反应（MLR）及细胞因子检测测定其生物学活性。结果：核苷酸序列测定显示克隆基因的核苷酸与Genebank序列一致：ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达，其含量可达5～25μg／ml；该重组蛋白有配体结合活性，可体外抑制淋巴细胞增殖、减少IL-2、IFN-γ的分泌。结论：重组ICOS-Ig融合基因及其真核表达载体的构建完成并获得高效表达，该重组蛋白具有配体结合活性，可在体外通过抑制ICOS／B7RP-1共刺激通路抑制淋巴细胞增殖及细胞因子分泌。     

小鼠sST2基因真核表达及其对LPS活化RAW264.7巨噬细胞的调节作用

目的:克隆并构建含小鼠sST2和人IgG Fc 融合基因的真核表达质粒, 初步探讨其表达产物sST2-Fc融合蛋白对LPS刺激小鼠巨噬细胞生物学活性的影响.方法:借助RT-PCR技术, 从小鼠脾脏总RNA中扩增全长sST2 cDNA, 构建sST2与hIgG Fc段融合基因的真核表达载体(psST2-Fc).应用脂质体将重组质粒psST2-Fc转染CHO细胞, 经G418筛选, 获得稳定表达sST2-Fc融合蛋白的CHO细胞株.细胞培养上清经蛋白A亲和层析纯化后, 采用Western blot进行鉴定, 应用FACS检测sST2-Fc与RAW264.7巨噬细胞表面相应受体结合情况;ELISA法检测sST2-Fc对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的影响.结果:测序证实克隆和构建的小鼠sST2-Fc cDNA阅读框序列正确, Western blot 证实sST2-Fc融合蛋白的表达, sST2-Fc抑制LPS诱导巨噬细胞分泌的炎性细胞因子TNF-α和IL-6.结论:成功构建sST2-Fc融合基因并获得稳定表达, sST2-Fc通过与其特异性受体结合可抑制巨噬细胞介导的炎性反应.     

腺病毒载体介导的共刺激分子融合蛋白对实验性自身免疫性心肌炎的作用

目的探讨腺病毒载体介导的共刺激分子融合蛋白CTLA4Ig与ICOSIg联合治疗对实验性自身免疫性心肌炎（EAM）的作用.方法猪心肌肌球蛋白免疫Lewis大鼠制成EAM模型.分别构建CTLA-4胞外域、ICOS胞外域与人IgG Fc段融合的腺病毒表达载体,常规方法生产表达上述融合蛋白的腺病毒用于治疗,免疫第14天注射后观察至第28天.第28天超声心动图检测心脏功能,苏木素-伊红（HE）染色观察心肌炎症程度,Western blot检测心肌CTLA-4、ICOS、ICOSL及B7-1、B7-2蛋白表达水平,ELISA检测血浆IL-2、IL-4和IFN-γ水平.结果CTLA4Ig、ICOSIg单独或联合治疗均使大鼠心功能指标、心肌炎症程度明显改善.Western blot显示联合治疗组CTLA-4、ICOSL及ICOS、B7-1蛋白表达下调,而B7-2表达差异无统计学意义.细胞因子平衡向TH2方向偏离.结论CTLA4Ig及ICOSIg联合阻断共刺激分子通路减轻EAM自身免疫性心肌损伤,改善大鼠心脏功能.其机制可能通过下调心肌组织CTLA-4、ICOS、ICOSL及B7-1蛋白表达.     

人IgG Fc基因的扩增及其在真核细胞中的分泌性表达

目的:通过扩增人IgG Fc基因并与人CD5基因信号肽序列融合,构建真核分泌型表达载体,实现在真核细胞中高效表达,为利用Fc基因制备融合抗原,研究抗原基因和抗原蛋白的免疫治疗奠定了基础.方法:从外科手术切除的扁桃体中分离人淋巴细胞,用Trizol试剂提取淋巴细胞的总RNA,通过RT-PCR方法从淋巴细胞中扩增人IgG Fc 片段的基因序列,并将其克隆到pMD-T18 质粒载体上.然后以上述含有Fc片段序列的质粒载体和含有人CD5基因的质粒为模板,通过重叠延伸PCR方法将Fc片段与CD5信号肽基因序列进行融合,并将其插入到pcDNA3.1A 真核表达载体上,构建成与CD5信号肽融合的Fc片段基因的分泌型表达载体.经磷酸钙介导转染293T细胞使其表达.结果:测序表明扩增的Fc基因序列与GeneBank发表的序列完全一致,Western blot检测结果表明,本实验构建的Fc基因分泌型表达载体能够在真核细胞进行高效分泌性表达,表达水平在转染后48小时可达50 μg/1×106细胞.结论:采用RT-PCR扩增了人IgG Fc cDNA 基因,经过与人CD5信号肽序列融合构建了分泌型表达载体,实现了在293T细胞中的高效表达,这为今后构建特定抗原基因与IgG Fc基因融合表达载体,研究DNA疫苗及Fc的生物佐剂提供了实验依据.     

人ICOS基因转染细胞对抗体产生的影响

利用RT-PCR方法从扁桃体中激活的T细胞,mRNA中扩增出ICOS cDNA,继而将ICOS基因插入到逆转录病毒载体pGEZ-Term中,用脂质体法将重组逆转录病毒载体与两个辅助病毒载体共同转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清转染L929细胞,经Zeocin筛选获得稳定表达ICOS蛋白的L929细胞株;经RT-PCR、流式细胞仪表型检测证实L929基因转染细胞能稳定表达人ICOS蛋白。利用ICOS和CD40L基因转染细胞联合IL-10以及PWM驱动的B细胞体外培养系统,分析了ICOS在B细胞生长及抗体产生中的作用,实验结果表明,ICOS在PWM体外培养体系中,能有效地促进B细胞生长以及协同IL-10增加IgG的分泌。     

人补体受体2-Fc融合蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建人补体受体2(CR2)-Fc融合蛋白基因表达载体,在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达人CR2-Fc蛋白。方法将人CR2片段和IgG1 Fc片段进行连接,克隆入PCI-neo表达载体。脂质体法将测序正确的重组真核表达载体转染CHO K1细胞进行蛋白表达,采用SDS-PAGE、Western blot法对蛋白表达进行检测和鉴定。结果利用双酶切及基因测序结果证实CR2-Fc基因序列正确,重组真核表达载体构建成功;SDS-PAGE检测纯化产物的相对分子质量(M r)与预期结果一致,Western blot法在同样位置检出条带。结论成功构建了CR2-Fc重组真核表达载体,获得了有活性的融合蛋白。     

hBAFF-R-Fc融合分子的构建、表达与鉴定

目的 构建人hBAFF-R-Fc基因的真核表达质粒,并表达有生物学活性的人hBAFF-R-Fc融合蛋白.方法 化学合成法合成人hBAFF-R膜外区cDNA编码基因,酶切测序证实后,与hIgG4.Fc/Leu235Glu突变体一起导入线性化pSec/WG真核表达载体,阳性重组体酶切测序证实后,采用脂质体法稳定转染CHO细胞,用夹心ELISA检测其表达;收集的蛋白经蛋白A亲和纯化,以SDS-PAGE与Western blot进行鉴定并检测hBAFF-R-Fc的活性.结果 测序证实构建的hBAFF-R膜外区与hBAFF-R-Fc cDNA阅读框完整,EIJSA证实转染hBAFF-R-Fc基因的CHO细胞培养上清中含有hBAFF-R-Fc蛋白,SDS-PAGE与 Westernblot鉴定证实其为hBAFF-R-Fc蛋白.hBAFF-R-Fc蛋白对活化后的B细胞有抑制增殖的作用.结论 成功构建了人hBAFF-R-Fc真核表达载体,并使有生物学活性的hBAFF-R-Fc蛋白在CHO细胞上获得了稳定表达.为进一步研究该蛋白在狼疮性肾炎等自身免疫性疾病治疗中的作用奠定了基础.     

人分泌型白细胞介素-16基因的克隆及其原核表达

目的:克隆人分泌型IL-6 cDNA,构建IL-16的原核表达质粒,并观察其在大肠杆菌中的表达.方法:采用PCR技术从健康成人外周血单个核细胞(PBMC)总cDNA文库中扩增人分泌型IL-16 DNA片段;PCR产物分离纯化后,将其克隆至pUC18-T载体中,经PCR、酶切鉴定及DNA测序确证后,将该基因定向插入原核表达载体pMAL-C2,获得重组质粒pMAL-IL-16,然后将其转化至E.coli DH5α,经IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE及Western blot法鉴定表达产物.结果:获得了编码人分泌型IL-16的cDNA,经测序证明其长度为393 bp,编码130个氨基酸;构建了IL-16原核表达载体,并应用E.coli DH5α表达,得到1个相对分子质量(Mr)约56000的IL-16重组融合蛋白,与理论大小相符,且经SDS-PAGE及Western blot法验证.表明人分泌型IL-16原核表达载体构建并表达成功.结论:本实验成功克隆了人分泌型IL-16 cDNA,构建了IL-16原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达,为IL-16的纯化奠定了基础.     

小鼠4-1BB-Fc分子的真核表达及其体外抑制T细胞增殖的效应

目的 克隆并构建含小鼠4-1BB胞外段和人IgG Fc融合基因的真核表达质粒，表达具有生物学活性的4-1BB-Fc融合蛋白，初步探讨其体外生物学效应。方法 借助RT-PCR技术，从小鼠脾脏总FLNA中扩增4-1BB全长编码基因，并导入克隆载体pGEM-T Easy。经测序证实，用PCR扩增其膜外区cDNA，酶切后与hIgG1 Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3．1中。应用脂质体将重组子pcDNA3．1-4-1BB-Fc转染COS-7及CHO细胞，经G418筛选，获得稳定表达4-1BB-Fc融合蛋白的CHO细胞株。双抗体夹心ELISA检测融合蛋白表达，经蛋白A亲和层析纯化，借助免疫印迹进行鉴定。应用FACS检测融合蛋白与DC细胞系DC2．4表面4-1BBL结合情况。采用MTT及CFSE（羧基荧光素乙酰乙酸）标记法检测4-1BB-Fc融合蛋白对同种异基因小鼠T细胞增殖的抑制作用。结果 经测序证实，所克隆和构建的小鼠4-1BB-Fc cDNA阅读框及连接部位序列正确；ELISA与免疫印迹证实4-1BB-Fc蛋白的表达及其对T细胞增殖具有明显抑制作用。结论 成功构建4-1BB-Fc融合基因并获稳定表达，可望用于探讨4-1BB参与移植排斥的作用及其机制。并为研究4-1BB-Fc的其他生物学作用奠定初步基础。     

hdll1~(ext)-Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 :构建人dll1ext(humandelta like1extracellularregion) Fc融合蛋白的真核表达载体pEF BOSneo hdll1ext Fc,并在COS 7细胞中进行表达。方法 :从人脑cDNA文库中PCR扩增人delta like1胞外段 ,通过DNA重组构建真核表达载体 pEF BOSneo hdll1ext Fc。瞬时转染COS 7细胞 ,应用RT PCR、细胞免疫荧光技术和双抗体夹心ELISA ,检测融合蛋白的表达。结果 :成功地构建了真核表达载体 pEF BOSneo hdll1ext Fc。以重组载体转染COS 7细胞后 ,RT PCR结果显示delta like1胞外段与IgG1Fc在mRNA水平正确拼接 ;细胞免疫荧光染色呈阳性反应 ;夹心ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论 :成功地扩增了人delta like1胞外段 ,构建了 pEF BOSneo hdll1ext Fc真核表达载体 ,并在COS 7细胞中获得表达 ,为下一步研究奠定了基础     

hdll1ext-Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人dlll^ext(human delta-likel extraeellular region)-Fe融合蛋白的真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc，并在COS-7细胞中进行表达。方法：从人脑cDNA文库中PCR扩增人delta-likel胞外段，通过DNA重组构建真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fe。瞬时转染COS-7细胞，应用RT-PCR、细胞免疫荧光技术和双抗体夹心ELISA，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc。以重组载体转染COS-7细胞后，RT-PCR结果显示delta-likel胞外段与IgG1 Fe在mRNA水平正确拼接；细胞免疫荧光染色呈阳性反应；夹心ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地扩增了人delta-likel胞外段，构建了pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc真核表达载体，并在COS-7细胞中获得表达，为下一步研究奠定了基础。     

人PD-1-Fc融合分子的构建及其在CHO细胞中的表达与鉴定

目的利用基因工程手段构建hPD1Fc重组cDNA,用真核表达系统制备有活性的hPD1Fc融合蛋白。方法PCR方法扩增编码hPD1膜外区的cDNA序列,将其与人IgG1Fc和pcDNA3.1( )片段连接,构建成hPD1Fc重组表达载体。用脂质体法转染CHO细胞,夹心ELISA法检测上清液中融合蛋白hPD1Fc的表达,经ProteinA亲合层析纯化,SDSPAGE、免疫印迹鉴定表达产物。结果PCR扩增得到编码人PD1全长的288aa编码基因片段,将其膜外区167aa的编码序列与hIgG1Fc的cDNA片段一起连接并插入pcDNA3.1( )表达质粒。重组质粒转染CHO细胞后,夹心ELISA法检测显示培养上清液中有hPD1Fc蛋白表达。纯化后的hPD1Fc蛋白经SDSPAGE和免疫印迹鉴定其相对分子质量约42800,与理论预测值相符。结论成功构建了hPD1Fc重组表达载体,利用哺乳动物细胞CHO表达出有活性的hPD1Fc融合蛋白,为进一步研究PD1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。     

人胰岛素样生长因子1基因转染脂肪源性干细胞的效应

背景：人胰岛素样生长因子1基因对脂肪源性干细胞的增殖和分化也可能会产生有效作用。 目的：验证人胰岛素样生长因子1基因转染对体外培养的脂肪源性干细胞的效应。 方法：构建含人胰岛素样生长因子1基因的双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1,利用阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导转染体外培养的人脂肪源性干细胞。观察基因转染后细胞增殖及形态的变化,倒置荧光显微镜观测标记基因增强绿色荧光蛋白的表达并计算转染效率,酶联免疫吸附试验检测培养上清中人胰岛素样生长因子1的浓度,免疫组织化学染色及RT-PCR检测人胰岛素样生长因子1的表达,流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化。 结果与结论：测序及酶切证实真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1构建正确。体外培养的脂肪源性干细胞为多种形态并存,转染后6 h检测到有EGFP的表达,至60 h达到高峰,转染效率为(16±3)%。细胞上清中人胰岛素样生长因子1的浓度在60 h达到22.65 μg/L。免疫组织化学染色及RT-PCR均检测到人胰岛素样生长因子1的表达。转染后的细胞分裂增殖加快,细胞群体倍增时间缩短,S期细胞比例增多。证实人胰岛素样生长因子1基因可有效转染脂肪源性干细胞并表达人胰岛素样生长因子1蛋白质,同时可促进细胞增殖。     

转人B7.2基因的L929细胞对T细胞增殖和分泌IL-10的作用

应用RT-PCR法,从由LPS刺激的人的DC细胞中抽提mRNA,扩增获得编码人B7.2分子的cDNA,并将其克隆到PMD18-T载体,经PCR、酶切及测序进行鉴定确证,进而构建PEGZ-term-B7.2的真核表达载体。脂质体法共转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的上清感染L929细胞,经Zeocin筛选,建立稳定表达人B7.2分子的L929基因转染细胞株。并证实了B7.2基因转染细胞能有效地促进T细胞的体外增殖和促进IL-10的分泌。     

人LIGHT基因转染细胞株的建立及其对T细胞协同刺激作用的研究

建立人协同刺激分子LIGHT的基因转染细胞株,探讨其体外对T细胞活化与增殖的协同刺激作用。采用RT-PCR法从活化的人外周血T细胞中克隆人LIGHT编码区全长基因,经EcoR I和BamH I双酶切后插入pIRES2-EGFP真核表达载体构建成pIRES2-EGFP-LIGHT重组子,脂质体法以重组质粒pIRES2-EGFP-LIGHT转染鼠L929细胞。经G418长期加压筛选,免疫荧光标记和流式细胞术分析LIGHT分子在基因转染的L929细胞膜上的表达,MTT法和酶联免疫吸附测定法(ELISA)探讨获得的基因转染细胞L929/LIGHT体外对T淋巴细胞增殖与活化的影响。结果:流式细胞术检测转基因L929/LIGHT细胞膜上能稳定高表达人LIGHT分子。体外细胞共培养试验表明,与未转染LIGHT基因的L929/mock细胞相比,L929/LIGHT能显著地促进抗人CD3单抗(mAb)刺激的T细胞增殖;同时L929/LIGHT亦能明显促进T细胞对IL-2、IFN-γ和IL-10的分泌。建立了稳定高表达人LIGHT分子的基因转染细胞株,LIGHT介导的信号在体外对T细胞增殖和相关细胞因子的分泌具有显著地促进作用。     

谷氨酸脱羧酶65片段与IL－10双基因真核表达载体的构建与鉴定

 目的 优化以往构建的以预防 1 型糖尿病为目的的全长谷氨酸脱羧酶（GAD）65 DNA疫苗，尝试构建GAD 65片段与IL-10双基因真核表达载体。方法 从GAD65质粒中扩增出GAD190-315片段和GAD490-570片段的cDNA，以overlap PCR法将之分别与hIL-2信号肽cDNA拼接，得到SGAD190-315、SGAD490-570融合基因。以p43.2-mIL-10质粒为模板，用PCR方法扩增出IL-10基因。将SGAD190-315、SGAD490-570融合基因分别与IL-10基因依次克隆入双启动子真核表达载体pBudCE4.1中，构建出2种双基因重组真核表达载体pBud-SGAD190-315/IL-10和pBud-SGAD490-570/IL-10。2种重组真核表达载体经测序鉴定正确后，用脂质体介导的方法转染COS-7细胞，转染后48和72 h以蛋白质印迹法检测细胞裂解产物及上清液中SGAD190-315和SGAD490-570融合基因的表达，ELISA方法检测细胞上清液中IL-10的表达。结果　核酸序列测定表明克隆的SGAD190-315、SGAD490-570融合基因和IL-10基因序列与报告序列一致。蛋白质印迹法和ELISA方法均检测到SGAD190-315/IL-10和SGAD490-570/IL-10重组真核表达载体在COS-7细胞中的表达。结论　成功构建了2种GAD65片段与IL-10双基因真核表达载体，为1型糖尿病的基因疫苗预防研究提供了实验基础。