肿瘤坏死因子α和血管紧张素Ⅱ诱导血管内皮细胞组织因子基因表达及其机制的研究

目的:研究肿瘤坏死因子α(TNFα)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对内皮细胞组织因子(TF)表达的影响,并探讨TF基因5’上游序列在TNFα、AngⅡ诱导内皮细胞该基因转录中的调控作用。方法:应用细胞原位杂交技术检测TFmRNA水平。采用基因重组技术构建含有人TF基因不同上游序列荧光素酶报告基因质粒,经脂质体法转染内皮细胞,检测及分析报告基因活性。结果:TNFα和AngⅡ均可以诱导内皮细胞TFmRNA表达增强。在TF基因上游序列-244/+121bp存在时,TNFα、AngⅡ均可使转染内皮细胞荧光素酶表达量明显增加,而在-111/+121bp存在时TNFα、AngⅡ组与对照组荧光素酶表达量均无明显差异,而且较-244/+121bp存在时荧光素酶表达量明显降低。结论:TF基因上游-244/-112bp序列的存在对TNFα、AngⅡ诱导内皮细胞TF基因表达起重要的调节作用。     

肿瘤坏死因子α和血管紧张素Ⅱ诱导血管内皮细胞组织因子基因表达及其机制的研究

目的；研究肿瘤坏死因子α（TNFα），血管紧张素Ⅱ（AngⅡ)对内皮细胞组织因子（TF）表达的影响，并探讨TF基因5‘上游序列在TNFα，AngⅡ诱导内皮细胞该基因转录中的调控作用。方法：应用细胞原位杂交技术检测TF mRNA水平。采用基因重组技术构建含有人TF基因不同上游序列荧光毒酶报告基因质粒，经脂质体法转染内皮细胞，检测及分析报告基因活性。结果：TNFα和AngⅡ均可以诱导内皮细胞TF mRNA的表达增强。在TF基因上游序列－244／＋121bp存在时，TNFα，AngⅡ均可使转梁内皮细胞荧光素酶表达量明显增加，而在－111／＋121bp存在时TNFα，AngⅡ组与对照组荧光素酶表达量均无明显差异，而且较－244／＋121bp存在时荧光素酶表达量明显降低。结论：TF基因上游－244／－112bp序列的存在对TNFα，AngⅡ诱导内皮细胞TF基因表达起重要的调节作用。     

血小板源生长因子B链基因上游序列HMGI结合区的初步鉴定

目的：观察转录结构因子高迁移率蛋白I(HMGI)与血小板源生长因子B链(PDGF-B)基因上游序列的结合并初步鉴定HMGI的结合序列。 方法： 应用凝胶迁移率改变法（EMSA）观察重组人HMGI蛋白与PDGF-B基因上游-1 758/+43 bp片段的结合，并逐步确定与其结合的AT富含序列。 结果： 重组人HMGI蛋白能较特异地与PDGF-B链基因上游-1 758/+43 bp片段结合，分离到的两个HMGI结合片段，-1 393/-1 181 bp和-190/+43 bp，均含有AT富含序列TTTATAAA（-1 333/-1 326 bp，-1 314/-1 307 bp和-30/23 bp）。HMGI能与含TTTATAAA的合成寡核苷酸结合，并能促进转录因子NF-κB与拼接于旁侧的PDGF-B基因的切应力反应元件结合。 结论： HMGI在体外能与PDGF-B链基因上游的TTTATAAA序列结合，可能参与PDGF-B基因的转录调控。     

丹参提取物单体对肿瘤坏死因子诱导内皮细胞组织因子表达的干预作用

研究丹参提取物单体(764—3)对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF—α)诱导人血管内皮细胞(human vascular endothelial cell，HUVEC)组织因子(tissue factor，TF)基因表达的干预作用，及其对单个内皮细胞胞内游离钙([Ca^2 ]i)水平的影响，以探讨764．3对心血管血栓栓塞性疾病防治的可能机制。进行人脐静脉原代内皮细胞、ECV304细胞株的培养。采用限制性内切酶法，构建含有人TF基因不同上游调控序列的荧光素酶报告基因质粒，经脂质体法转染内皮细胞，用TNF—α及764-3处理内皮细胞，测定细胞裂解物荧光素酶及β半乳糖苷酶活性。以Fluo3／AM为荧光指示剂，用激光扫描共聚焦显像系统观测[Ca^2 ]i的改变。结果发现在TF基因上游序列-244／ 121bp存在下，TNFα可使转染内皮细胞荧光素酶表达量比对照组明显增加，764-3使这种增加有所降低。而-111／ 121bp存在时，TNF—α组与对照组荧光素酶表达量无明显差异，均比-244／ 121bp存在时明显降低，此时，764-3并未引起荧光素酶表达量明显改变。激光扫描共聚焦显像显示，TNF—α可引起人内皮细胞[Ca^2 ]i持续缓慢升高，加入7643后[Ca^2 ]i迅速大幅度降低，逐渐恢复到基线水平。提示764—3可抑制TNF—α诱导的人内皮细胞TF基因表达增强，这种作用依赖于该基因上游序列-244／ 121bp的存在，推测胞内游离钙离子可能参与此抑制作用。     

顺式调控元件NF-κB在尼古丁诱导ICAM-1表达中的作用

目的: 研究5' 上游序列在尼古丁诱导细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因转录调控中的作用。 方法: 首先采用分子克隆技术构建实验所需的DNA片段,然后采用真核细胞转染技术将重组DNA片段与内参照质粒一起转染体外培养的内皮细胞并检测尼古丁刺激的转染细胞荧光素酶的相对活性。 结果: 成功构建了6种含有不同长度ICAM-1基因启动子序列以及启动子中NF-κB 和 Sp-1 位点突变序列的荧光素酶报告基因质粒。与对照组相比尼古丁可促进含有启动子序列-579 bp(pGL3E-579/+36)(P＜0.05), -230 bp (pGL3E-230/+36) (P＜0.05) 以及启动子 Sp-1 位点突变体(pGL3E-Sp-1-MU) (P＜0.05)的荧光素酶基因表达,而下游NF-κB位点的删切重组体(pGL3E-134/+36)和含有NF-κB位点突变体(pGL3E- NF-κB -MU)的重组荧光素酶报告基因质粒在尼古丁诱导下与对照组相比荧光素酶表达量无明显差异。结论: ICAM-1基因启动子顺式作用元件下游NF-κB位点在尼古丁诱导ICAM-1基因表达机制中可能起重要作用。     

5‘上游序列对TNFα诱导内皮细胞血小板源生长因子—B链基因…

目的和方法：为探讨人血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）－Ｂ链基因５‘上游序列在ＴＮＦα诱导内皮细胞该基因转录中的调控作用,本研究将构建的一系列含人ＰＤＧＦ－Ｂ链基因不同上游序列荧光素酶报告基因质粒,与内参照质粒ｐＳＶ－β－Ｇａｌ共转染培养的人脐静脉内皮细胞,分别检测了不同浓度和不同持续时间ＴＮＦα作用下转染内皮细胞荧光素酶比活性,观察了５’上游序列的定向删切对ＴＮＦα诱导内皮细胞ＰＤＧＦ－Ｂ链基因转录的     

脂联素对HepG2细胞中脂肪酸 合成酶及激素敏感性脂肪酶基因启动子活性的影响

目的构建含人脂肪酸合成酶(FAS)及激素敏感性脂肪酶(HSL)基因启动子的荧光素酶报告基因表达质粒,探究脂联素对人肝癌细胞系HepG2中FAS及HSL基因启动子活性的影响。方法扩增人FAS及HSL启动子序列-622～+3 bp片段与-697～+53 bp片段,构建含人FAS及HSL启动子的pGL3-hFAS625-Luc(hFAS 625-Luc)与pGL3-hHSL750-Luc(hHSL 750-Luc)荧光素酶报告基因表达质粒。脂质体瞬时转染HepG2细胞,观察0.5～10.0μg/mL脂联素作用24 h或者5μg/mL脂联素作用2～32 h细胞中荧光素酶活性的变化。结果 hFAS 625-Luc与hHSL 750-Luc荧光素酶表达质粒均能在HepG2细胞中良好表达。1.0～10.0μg/mL脂联素作用24 h能剂量依赖性地促进转染hFAS 625-Luc及hHSL 750-Luc质粒的HepG2细胞中荧光素酶的表达,最高分别达到对照组的1.76倍(P0.01)和1.37倍(P0.01)。5μg/mL脂联素作用于转染hFAS 625-Luc质粒的HepG2细胞4 h和8 h能够促进荧光素酶的表达(P0.01),作用16 h和32 h则抑制荧光素酶的表达(P0.01);而脂联素对转染hHSL 750-Luc质粒HepG2细胞作用不同时间(2～32 h)均能促进荧光素酶的表达,最高为对照组的1.37倍(P0.01)。结论成功构建含人FAS与HSL启动子荧光素酶报告基因质粒。脂联素能够剂量依赖性地促进HepG2细胞中FAS及HSL启动子活性。脂联素作对FAS启动子的活性影响与作用时间有关,而对HSL启动子活性的影响一直表现为促进作用。     

IFN-α诱导HuH7细胞固有免疫分子APOBEC3G的表达

目的了解IFN-α对HuH7细胞固有免疫分子APOBEC3G表达的影响及其机制。方法HuH7细胞给予不同浓度的IFN-α(0 U/ml、100U/ml、400U/ml、800U/ml and 1200U/ml)刺激,10h后提取细胞总RNA,RT-PCR和实时定量RT-PCR检测HuH7细胞内APOBEC3G的mRNA水平变化,Western blot分析APOBEC3G蛋白水平的表达;分别构建不同长度的含有IRF-E(IFN regulatory factor element)位点的APOBEC3G起始密码上游序列报告质粒、不含IRF-E和IRF-E位点突变的虫荧光素酶报告质粒,报告基因分析IFN-α刺激后APOBEC3G起始密码上游IPF-E位点对APOBEC3G表达的影响。结果IFN-α上调HuH7细胞APOBEC3G mRNA和蛋白水平的表达,并具有剂量依赖的效应。序列分析发现APOBEC3G起始密码上游的-298～-283和-57～-47位碱基分别存在IRF-E和ISRE(IFN stimulated re- sponse element)序列。报告基因分析结果显示,干扰素使含有IRF-E序列的APOBEC3G启动子报告质粒的虫荧光素酶的活性增加6～8倍,而不含IRF-E序列和IRF-E位点突变的报告质粒的虫荧光素酶活性在干扰素刺激后几乎没有变化。结论IFN-α可通过IRF-E位点上调APOBEC3G mRNA和蛋白水平的表达,从而发挥抗病毒效应。     

NOX4报告基因重组质粒的构建及表达调控初探

目的：构建NOx4荧光素酶报告基因质粒载体,探讨NOX4基因表达调控机制。方法：以细胞基因组DNA为模板作,采用PCR扩增NOX4基因上游调控序列（533bp）,插入质粒DGL3-basic载体,构建重组质粒pGL3-NOX4,重组质粒经酶切和测序鉴定。将pGL3-NOX4转染A549细胞,通过细胞因子刺激观察报告基因表达水平。结果：酶切及测序证实NOX4报告基因质粒构建成功。转染报告基因的A549细胞以细胞因子刺激,结果显示NOx4表达增强。结论：成功构建了NOX4荧光素酶报告基因质粒载体,为进一步研究NOX4基因的表达规律及生理功能奠定了基础。     

mmLDL对人脐静脉内皮细胞PAI-1表达的影响及其转录调控机制

目的:探讨弱氧化修饰低密度脂蛋白(mmLDL)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)PAI-1活性和mRNA表达的影响及其转录调控机制。方法:人脐静脉内皮细胞的培养和鉴定。用发色底物法测定PAI-1活性。Northern印迹分析法检测PAI-1mRNA的水平。采用基因重组技术构建含不同长度PAI-1 5'上游序列的荧光素酶报告基因质粒, 瞬时转染进入内皮细胞, 并检测荧光素酶的表达情况。 利用PCR和测序技术, 对构建质粒上AP-1元件进行定点突变。Western blot印迹杂交检测内皮细胞核内激活蛋白-1(AP-1)蛋白水平。结果:50 mg/L mmLDL诱导HUVECs PAI-1活性和mRNA表达量明显增高, 同时提高核内AP-1蛋白水平。mmLDL显著诱导构建质粒pGL3-PAI-1-1509/+90和pGL3-PAI-1-823/+90的荧光素酶活性, 但对质粒pGL3-PAI-1-553/+90和pGL3-PAI-1-47/+90诱导作用不明显。当PAI-1 5'上游序列的3个AP-1元件突变后, mmLDL的诱导作用明显降低。结论:(1)mmLDL增强血管内皮细胞 PAI-1活性与mRNA表达;(2)PAI-1活性提高与其mRNA表达增加呈正相关;(3) PAI－1 5'上游序列中3个AP-1元件在mmLDL对PAI－1诱导中具有重要调控作用。     

细胞因子对T细胞生长激素基因表达的影响

目的 探讨各种细胞因子对T细胞生长激素（GH）基因表达的影响。方法 构建含人GH调控序列的荧光素酶报告基因质粒pGL2-GH-luc，然后转染入T淋巴细胞系Jurkat E6-1细胞中，在培养液中分别加入各种细胞因子。结果 生理浓度的IL－1β，TNF－β和IFN－γ，对Jurkat细胞中荧光素酶的表达具有抑制作用（P＜0．05）。结论 细胞因子参与了调节淋巴细胞GH基因的表达。     

含人PDGF—B链基因不同上游序列报告基因的构建和表达

本研究构建了含人ＰＤＧＦＢ链基因不同上游序列的荧光素酶报告基因ｐＳＩＳ－１７５８／＋４３Ｌｕｃ和ｐＳＩＳ－４０２／＋４３Ｌｕｃ，经与ｐＳＶβＧａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅＣｏｎｔｒｏｌＶｅｃｔｏｒ共转染血管内皮细胞后，测定了基础水平和ＴＮＦα作用下细胞裂解液中的荧光素酶和β半乳糖苷酶活性。结果表明：在ＴＮＦα作用下，ＰＤＧＦＢ链基因上游序列上调内皮细胞荧光素酶的表达，其主要调控区可能位于－１７５８／－４０３ｂｐ之间。     

鼻咽癌细胞中ezrin基因启动子上游序列转录调控特性的研究

目的:研究鼻咽癌细胞中ezrin基因启动子上游序列的转录调控特性。方法:构建一系列携带ezrin基因-1541/-706序列的报告基因表达载体,ezrin基因-1541/-706序列以正向和反向分别连接至不含启动子的报告基因上游、ezrin启动子上游、SV40启动子上游、ezrin启动子或SV40启动子控制的报告基因下游,将质粒转染CNE2细胞,检测荧光素酶活性。结果:CNE2细胞中,当-1541/-706序列正向位于报告基因上游时表现出启动子活性,其转录激活作用约为ezrin启动子的50%;反向连接时无启动子活性。而且,当-1541/-706序列正向位于ezrin启动子或SV40启动子上游时,显著提高荧光素酶表达;当反向位于启动子下游、正向或反向位于启动子控制的报告基因下游时,转录增强作用消失。结论:CNE2细胞中ezrin基因启动子上游序列具有转录激活和转录增强作用,这种作用具有DNA序列位置和方向依赖性。     

载脂蛋白AⅠ基因启动子和内含子1中的单核苷酸多态性对其表达的影响

目的构建含ApoAⅠ基因调控区和荧光素酶报告基因的真核表达载体，探讨ApoAⅠ基因启动子区域-75bp G→A置换及第1内含子＋83bp C→T置换对ApoAⅠ表达的影响。方法采用PCR方法扩增人染色体中含ApoAⅠ基因-145～＋289bp的DNA片段，筛选出含ApoAⅠAA／CC基因型（-75bp变异，＋83bp无变异）、GG／TT基因型（-75bp无变异，＋83bp变异）及GG／CC（-75bp和＋83bp均无变异）的DNA片段，构建含以上3个基因片段的pUC重组载体，经SacⅠ和BglⅡ酶切后，再将不同的DNA片段连接到含荧光素酶报告基因的pGL2载体中，获得多个重组克隆。采用阳离子脂质体转染法将携带萤火虫荧光素酶报告基因的重组质粒和携带海肾荧光素酶报告基因的对照质粒共转染HepG2细胞，经48h培养，用化学发光法测定细胞裂解液中荧光素酶的活性，以反映ApoAⅠ的表达水平。结果质粒重组获得3个pGL2-ApoAⅠ-L（-2500～＋289bp）长片段质粒和3个pGL2-ApoAⅠ-S（-145～＋289bp）短片段质粒，分别含AA／CC、GG／TT及GG／CC3种基因型。荧光素酶报告基因活性显示：ApoAⅠAA／CC或GG／TT基因型携带者引起荧光素酶相对活性明显低于GG／CC基因型者。结论基因启动子ApoAⅠ-75bp G→A置换和＋83bp C→T置换对ApoAⅠ转录活性起抑制作用，这可能是-75A和＋83T等位基因携带者高密度脂蛋白血浆水平降低的原因。     

新基因AngRem104对纤粘连蛋白基因上游序列的调控分析

目的：探讨新基因AngRem104对纤粘连蛋白（FN）基因启动子转录活性的影响，为揭示AngRem104对FN表达的调控机制提供线索。 方法： 构建了FN基因上游调控序列的系列缺失体-荧光素酶（luciferase）报告基因，瞬时转染人系膜细胞，检测报告基因的活性变化。 结果： FN507-pGL3+正义AngRem104质粒转染组和FN1280-pGL3+正义AngRem104质粒转染组的luciferase相对活性较FN122-pGL3+正义AngRem104质粒转染组luciferase相对活性明显升高（P＜0.01）。 结论： 在FN基因上游调控序列中-122到-507之间存在新基因AngRem104的正反应调控区。     

CD226基因5''''上游调控序列研究

目的：研究CD226基因5’上游调控序列对CD226基因表达调控的影响。方法：通过基因克隆的方法将CD226基因5’上游调控序列，克隆到荧光素酶报告基因载体中（pGL3-basic），用脂质体转染Jurkat细胞，48小时后检测荧光素酶活性。结果：CD226基因存在两个启动子P1和P2，分别位于与-843--319bp和＋1-＋181bp，PMA可以上调P1的启动子活性，对P2有一定的抑制作用；A23187均可以上调两个启动子的活性，但对P2的作用更为明显。结论：CD226基因存在两个启动子，其活性受到PMA和A23187的调控，并呈与蛋白水平表达调控相类似的模式。     

NOX1基因荧光素酶报告基因系统的建立

目的：对炎症细胞因子TNF-α及IFN-γ刺激下,人NOX1基因的表达调控进行初步分析。方法：将NOX1基因5′-端上游序列连接到无启动子的PGL3-BASIC质粒,构建了PGL3-BASIC／NOX1报告质粒。PGL3-BASIC／NOX1质粒转染A549细胞,用TNF-α、IFN-γ刺激12h,双荧光素酶报告基因系统检测基因表达情况。结果：克隆的NOX1片段具有较强的启动子活性,在TNF-α和IFN-γ共同刺激下,转染报告基因的A549细胞萤光素酶活性与对照相比有明显的增高（约4．3倍）。分析显示NOX1基因5′端上游序列片段含有NF-KB结合位点,提示细胞因子刺激的荧光素酶表达增强可能与NF-KB位点激活相关。结论：NOX1基因表达水平明显受到炎症细胞因子的调控,提示该基因可能参与机体免疫防御（特别是上皮细胞免疫防御）,值得进行深入研究。     

SPA基因启动子的克隆及转录靶向活性分析

目的：克隆大鼠肺表面活性蛋白A（SPA）基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性，为进一步研究SPA 基因的表达调控机制和探讨靶向性基因治疗奠定基础。方法:①从GenBank中获取大鼠SPA 基因序列，对其上游基因组序列进行计算机生物信息学分析，推断其上游序列约163bp的区域具有启动子功能。②利用PCR技术扩增SPA 基因上游启动子序列,将其亚克隆入pGL3-basic 中,构建pGL3-SPA 质粒，将其亚克隆于pGL3-control 中，构建pGL3-SPA-enhancer 质粒。③将构建pGL3-SPA质粒、pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-control质粒和pGL3-basic 质粒分别与内参质粒pRL-TK共转染入A549细胞和H441细胞, 用双荧光素酶报告系统检测该质粒在两种细胞中的荧光素酶活性表达。 结果:酶切及测序结果均证实成功克隆了SPA基因启动子序列,并已将该序列正确插入到荧光素酶报告基因系列载体中。重组的pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-SPA质粒转染H441 细胞后可以检测到荧光素酶的高表达。结论:成功构建了含有SPA 基因启动子序列的荧光素酶基因报告系统,证实了它在高表达SPA蛋白的细胞中有较高的转录活性， 为下一步研究SPA 基因功能及其转录调控以及探讨基因治疗的靶向性奠定了基础。     

CKLF基因与CKLFSF1基因间的顺式调控元件

目的：探讨CKLF基因与CKLFSF1基因间序列(CCS)的调控作用。方法：运用PCR技术扩增CCS，并将此片段插入含有荧光素酶(luriferase)报告基因载体pGL3-basic，以及pGL3-SV40启动子中，构建受其调控的荧光素酶报告基因载体。应用脂质体介导基因转染技术，将4种重组质粒转染Hela细胞，进行瞬时表达分析。结果：在pGL3-basic和pGL3-basic-CCS质粒中的报告基因luciferase均无表达，但将CCS片段插入至promoter上游后，荧光素酶活性增加近1倍。结论：CKLF与CKLFSF1基因间的序列不具有启动子活性，但该序列中却可能存在调控其下游基因表达的顺式增强子元件。     

活化型肝星状细胞中miRNA-193下调α-平滑肌肌动蛋白的表达

目的:研究活化型肝星状细胞(HSC)中miRNA-193(miR 193)下调肝纤维化相关基因的表达。方法:将大鼠miR-193的前体序列(pre-miR-193)克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和DNA测序鉴定,获得质粒pcDNA3.1-miR-193;通过脂质体转染法将质粒转染到大鼠的活化型肝星状细胞(HSC-T6)中,采用荧光素酶报告基因分析法和免疫印迹检测肝纤维相关基因的表达。结果:构建的真核表达载体pcDNA3.1-miR-193经酶切鉴定及DNA测序显示,目的片段的大小与预期结果一致;荧光素酶报告基因分析法和免疫印迹检测显示,重组质粒转染到活化型H-SC-T6中后,肝纤维化相关基因的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达呈明显下降趋势,而胶原蛋白Ⅰα1和Ⅰα2的下调作用不明显。结论:miR-193能抑制活化型肝星状细胞中肝纤维化相关基囚α-SMA的表达。