p53基因治疗在恶性淋巴瘤治疗中的应用

多数恶性淋巴瘤患者有突变的p53基因过表达,并且实验表明p53基因与恶性淋巴瘤的发生发展有密切关系.因此,以重组腺病毒为载体将正常p53基因导入肿瘤细胞中并使其稳定表达将会对恶性淋巴瘤起到治疗作用.这已经在基础研究中得到了证实.     

外源p53对人肺癌细胞生长的抑制

目的　观察外源性野生型p53对有p53基因突变的人肺癌细胞系生长的影响。方法　用PCR SSCP及DNA测序 ,选择p53突变的人肺巨细胞癌系 80 1 D。构建野生型p53表达质粒PZiP p53。用基因枪介导外源基因。经G41 8筛选得到转染细胞系 80 1 D p53。用PCR检测外源基因 ,观察转染细胞恶性生长的变化。结果　转染细胞系 80 1 D p53体外长期传代有外源性p53基因存在 ,转染细胞生长明显受到抑制 ,集落形成抑制率达 96% ,裸鼠异种移植致瘤性降低 ,肿瘤生长明显缓慢。结论　外源性野生型p53经基因枪导入有p53基因突变的人肺癌细胞后可长期存在于转染细胞中 ,且明显抑制所转染的癌细胞的恶性生长。     

人p53/GFP融合基因在高转移人肝癌细胞中的表达与定位

通过将野生型p53(wt-p53)基因与荧光蛋白(GFP)基因的融合,导入高转移肝癌细胞中,并利用荧光蛋白的示踪作用,观察p53基因在肝癌细胞中的正常表达及定位情况.根据野生型p53基因的编码顺序,PCR方法扩增突变的wt-p53基因,使其3’端的终止密码TGA突变为TGG;用基因重组技术将其与GFP融合,通过真核表达质粒-脂质体介导,导入人高转移肝癌细胞系MHCC97(PCR检测有p53基因突变)中.用荧光显微镜观察p53的表达情况.实验表明,     

p53基因245位点突变对非小细胞肺癌细胞H1299的影响

背景与目的:p53基因突变是肺腺癌发生中的常见的分子生物学事件,第245位点突变为其突变热点之一,因此研究p53基因第245位点突变可能为肺腺痛的诊断、治疗提供一定的理论基础.本研究旨在研究肺癌常见的245位点突变对p53缺失的人肺腺癌细胞系H1299的影响.方法:应用流式细胞术观察脂质体瞬时转染p53基因第245突变体(G245V)对细胞凋亡的影响,同时用稳定转染观察克隆形成率和生长曲线的不同.结果:转染G245V突变体的H1299细胞凋亡平均数低于转染野生型p53基因的细胞,差异有统计学意义(P<0.001);大中克隆形成数量比导入野生型p53基因的细胞大中克隆形成数量明显增多,差异有统计学意义(P<0.05);细胞的生长速度也明显加快.结论:p53基因第245位点发生突变后基本丧失了野生型p53的功能,是肿瘤细胞增殖的原因之一.     

逆转录病毒介导的肿瘤坏死因子基因转染的肿瘤细胞克隆株的建立及其生物学活性的观察

人p53基因是一种抑癌基因．p53蛋白作为一种细胞增殖的负调节目子．调控细胞的生长和分化，维持基因组DNA的稳定．其突变．缺失或与细胞、病毒、肿瘤蛋白结合所致的p53失功能，在恶性肿瘤发生发展中起着非常重要的作用。为了进一步探讨野生型p53基因的抗肿瘤特胜．我们采用分子克隆方法将人野生型p53基因(WT—p53)cDNA全长正向插入到哺乳动物表达载体(pREP9)的BamHI位点，构建了pREP9-p53重组体，用电穿孔方法将其导入有p53基因突变的人肠癌SW1116细胞．通过标记基固Neo筛选带外源p53基因的G418抗药胜克隆，以观察抗药性克隆数量．同时对G418抗药性细胞的生长速度及细胞增殖周期进行观察：结果表明，导入WT-p53基因能使肠癌SW1116细胞的G418抗药性克隆形成减少，细胞生长速度较对照细胞明显减慢．细胞增殖周期G1期增加、S期下降。这些结果证明人野生型D53基因能抑制肠癌细胞的生长。本研究为大肠癌WT-p53实验性基因治疗提供了理论依据，说明基于恢复p53肿瘤抑制基因功能的基因治疗在治疗结、直肠癌方面有着广阔的应用前景。     

野生型p53基因与双脱水二乙酰卫矛醇联合诱导肝癌HLE细胞凋亡的研究

背景和目的：p53基因是抑癌基因,研究发现在人类肿瘤中p53基因常发生突变。实验证明野生型p53基因不但抑制肿瘤细胞增殖,而且诱导肿瘤细胞凋亡。但是,单独应用野生型p53基因诱导肿瘤细胞凋亡的作用不很明显。因此,野生型p53基因与药物的联合作用来提高肿瘤细胞凋亡率是目前对肿瘤研究的一新领域。本实验通过转染野生型p53基因联合双脱水二乙酰卫矛醇(1,2：5,6-dianhydro-3,4-diacetylgalactitol,DADAG)作用于肝癌细胞株HLE,研究联合诱导肿瘤细胞的凋亡作用。方法：野生型p53基因通过脂质体Lipofectamine介导转染人肝癌细胞株HLE,同时加入DADAG。96h后,用流式细胞仪、DNA电泳方法进行细胞凋亡分析。结果：流式细胞仪分析细胞凋亡结果：阴性对照组为1．4％、转染pUHD10-3组为3．5％、DADAG处理组为32．6％、转染pUHD10-3-p53组为43．4％、转染p53基因及DADAG处理组为74．6％。DNA电泳发现,转染p53基因及DADAG处理组有到DNA梯形条带。结论：野生型p53基因与DADAG均可诱导人肝癌细胞HLE发生凋亡,转染野生型p53基因与DADAG联合作用,有促进肝癌细胞凋亡的作用。     

Wip1基因在人脑胶质瘤组织中的表达及其与p53基因突变的相关性研究

背景与目的：野生型p53诱导的磷酸酶1（wild-type p53-induced phosphatase1,Wip1）是一种新发现的癌基因,其在多种肿瘤中存在过表达。本研究旨在探讨Wip1基因在脑胶质瘤组织中的表达及其与p53基因突变的相关性。方法：收集52例原发胶质瘤及8例脑外伤或脑出血后行内减压术的正常脑组织标本,采用实时荧光定量PCR（real-time fluorogentic quantitative,RFQ-PCR）法检测脑胶质瘤组织中Wip1mRNA的表达,Western blot法检测Wip1蛋白的表达,DNA直接测序法检测脑胶质瘤组织中p53基因的突变情况。统计学分析不同脑胶质瘤病理分级及p53的突变状态间Wip1的表达水平的差异。结果：52例脑胶质瘤中22例（42.3%）发生p53基因突变。Wip1 mRNA在高级别胶质瘤（Ⅲ～Ⅳ级）中的表达水平较低级别胶质瘤（Ⅰ～Ⅱ级）及正常脑组织中的表达要略高,但差异无统计学意义（P〈0.05）。Wip1基因在无p53基因突变的胶质瘤组织中的表达水平较p53基因突变组要高,差异有统计学意义（P=0.009）。Wip1在野生型p53的胶质瘤中存在选择性的过表达,Wip1在胶质瘤中的过表达与病理分级无明显相关,而与p53的突变状态有关。结论：Wip1基因在脑胶质瘤中存在选择性地过表达,其过表达与p53基因野生型状态相关,可能是胶质瘤恶性进展中除p53基因突变外的另一关键作用因素。     

p53基因治疗与放射治疗联合应用于肿瘤研究

野生型p53基因的导入不仅可诱导肿瘤细胞凋亡,而且还可以提高肿瘤细胞对放射线的敏感性,从而增强放射治疗对肿瘤细胞的杀伤作用,但其作用机制尚未完全明了。野生型p53基因和放射线的协同作用有助于提高肿瘤疗效,从而使针对p53基因的基因治疗和放射线联合治疗方案具有良好的应用前景。     

p53缺失和突变对人肺癌细胞系恶性表型影响的比较

目的 比较研究外源正义和反义p53对所转染细胞系恶性表型的影响。方法 构建正义和反义p53cDNA真核细胞表达载体pEGFP-p53(RS)和pEGFP-p53(AS)。用Lipofectin介导转染801D细胞。PCR检测外源p53和neo基因，荧光显微镜检查转染细胞绿荧光蛋白，免疫组化染色检测突变蛋白表达。比较pEGFP-p53(AS)-801D和pEGFP-p53(RS)-801D的集落形成试验和裸鼠移植试验，用流式细胞术分析细胞周期。结果 PCR检测出外源p53和neo基因存在于细胞，细胞可见绿色荧光，免疫组化检测示pEGFP-p53(AS)-801D突变蛋白呈阴性，母系为阳性，表明反义p53能封闭突变p53蛋白表达，pEGFP-p53（RS）-801D和pEGFP-p53(AS)801D细胞集落形成率和裸鼠移植成瘤性均降低，pEGFP-p53(RS)-801D更为明显。pEGFP-p53(AS)-801D细胞周期阻滞于G1期。结论 在同一细胞背景下，p53缺失比p53突变对恶性增殖起更重要的作用。外源野生型p53在肿瘤细胞中可恢复重建其功能，外源反义p53可封闭突变蛋白表达，阻止细胞停留于G1期。     

p53基因治疗与放射治疗联合应用于肿瘤研究

野生型p53基因的导入不仅可诱导肿瘤细胞凋亡，而且还可以提高肿瘤细胞对放射线的敏感性，从而增强放射治疗对肿瘤细胞的杀伤作用，但其作用机制尚未完全明了。野生型p53基因和放射线的协同作用有助于提高肿瘤疗效，从而使针对p53基因的基因治疗和放射线联合治疗方案具有良好的应用前景。     

肿瘤细胞p53突变状况对p53基因治疗的影响

目的探讨肿瘤细胞p53突变状况对p53基因治疗的影响。方法PCR-SSCP及DNA测序分析MCA-205和Panc-02细胞的p53基因突变状况;流式细胞计数了解腺病毒载体对这两种细胞的转导情况;TUNEL方法分析转导p53基因后的细胞凋亡情况,培养细胞计数分析对离体肿瘤细胞生长的影响;利用小鼠肝转移肿瘤模型,分析Adv-p53对于在体肿瘤的抗肿瘤作用。结果MCA-205细胞p53基因的第769个碱基由G突变为T,Panc-02细胞未发现p53基因突变。腺病毒载体在Panc-02细胞有较高的转导率,而Adv-p53在MCA-205细胞诱导更明显的细胞凋亡。Adv-p53在离体细胞培养试验中抑制MCA-205细胞的生长,而没有明显抑制Panc-02细胞的生长。在小鼠肝转移肿瘤模型中,门静脉注射Adv-p53明显抑制MCA205肝转移肿瘤的生长,而在Panc-02肝转移肿瘤中抗肿瘤作用不明显。结论Adv-p53的抗肿瘤作用在有p53基因突变的肿瘤细胞中效果明显,肿瘤细胞p53突变状况对p53基因治疗有一定影响。     

p53基因在5—氟尿嘧啶致大肠肿瘤细胞凋亡中的影响

目的 p53基因被认为是引起哺乳类动物细胞凋亡的基因,许多抗肿瘤药物是通过引起肿瘤细胞凋亡来发挥其治疗作用的,故p53基因有否突变与化疗药敏的关系较密切.本文通过研究p53基因与5-FU对大肠肿瘤细胞凋亡的影响,旨在探讨p53基因与化疗药物5-FU之间的关系.方法 对手术切除的大肠癌39例标本,用PCR-SSCP法进行p53基因第5～8外显子检测,同时制备肿瘤单细胞悬液,加入5-FU(10μg/ml)和甲酰四氢叶酸钙(5μg/ml,10μg/ml)用TDT法分析5-FU对大肠肿瘤细胞凋亡的影响.全组男性18例.女性21例.Dukes分期:A期4例,B期22例,C期8例,D期5例.结果 大肠癌p53基因突变率为43.6%(17/39例),p53基因突变与Dukes分期,性别,年龄,大体类型等关系不明显.在加入5-FU(10μg/ml)2h,4h,15h于荧光显微镜下均可见典型的调亡小体.药物作用15h后行TDT法分析发现:P53基因突变组细胞凋亡率为16.4±4.89%,而P53基因未突变组(野生型p53基因组)细胞调亡率为26.6±6.80%(P<0.01)结论 5-FU是通过引起肿瘤细胞凋亡来发挥其治疗作用的,p53基因的状态在5-FU作用于大肠肿瘤细胞引起凋亡的过程中起重要作用.     

p73基因与肿瘤

癌基因的激活和抑癌基因的失活是人类恶性肿瘤发生和发展的重要原因。p53基因是与人类肿瘤相关性最高的基因,近半数的恶性肿瘤与p53基因的突变有关,而p73基因是1997年发现的p53基因家族的一个成员,近年来对其结构、功能、分布和表达情况都有了深入的研究。我们就p73基因的研究现状以及其在人类肿瘤中的表达情况作一综述。p73基因定位于1p36.33,由13个外显子和12个内含子组成,表达相对分子质量为73×103的蛋白,在结构上与p53蛋白有同源性。p73过表达时能抑制细胞生长和诱导细胞凋亡,但是病毒原癌蛋白却与p73没有相互作用。C-Ab1激酶可以活化p73基因并参与凋亡反应。p73基因敲除的小鼠没有肿瘤易患现象发生,但却有严重的发育异常。p73基因在神经母细胞瘤中不常发生突变,在肺癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌表达增高,在淋巴瘤和某些白血病表达降低。与p53基因有明显的不同,p73基因有自己独特的功能。对于野生型p73基因在多种人类肿瘤中过表达的一种解释是,p73基因的过表达可能是一种p53基因失活的代偿反应,虽然这种作用可能无法完全替代p53基因的作用。但是目前研究已经证实p73基因很少突变,而且在肿瘤组织中存在异常表达,增加其表达可能诱导肿瘤细胞的凋亡,并且在p53基因突变时起抑制肿瘤细胞增殖的作用。因此增强p73基因表达也许是恶性肿瘤治疗的一种新方法。     

41例人脑胶质瘤组织中p53基因突变的研究

背景与目的:p53抑癌基因在细胞周期的调控、维持细胞基因组的完整性、诱导细胞分化和凋亡中起着重要作用。胶质瘤尤其是星形细胞肿瘤中,经常发生p53基因突变。本研究探讨人脑胶质瘤中p53突变及与胶质瘤发生发展的相关性。方法:应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(polymerase chainreaction-single-strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)及DNA测序技术对41例不同类型人脑胶质瘤p53基因突变进行检测。结果:通过PCR-SSCP检测发现在41例人脑胶质瘤组织中有17例(41.5%)呈现p53基因的单链构象多态性改变,均位于5～8外显子,突变例数依次为7(41.2%)、1(5.9%)、4(23.5%)、5(29.4%)。Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中p53基因突变率明显高于Ⅰ、Ⅱ级肿瘤(58.3%vs.17.6%,P<0.01);DNA序列分析显示,17例PCR-SSCP检测阳性的肿瘤p53基因相应外显子均存在基因点突变或缺失,其中错义突变13例,占76.5%;同义突变2例,占11.8%;移码突变2例,占11.8%;碱基突变以G→A或A→G最多,占55.6%。结论:胶质瘤中p53突变多发生于第5、8外显子,基因突变类型以错义突变为主,该基因的突变与胶质瘤的发生及恶性进展过程相关。     

野生型p53基因对人胆囊癌细胞生长及致瘤性的抑制作用

目的:研究野生型p53(wtp53)基因对人胆囊癌细胞生长及致瘤性的影响.方法:应用免疫细胞化学染色、PCR产物直接测序方法分析细胞系遗传背景,在脂质体介导下将含有wtp53的真核表达质粒pCMV-p53,导入GBC-SD细胞中.用G418筛选,建立转染克隆细胞系.以PCR,RT-PCR和蛋白印迹证实外源p53基因的整合与表达;以细胞生长曲线和集落形成实验反映细胞增殖状况;以裸鼠移植瘤试验检测体内致瘤性的影响.结果:GBC-SD细胞P53蛋白过表达;直接测序发现第5外显子126位密码子存在TAC→AAC的碱基突变.外源p53基因已整合入转染后的GBC-SD细胞并获稳定表达.表达外源wtp53的GBC-SD-wtp53细胞生长速率减慢、集落形成能力下降及裸鼠致瘤性受到显著抑制.结论:野生型p53基因可有效抑制人胆囊癌GBC-SD细胞的体内、外生长.     

p53反义RNA对人肺癌细胞表型和顺铂敏感性的影响

目的 研究外源p53反义RNA对有p53基因248密码点突变的人肺癌细胞系恶性表型和顺铂敏感性的影响。方法 构建p53反义RNA真核细胞表达载体PEGFP－p53（AS),经酶切图证明反向联结质粒。Lipofectin介导转染有p53基因248密码点突变的人肺癌细胞系801D，经G418筛选获耐受克隆。稀释法建立单细胞克隆系，应用PCR检测外源基因，荧光显微镜检测细胞绿色荧光蛋白表达，p53单抗免疫组化染色检测p53突变蛋白表达，体外集落形成实验检测细胞生长，流式细胞仪检测细胞周期，MTT法检测细胞对顺铂药物敏感性。结果 酶切图证明了p53-cDNA反向联结于质粒，构建了PEGFP－p53(AS),并建立了转染单细胞克隆系PEGFP－p53(AS)-801D及空载细胞系PEGFP－801D。PCR检测外源p53基因和neo基因存在于转染细胞系，而荧光显微镜下发现其胞浆有绿荧光蛋白表达。免疫组化染色p53突变蛋白在801D细胞系为阳性，而PEGFP－p53(AS)-801D为阴性，证明外源反义p53在转染细胞稳定表达并封闭内源突变蛋白表达。与母系相比，PEGFP－p53(AS)-801D集落形成抑制率为61％（P＜0．01），流式细胞检测该细胞系G1期细胞数明显增中，出现G1期阻滞的表现。MTT检测PEGFP－p53(AS）－801D对顺铂比母系更为敏感。结论 有p53基因248密码点突变的801D细胞恶性增殖明显，对顺铂耐药，外源p53反义RNA可封闭突变蛋白表达，抑制细胞体外恶性增殖，增加对顺铂的药物敏感性。转染p53反义RNA可抑制p53突变的恶性表型或恢复野生型p53基因功能。     

p53基因在甲状腺癌中的突变研究

目的:为探讨p53基因突变与甲状腺癌的发生、发展及预后的关系.方法:应用PCR单链构象多态性(SSCP)分析技术,对p53基因第7,8外显子突变进行了检测和分析.结果:在37例甲状腺癌中有11例在第7.8外显子发生突变,突变率为29.9%.p53基因突变在复发的患者中显著高于未复发的患者;p53基因突变与转移、组织学类型和分化状况无显著差异.结论:p53基因的突变可能与甲状腺癌患者预后有关.     

肝细胞癌p53和Rb基因改变的分析

目的 研究肝细胞癌p53和Rb基因的突变特点和规律。探讨2种抗癌基因在肝癌发生过程中的作用及其与细胞学和预后的关系。方法 应用PCR－SSCP和PCR－RFLP法检测65例肝癌p53基因第5－8外显子和Rb基因17和21外显子的突变率。结果 肝癌p53基因突变率为50．8％,以缺失为主;Rb基因的突变率为38．5％;p53和Rb基因同时突变率为12．3％。结论 肝细胞癌中既有p53基因突变也存在Rb基因突变,两者在肝癌的发生中均有重要作用。p53和Rb基因同时突变与肝癌组织学分级密切相关。     

p53突变与食管癌发生、预后的研究进展

食管癌是我国最常见的癌症之一,五年生存率低于30％^[1],其发生和发展的确切机制仍未阐明。已有研究探讨了食管癌中癌基因和抑癌基因的改变^[2]。p53基因是最重要的抑癌基因之一,也是各种人类肿瘤包括食管癌中最常见有突变的基因之一。野生型p53具有抗细胞增生的功能,p53基因突变可损害其DNA结合性和转录因子功能,使其控制细胞周期和细胞增殖的正常功能受到抑制。     

14株肿瘤细胞P53基因突变的检测

目的：检测14株肿瘤细胞P53基因的突变情况。方法：根据P53基因5～8外显子之间的内含子序列设计引物,分别对人肺癌、脑胶质瘤、肝癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、脉络膜恶性黑素瘤、视网膜成细胞瘤等9种肿瘤14株细胞的P53基因5、6、7、8的外显子进行PCR扩增反应。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物;DNA测序,并与正常的DNA序列比较;抽提肿瘤细胞蛋白进行Western blotting检测P53蛋白的表达。结果：14株肿瘤细胞P53基因热变区5、6、7、8外显子的扩增产物经电泳鉴定与预期相同。DNA测序结果表明,14株肿瘤细胞中8株存在P53基因5～8外显子的突变,其中肺癌细胞H1299、肝癌细胞Hep3B、肝癌细胞SMMC7721、脉络膜恶性黑素瘤细胞OCM-1检测到以前未报道过的突变;突变主要发生在外显子的编码序列,多数为单个碱基替换导致的错义突变,也有部分表现为同义突变;2株正常细胞未检测到突变。Western blotting检测显示,有基因突变的8株肿瘤细胞中仅6株有P53蛋白表达;所有P53基因未突变的肿瘤细胞株和正常细胞株均未检测到P53蛋白。结论：检测的14株肿瘤细胞中有8株细胞P53基因热变区存在突变,其中4株检测到以前未报道过的突变;2株正常细胞未发现P53基因突变。