CRE和AP-1元件参与人hsp90β基因的表达

为了进一步阐明人热休克蛋白９０β（ｈｓｐ９０β）基因的表达调控机制,本文对ｈｓｐ９０β基因调控序列中的ＣＲＥ和ＡＰ－１元件进行了研究。构建了含有这两个元件的系列删切报告基因质粒,通过转染Ｊｕｒｋａｔ细胞,检测并分析报告基因的活性。结果表明,ＣＲＥ和ＡＰ－１元件均不同程度地参与了ｈｓｐ９０β基因的组成性、ＰＨＡ激活和热导表达。     

野生型p53对热休克蛋白90β基因表达的调控作用

为了阐明野生型Ｐ５３在热休克蛋白９０β（ｈｓｐ９０β）基因表达调控中的作用，我们利用野生型Ｐ５３的表达质粒转染Ｊｕｒｋａｔ细胞，发现野生型Ｐ５３可以剂量依赖方式抑制ｈｓｐ９０β基因的启动子活性，证实ｈｓｐ９０β基因的表达在ＭＲＮＡ和蛋白水平无明显减少。     

维生素D3受体对hsp90β基因表达的调控作用

鉴于热休克蛋白９０β（ｈｓｐ９０β）基因内含子中含有维生素Ｄ３受体（ＶＤＲ）结合位点，为探讨作为核受体家族成员的ＶＤＲ是否对核受体特异分子伴侣的ｈｓｐ９０β基因的表达具有调控作用，我们开展了本项研究。分别将野生型ＶＤＲ、含Ｎ端（１～１３３氨基酸残基）及Ｃ端（２８１～４２７氨基酸残基）片段的ＶＤＲ突变体真核表达质粒与人ｈｓｐ９０β基因调控片段（－１０３９／＋１５３１）介导的氯霉素乙酰基转移酶（ＣＡＴ）报告基因质粒共转染Ｊｕｒｋａｔ细胞，检测正常及经热休克（４２℃，１ｈ）处理后细胞裂解液中ＣＡＴ活性。结果表明ＶＤＲＮ端增强、而Ｃ端抑制ｈｓｐ９０β的组成性表达；在热诱导条件下野生型ＶＤＲ对ｈｓｐ９０β的表达有一定的抑制作用，而其Ｃ端片段的抑制较强。为进一步研究ＶＤＲ对细胞内源性热休克基因表达的影响，我们用ＲＴＰＣＲ方法研究了ＶＤＲ的对细胞内ｈｓｐ９０β基因ｍＲＮＡ水平的影响，发现ＶＤＲ过表达对ｈｓｐ９０β的热诱导表达明显抑制。结果提示ＶＤＲ对ｈｓｐ９０β基因的组成性和热诱导表达的调控机制不同。     

人热休克因子原核表达及表达产物的研究

利用ＤＮＡ重组技术构建了人ｈｓｐ反式作用因子ＨＳＦ１和ＨＳＦ２的原核表达质凿ＰＥＴ－１１Ｂ／ＨＳＦ１和ＰＥＴ－１１Ｂ／ＨＳＦ２。经ＩＰＴＧ诱导，二者在ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＨＬｙｓＳ菌株中得到有效表达，利用ｈｓｐ９０β第一内含子ＨＳＥ和合成ＨＳＥ作为探针，对比分析两种表达产物与其特异性顺式作用元件间的结合能力，结果显示，原核表达的ＨＳＦ具有ＨＳＥ结合活性，ＨＳＦ１对ＨＳＥ的亲和力及结合在ＨＳＥ上的分     

热休克蛋白在人乳腺癌中的作用

目的探讨不同类型和亚型热休克蛋白（Ｈｓｐｓ）在人乳腺癌增殖、分化中的作用及意义。方法应用免疫组织化学ＳＰ法、电镜、原位杂交和ＲＴ－ＰＣＲ法对１１５例浸润性导管癌Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、泛素（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）进行观察。结果Ｈｓｐ９０ｍＲＮＡ在癌组织较非癌组织中的表达显著增强。此外，癌组织中的Ｈｓｐ９０αｍＲＮＡ表达水平与增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）指数密切相关。提示Ｈｓｐ９０α同功异构体表达增加在细胞增殖过程中起一定作用。另外，在分化差的癌组织中也有Ｈｓｐ９０βｍＲＮＡ表达。Ｈｓｐ７０和泛素在细胞中的分布部位一致。在Ｈｓｐ７０核内染色阳性的标本中，ＰＣＮＡ指数显著增加。Ｈｓｐ７０家族中的Ｈｓｐ７３ｍＲＮＡ在ＰＣＮＡ高表达的癌组织比非癌组织有较高水平的表达。结论本研究显示：Ｈｓｐ９０α在癌细胞增殖中起重要作用，而Ｈｓｐ９０β与细胞分化和结构构建有关。此外，Ｈｓｐ７０家族中，尤其是与泛素有关的Ｈｓｐ７３可能是癌细胞增殖的一个指标。     

抗CEA单链抗体与人hTNF-α融合基因的构建、表达和纯化

采用基因重组技术将已获得的抗癌胚抗原（ＣＥＡ） 单链抗体基因（ＳｃＦｖ） 与人肿瘤坏死因子α（ｈＴＮＦ α） 基因拼接成抗ＣＥＡＳｃＦｖ ｈＴＮＦ α（免疫毒素） 融合基因, 并克隆进大肠杆菌分泌性表达载体ｐＥＴ ２２ｂ （ ＋ ） 中, 在大肠杆菌中表达了６ ×Ｈｉｓ免疫毒素融合蛋白, 其６ ×Ｈｉｓ 位于ＳｃＦｖ 的Ｎ 端, 在胞内以可溶性存在, 其表达量占菌体总蛋白的６％ , ＳＤＳ ＰＡＧＥ 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 显示表达产物分子量为４３ｋＤ, 与其基因编码蛋白的理论推算值相符。经Ｎｉ２＋ ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ亲和柱一步纯化的６×Ｈｉｓ 免疫毒素纯度可达９０％ 以上, 得率为０－２ｍｇ／１００ｍｌ。表达产物除了具有与ＣＥＡ 结合的活性, 也具有对Ｌ９２９细胞杀伤的功能。     

EphB2配体结合域基因片段的高效表达

目的;对酷氨酸蛋白激酶受体ＥｐｈＢ２胞外的配体结合区基因进行表达研究。方法：编码ＥｐｈＢ２胞外的配体结合区基因片段克隆于ｐＢｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（－）质粒中,经全自动序列分析仪测正确后,再克隆重组人表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１,构高效表达克隆ｐＨＴ。转化大肠杆菌ＤＨ５α表达。结果：经ＩＰＴＧ诱导５ｈ,蛋白表达即达高峰,ＳＤＳ ＰＡＧＥ及凝胶密度扫描分析,表达出约４１ＫＤ大小的蛋白,占菌体总蛋白的３５％     

中年自发性高血压大鼠主动脉α1肾上腺素受体亚型的改变

目的：研究１２月龄Ｗｉｓｔａｒ大鼠与同龄自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）主动脉α１肾上腺。素受体（α１－ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ，α１－ＡＲ）亚型的分布。方法：采用离体灌流血管收缩功能实验和逆转录－多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，结果：ＳＨＲ与同龄Ｗｉｓｔａｒ大鼠相比，ＢＭＹ７３７８拮抗去甲肾上腺素（ＮＥ）缩血管效应的ｐＡ２值显著增大，ｓｅｒｔｉｎｄｏｌｅ的ｐＡ２值显著减小，而ＷＢ４１０１的ｐＡ２值无显著变化。ＣＥＣ预处理引起ＮＥ累积浓度－收缩效应曲线右移的作用显著增大。主动脉α１－ＡＲ３种亚型的ｍＲＮＡ稳态水平无明显改变。提示１２月龄ＳＨＲ主动脉中介导ＮＥ缩血管效应的α１－ＡＲ由对照组的α１Ａ－ＡＲ与α１Ｄ－ＡＲ亚型变为以α１Ｄ－ＡＲ亚型为主，这种改变不发生在ｍＲＮＡ表达水平     

重组HBsAg免疫逃逸突变体的表达及其抗原性分析

为了深入研究乙型肝炎病毒S基因变异所致的包膜抗原抗原性的改变，从含ＨＢＶＤＮＡ双拷贝的质粒载体ｐＥｃｏｂ６，获得一个８３７ｂｐ的ＨＢＶ－Ｓ基因片段，将其插入至载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ~＋的ＳｍａⅠ位点，通过体外寡核苷酸介导的人工定点突变分别获得第１４５位、１２６位和第１４５位＋１２６位氨基酸三种Ｓ基因变异型。然后将这些Ｓ基因变异片段克隆到真核表达载体ｐＭＥｐ４上，从而构建了含ＨＢＶ－Ｓ基因及其突变型的表达载体ＰＭＥｐ４ＨＢＶＳＭ。用其转染人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２，获得稳定分泌ＨＢｓＡｇ及其变异体的抗性细胞系。经体外初步研究表明，ＨＢｓＡｇ １４５位氨基酸变异体可影响ＨＢｓＡｇ的“ａ”抗原决定簇的结构。     

人CASK/LIN-2下游信号分子的初步研究

目的：揭示人类新基因ＣＡＳＫ／ＬＩＮ－２的生物学功能,运用酵母要效ＬｅｘＡ系统寻找与ｈＣＡＳＫ的鸟苷酸激酶结构域（ｇｕａｎｙｌａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ－ｌｉｋｅ,ＧＫ）相互作用的蛋白信号分子。方法：将ｈＣＡＳＫ的ＧＫＤＮＡ片段亚克隆ｐＬｅｘＡ融合表达质粒,得到的重组质粒ｐＬｅｘＡ－ＧＫ转化酵母ＥＧＹ４８。经证实该重组质粒无转录活性并能进入胞核,结合ＬｅｘＡ操纵基因。将人胎脑文库质粒转化ＥＧＹ４８（ｐＬｅｘＡ－ＧＫ,ｐ８０ｐ－ｌａｃＺ）,在Ｇａｌ／Ｒａｆ ｈｉｓ－ｔｒｐ－ｕｒａ－ｌｅｕ－和Ｇａｌ／Ｒａｆ ｈｉｓ－ｔｒｐ－ｕｒａ－Ｘ－ｇａｌ条件下筛选ｌｅｕ＋和ｌａｃＺ＋酵母克隆,提取上述阳性酵母质粒转化大肠杆菌ＫＣ８,分离出文库质粒;再将这些文库质粒转化ＥＧＹ４８（ｐＬｅｘＡ－ＧＫ,ｐ８０ｐ－ｌａｃＺ）,     

美蓝与消炎痛对高血压大鼠内脏血管内皮依赖性舒张减弱的影响

本文应用双标本微量生物测定法观察自发高血压大鼠（ＳＨＲ）及其常压对照（ＷＫＹ）大鼠肠系膜动脉Ａｃｈ内皮依赖性舒张（ＥＤＲ）的变化，并对其机制进行初步探讨，结果发现：ＳＨＲ的ＡｃｈＥＤＲ显著弱于ＷＫＹ者；鸟苷酸环化酶抑制剂美蓝（５×１０－５ｍｏｌ／Ｌ）可明显减弱ＳＨＲ与ＷｋＹ的ＡＣｈＥＤＲ，此时ＳＨＲ的舒张仍明显弱于ＷＫＹ。灌流消炎痛（５×１０－５ｍｏｌ／Ｌ）后，卒中易感型自发高血压大鼠（ＳＨＲｓｐ）的ＡｃｈＥＤＲ增强，ＷＫＹ的舒张反应几乎不变。此时ＳＨＲｓｐ与ＷＫＹ的肠系膜动脉的ＡｃｈＥＤＲ的差异消失。以上结果支持高血压的内脏血管ＥＤＲ减弱的结论，并且可以认为乙酰胆碱（Ａｃｈ）激发的血管内皮舒张因子（ＥＤＲＦ）通过ｃＧＭＰ环节的功能发生变化。以及血管内皮细胞释放的收缩因子（ＥＤＣＦ）增多是这一减弱的原因之一。     

腹泻儿童粪便分离的大肠杆菌中eaeA基因的检测及携带eaeA菌株的特性研究

用碱性磷酸酶标记的ｅａｅＡ基因寡核苷酸探针，对３７个血清群的２２１株从肯尼亚５岁以下腹泻患儿粪便中分离的大肠杆菌进行检测，并对ｅａｅＡ基因阳性菌株进一步做了ｂｆｐＡ和ｓｌｔ基因检测，ＨＥｐ－２细胞粘附及荧光肌纤蛋白染色（ＦＡＳ）试验。结果表明，ｅａｅＡ基因的携带率为１９．５％，ＥＰＥＣ、ＥＨＥＣ和其它血清群中ｅａｅＡ基因的携带率分别为３１．６％、６６．７％和８．９％，根据ｂｆｐＡ和ｓｌｔ基因检测及ＨＥｐ－２细胞粘附和ＦＡＳ试验的结果，可将携带ｅａｅＡ基因的大肠杆菌分成５种类型。提示ｅａｅＡ基因的分布不仅限于ＥＰＥＣ和ＥＨＥＣ，而且携带ｅａｅＡ基因菌株含有多种毒力决定因子。     

人血管内皮生长因子在毕赤酵母菌中的表达和鉴定

目的 研究人血管内皮生长因子（ｈＶＥＧＦ１６５）基因在Ｐｉｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母中的表达,获得高效表达的具有生物学活性的重组ＶＥＧＦ１６５。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ｈＶＥＧＦ１６５基因,经ＤＮＡ序列分析后,插入含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母载体中,构建重组表达质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ｈＶＥＧＦ１６５,转化酵母宿主菌ＫＭ７１,筛选多拷贝整合转化子,摇瓶培养,１％甲醇诱导表达。结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示,诱导４ｄ的培养上清中ｈＶＥＧＦ１６５表达量达上清总蛋白的３０％以上。ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。生物学活性检测证实其具有刺激ＨＵＶＥＣ增殖的功能。结论 在Ｐｉｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统中实现了ｈＶＥ     

VEGF_(165)cDNA在酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究

目的研究人 ＶＥＧＦ１６５基因在 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母中的表达,获得高效表达、具有生物学活性的重组ｈＶＥＧＦ１６５。方法采用ＰＣＲ扩增ｈＶＥＧＦ１６５基因,经ＤＮＡ序列分析后,插入含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母表达载体中,构建重组质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ｈＶＥＧＦ１６５。经转化酵母宿主菌ＫＭ７１,筛选多拷贝整合转化子,摇瓶培养,用 １０ ｍＬ／Ｌ甲醇诱导表达。表达产物经Ｈｅｐａｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂ亲和层析纯化后,以人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）测定其生物学活性。结果ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示,表达产物以可溶性分子的形式存在于上清中,诱导４ｄ的表达量达上清中总蛋白的６０％以上。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。经Ｈｅｐ－ａｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂ亲和层析纯化, ｒｈＶＥＧＦ１６５的纯度可达到９０％以上。生物学活性检测证实,其具有刺激脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）增殖的活性。结论在 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统中,实现了ｈＶＥＧＦ１６５的高效分泌性表达。     

携带人多药抗性基因逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中的…

从ｐＨａｍｄｒｌ／Ａ质粒用ＸｈｏⅠ和ＳａｃⅡ将ｍｄｒｌ基因切下后克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ质粒的相应酶切位点获得测序质粒ｐＢＳｍｄｒｌ，测定了ｒｄｒｌ基因的两端序列。用ＥｃｏⅠＣＲＩ和ＸｈｏⅠ从ｐＢＳｍｄｒｌ切下ｍｄｒｌ基因，定向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ和ｐＭＳＣＶ２．１，得到携带ｍｄｒｌ基因的逆转录病毒载体ｐＬｍｄｒｌＳＮ和ｐＭＳＣＶｍｄｒｌ。用ＰＡ３１７病毒包装细胞包装后三种携带ｍ     

抗人肿瘤坏死因子—α单链抗体基因在大肠杆菌中的融合表达

目的：将抗ｈＴＮＦ－α单链抗体基因克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１中，以期得到ＧＳＴ－ＳｃＦｖ融合表达蛋白。方法：将限制性内切酶酶切拼接法获得的Ｅ６ＳｃＦｖ基因克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１中，转化大肠杆菌ＤＨ５α，经异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导，１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达产物，光密度扫描和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ验证表达产物。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示，Ｅ６ＳｃＦｖ表达产物约为５２ｋｕ左右，与预期的结果相符；光密度扫描结果表明，ＧＳＴ－Ｅ６ＳｃＦｖ融合蛋白占菌体总蛋白的４０％；Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实，在相应分子量处，有ＧＳＴ－Ｅ６ＳｃＦｖ融合蛋白的显色印迹；进一步对表达产物的形式分析，ＧＳＴ－Ｅ６ＳｃＦｖ融合蛋白的表达产物为包涵体形式。结论：在大肠杆菌中成功地表达了抗ｈＴＮＦ－α单链抗体基因与谷胱甘肽巯基转移酶（ＧＳＴ）基因的融合蛋白     

丙型肝炎病毒结构蛋白在痘苗病毒中的表达

为研究中国丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的抗原性及在细胞内的加工，将丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５’非编码区（ＮＴＲ）和结构基因（Ｃｏｒｅ＋Ｅ１＋Ｅ２／ＮＳ１）插入痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５中，转染ＴＫ－１４３细胞，经纯化得到丙型肝炎（ＨＣＶ）重组痘苗病毒ｖＪＳＡ１１７５ＣＥ株。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交表明，ＨＣＶ结构基因存在于痘苗病毒之中。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析发现，ｖＪＳＡ１１７５ＣＥ表达蛋白带位于９０ｋＤａ，为一多聚蛋白；此蛋白为分泌型，分泌量与细胞裂解物内量大致相同     

应用痘苗病毒载体表达猴轮状病毒VP4抗原基因

把编码猴轮状病毒（Ｒｈｅｓｕｓｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ＲＲＶ）Ｖｐ４抗原的第４基因片段插入到痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５的Ｐ７．５启动子下游，构建成在痘苗病毒Ｐ７．５启动子调控下表达猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因的重组质粒ＰＪＳＡ１１７５－ＶＰ４。应用磷酸钙沉淀技术将ＰＪＳＡ１１７５－ＶＰ４ＤＮＡ转入ＴＫ－１４３细胞，在ＢＵＤＲ和Ｘ－ｇａｌ存在下筛选蓝色蚀斑。经３代以上纯化和病毒增殖，获重组病毒Ｒ－ＶＪＳＡ１１７５－Ｖｐ４。蚀斑滴定其满度达到１５×１０１１ＰＦＵ／Ｌ。经核酸杂交试验证明所获得的重组痘苗病毒带有猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因。用重组病毒感染ＴＫ－１４３细胞（或Ｖｅｒｏ细胞），在感染后４８ｈ，用酶免疫法（ＥＩＡ）检测受染细胞上清液和细胞裂解液中表达的猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因均呈阳性反应。本试验为本研究室轮状病毒基因工程疫苗的一部分，为深入了解轮状病毒基因结构及其功能在方法学上奠定了必要的基础。     

A组轮状病毒外壳蛋白VP4的原核表达

选用原核表达载体ｐＧＥＸ２Ｔ，该载体表达谷胱苷肽－Ｓ转移酶融合蛋白，将完整的Ａ组轮状病毒外壳蛋白基因插入ｐＥＧＸ２Ｔ中，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上没有明显的表达条带，而将部分ＶＰ４基因和６３１个碱基，插入ｐＧＥＸ２Ｔ，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中有明显的表达条带。     

人可溶性IL-6R基因在COS7细胞中的表达及活性分析

目的在ＣＯＳ７细胞中表达具有生物学功能的人可溶性ＩＬ－６Ｒ（ｓＩＬ－６Ｒ），作为研究ｓＩＬ－６Ｒ结构与功能关系的基础。方法首先利用ＰＣＲ技术扩增出人可溶性ＩＬ－６Ｒ（ｈｓＩＬ－６Ｒ）编码基因片段，并重组入克隆载体ｐＡＬＴＥＲ－１。通过基因序列分析确定了目的基因的核苷酸序列，并进一步构建了由ＳＶ４０晚期启动子和ＨＣＭＶ早期启动子控制的表达质粒ｐＳＶＬ６Ｒ和ｐＣＭＶ６Ｒ。用脂质体介导的方法将表达质粒转染ＣＯＳ７细胞，并分别在ｍＲＮＡ水平（斑点杂交）和蛋白水平（ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ）检测ｓＩＬ－６Ｒ基因在ＣＯＳ７细胞中的表达。在７ＴＤ１，ＬＴ１２两种ＩＬ－６反应细胞系上检测转染细胞上清（含ｓＩＬ－６Ｒ）的生物学活性。结果在ｍＲＮＡ水平和蛋白水平分别检测到ｓＩＬ－６Ｒ基因在ＣＯＳ７细胞中的表达，表达产物分子量约为５００００。表达产物在７ＴＤ１，ＬＴ１２细胞系上检测到明显的生物学活性。结论天然ｓＩＬ－６Ｒ基因在ＣＯＳ７细胞中的成功表达为进一步制备ｓＩＬ－６Ｒ突变体及其结构与功能关系的研究奠定了基础