海藻糖对低温储存皮肤β1 integrin及活力的影响

目的:比较海藻糖与传统低温保护剂对皮肤组织β1整合素(β1 integrin)低温保存后表达的影响,揭示海藻糖的低温抗冻机制。方法:新鲜成人皮肤组织分为2组,海藻糖-二甲基亚砜(T-D)、二甲基亚砜-丙二醇(D-P)作为低温保护剂保存,-196℃液氮冻存7 d、14 d复温,设新鲜组为对照组,免疫组织化学染色对各组间皮肤进行比较。RT-PCR方法检查β1 integrin基因表达水平。采用皮肤内琥珀酸脱氢酶的定量测定法(SDH)检测两种低温保护剂组合对皮肤活力影响,并通过透射电镜观察不同低温保护剂对皮肤基底膜变化的影响。结果:结果显示T-D能够很好保护皮肤组织,T-D 7 d组β1 integrin的基因表达量(0.769±0.052)与新鲜皮肤组(0.789±0.082)相似。琥珀酸脱氢酶(18.360±3.060)与新鲜组(20.517±1.976)无明显差异。结论:T-D对基底膜有优势保护作用,海藻糖对β1 integrin的保护作用在海藻糖的低温抗冻机制中发挥重要作用。     

两种低温保护剂对皮肤储存后α-辅肌动蛋白表达及活力的影响

目的比较两种不同低温保护剂对皮肤组织α-辅肌动蛋白（α-actinin）低温保存后表达的影响,为寻求皮肤组织低温保护剂的最佳配方提供实验依据。方法新鲜成人皮肤组织分为3组,新鲜对照组和海藻糖-二甲基亚砜（T—D）组、二甲基亚砜-丙二醇（D-P）低温保护剂保存组,-196％液氮冻存7d、14d复温,免疫组织化学染色对各组间皮肤进行比较。同时对各组皮片进行氧耗量测定。结果0．5mol／L海藻糖-二甲基亚砜能够很好保护皮肤组织,α-actinin的表达量与新鲜皮肤组相似。结论海藻糖与二甲基亚砜联合应用对皮肤组织α-actinin的保护作用优于传统组。     

低温下皮肤力学信号相关蛋白表达与活力关系研究

目的:探讨皮肤力学信号相关蛋白整合素(integrin)、踝蛋白(talin)在不同低温条件下的表达与皮肤活力改变的关系,进一步揭示皮肤低温损伤的机制。方法:从同一个体取标本后用5种不同的温度保存,分为新鲜组、4℃组、-20℃组、-80℃组和-196℃组,并在保存48 h后进行实验观察,用integrinβ1、talin抗体对5种储存条件下的皮肤作免疫组化染色,图像分析方法定量,同时采用氧耗量的方法对不同低温保存后皮肤活力进行检测。结果:新鲜组、-196℃组、-80℃组、-20℃组、4℃组活力依次下降,同时-80℃组、-20℃组、4℃组两种蛋白表达亦有明显下降。结论:低温保存后活力的改变与皮肤力学信号相关蛋白的表达下降关系密切。     

pcDNA3.1载体对内参基因表达影响分析

目的:研究转染质粒pcDNA3.1对内参基因表达影响差别,为今后在采用pcDNA3.1载体进行表达分析时内参基因的选择提供参考.方法:选用HepG2、HEK293、Hela、A549、QGY共5种细胞转染pcDNA3.1空载体质粒,转染后48 h提取细胞总RNA荧光定量PCR法比较内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphste dehydrogenase,GAPDH)、肌动蛋白(β-actin)、18sRNA表达水平差异,提取细胞总蛋白,检测GAPDH、β-actin表达水平差异.结果:5种细胞在转染质粒pcDNA3.1后,内参基因转录和蛋白表达均出现不同程度的下降,其中以β-actin下降最为明显,GAPDH及18sRNA在转录水平下降幅度小,且下降程度接近.结论:pcDNA3.1质粒转染造成基因表达非特异性抑制,其中对管家基因β-actin影响较大,因此在应用pcDNA3.1来源载体进行基因功能分析时,不推荐使用β-actin作为内参基因.     

逼尿肌相关蛋白在慢性前列腺炎大鼠模型中的表达及意义

目的：采用17β-雌二醇联合去势建立大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型,检测膀胱逼尿肌蛋白在慢性前列腺炎大鼠膀胱的表达。方法取2月龄 SD 雄性大鼠60只随机分为6组,每组10只,即：空白对照组、生理盐水组、假手术组、单纯17β-雌二醇组、单纯去势组、17β-雌二醇联合去势组。HE 染色判定大鼠慢性前列腺炎模型建造成功后,采用 SP 免疫组化法、Western blot 检测6组大鼠膀胱组织肌动蛋白(α-actin)、肌球蛋白(MLC 2)及高分子量钙调素结合蛋白(h-cad)表达的差异。结果免疫组化结果显示17β-雌二醇联合去势组中α-actin、MLC 2、h-cad 蛋白表达增多,Western blot 显示α-actin 在各组的表达,与空白对照组相比,生理盐水组、假手术组、单纯17β-雌二醇组、单纯去势组联合去势组差异有统计学意义。 MLC 2、h-cad 在各组的表达与空白对照组相比,生理盐水组、假手术组差异无统计学意义,单纯17β-雌二醇组、单纯去势组、联合去势组差异有统计学意义。结论α-actin、MLC 2、h-cad 表达变化可能参与慢性前列腺炎排尿相关症状的发病。     

皮肤及皮肤相关组织细胞的深低温冻存研究进展

保持冷冻后皮肤较好的活力对皮肤移植十分重要,采用慢速或中速降温（-1℃／min）或（-60℃／min）可以获得较高的活性。冷冻保护剂被证实对保持低温冻存皮肤活力有益,目前发现的冷冻保护剂有丙二醇、丙三醇、二甲基亚枫、海藻糖。采用海藻糖联合二甲基亚砜最有利于复合皮肤组织在深低温储存和冻融后保留活性。D-阿洛糖作为冷冻保护剂的添加剂,对皮肤角化细胞和人真皮成纤维细胞生存能力有益。玻璃化冷冻技术则使冻存后皮肤及皮肤相关组织、细胞活性达到80％以上。     

内参基因GAPDH和β-actin在BMP9诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达情况

目的:观察常用内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和β肌动蛋白(β-actin)在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化过程中表达情况,以确定相关研究的内参基因。方法:检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)确定BMP9诱导的MSCs(包括C3H10、C2C12和MEF)向成骨分化;以real-time PCR分别检测0、1、3、5、7 d GAPDH和β-actin的m RNA表达水平;以Western blot检测GAPDH和β-actin蛋白。结果:(1)β-actin在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中m RNA表达水平逐渐升高,0 d与5 dβ-actin的m RNA表达量存在统计学差异(C3H10、C2C12和MEF的P值均为0.000,GAPDH的m RNA表达水平未见明显改变(P>0.05);β-actin蛋白表达量随成骨分化逐渐增加,而GAPDH蛋白表达未见明显变化。结论:在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中,GAPDH比β-actin更适合做内参。     

低温冷冻对皮肤α-tubulin、β-tubulin和cytoskeratin表达的影响

目的:探讨低温冷冻对皮肤骨架蛋白中α-微管蛋白(α-tubu lin)、β-微管蛋白(β-tubu lin)和高分子量角蛋白(cytoskeratin)表达的影响,从而进一步揭示皮肤低温损伤的机制。方法:用-αtubu lin、β-tubu lin、cytoskeratin抗体对5种储存条件下的皮肤作免疫组化染色,采用计算机图像分析技术进行定量分析。并进一步采用透射电镜观察-αtubu lin、β-tubu lin、cytoskeratin的超微结构的变化。结果:α-tubu lin、β-tubu lin、cytoskeratin在4℃组、-20℃组、-80℃组均表达显著下降,且超微形态结构及分布改变明显。在-196℃组储存时三种成分含量下降较少,形态改变亦不显著。结论:皮肤的低温损伤与骨架蛋白-αtubu lin、β-tubu lin、cytoskeratin的破坏有关。     

α-平滑肌肌动蛋白和β-肌动蛋白在瘢痕组织中的表达

目的 探讨α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和β-肌动蛋白(β-actin)对增生性瘢痕形成的可能作用。方法 采用荧光定量PCR法检测10例增生性瘢痕和10例正常皮肤组织中α-SMA和β-actin的表达水平。结果 增生性瘢痕组织中α-SMA和β-actin表达水平均高于正常皮肤组织,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 α-SMA和β-actin在瘢痕增生中起重要作用;由于β-actin在瘢痕组织和正常皮肤中的不恒定性,建议在瘢痕的mRNA定量研究中不作为内参照物。     

α-平滑肌肌动蛋白和β-肌动蛋白在瘢痕组织中的表达

目的探讨α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和β-肌动蛋白(β-actin)对增生性瘢痕形成的可能作用.方法采用荧光定量PCR法检测10例增生性瘢痕和10例正常皮肤组织中α-SMA和β-actin的表达水平.结果增生性瘢痕组织中α-SMA和β-actin表达水平均高于正常皮肤组织,差异有统计学意义(P＜0.01).结论α-SMA和β-actin在瘢痕增生中起重要作用;由于β-actin在瘢痕组织和正常皮肤中的不恒定性,建议在瘢痕的mRNA定量研究中不作为内参照物.     

骨桥蛋白在原发性干燥综合征患者唇腺中的表达

目的:研究骨桥蛋白(osteopontin,OPN)在原发性干燥综合征(primary Sjgren’s syndrome,pSS)患者唇腺组织中的表达情况。方法:收集24例pSS患者和14例对照者的唇腺标本,提取唇腺中总RNA,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增OPN、β-肌动蛋白(β-actin)的片段,计算OPN/β-actin光密度比值。采用免疫组织化学染色方法检测OPN蛋白在唇腺中的表达情况。结果:pSS组唇腺中OPN的mRNA转录及蛋白表达水平均高于对照组(P<0.05)。OPN表达水平与淋巴细胞灶性评分(lymphocyte foci-score,LFS)呈正相关,mRNA转录水平与LFS相关系数为0.407(Pearson相关系数),P=0.049;蛋白表达程度与唇腺LFS相关系数为0.476(Spearman相关系数),P=0.039。免疫组织化学染色显示,OPN蛋白主要分布在腺上皮细胞胞浆内,但在浸润的淋巴细胞胞浆中也有阳性表达。结论:pSS患者唇腺中OPN表达增加,可能是唇腺结构破坏的原因之一。     

肺岩宁方对ILK基因沉默后转染人肺癌A549细胞相关基因表达的影响

目的:探讨整合素连接激酶(ILK)基因沉默后及中药肺岩宁方对相关下游靶基因表达的影响。方法:构建载体转染人肺腺癌细胞A549后,随机分为阴性对照病毒感染细胞(NC)组、RNAi靶点病毒感染细胞(KD)组、10%肺岩宁含药血清干预的NC组与KD组、20%肺岩宁含药血清干预的NC组与KD组,以及阳性对照10%DDP干预的KD组,应用Real time-PCR及Western Blot方法检测下游靶基因蛋白激酶B(Akt/PKB)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、转录因子-1(AP-1)、细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、血管内皮生长因子(VEGF)、β-链蛋白(β-catenin)的mRNA及蛋白表达水平。结果:与NC组比较,KD组GSK-3β、VEGF mRNA和蛋白表达显著下调(P0.05,P0.01),cyclinD1、MMP-9 mRNA和蛋白表达显著上调(P0.05,P0.01),Akt表达无变化,AP-1与β-catenin在mRNA水平表达升高(P0.01)、蛋白水平表达则下降;与KD组比较,KD+10%肺岩宁含药血清和KD+10%DDP组具有下调VEGF、cyclinD1、MMP-9和β-catenin蛋白表达、上调GSK-3β蛋白表达,以及下调AP-1、cyclinD1 mRNA表达的作用(P0.01);与KD组相比,KD+20%肺岩宁含药血清具有下调AP-1、cyclinD1和MMP-9蛋白表达的作用。结论:沉默ILK基因后可以明显降低GSK-3β、VEGF的表达,10%的中药肺岩宁方含药血清可能通过下调靶基因AP-1、cyclinD1、MMP-9、VEGF和β-catenin蛋白表达的作用而发挥其抗肿瘤的作用。     

低温冷冻对皮肤高分子量角蛋白表达的影响

目的 研究皮肤低温储存后表皮层高分子量角蛋白的变化,从而分析皮肤组织细胞骨架的低温生物学效应.方法 将新鲜成人皮肤分为新鲜组、4℃组、-20℃组、-80C组和-196℃组,于冻存后第14天复温,运用免疫组织化学染色和电镜观察角蛋白的改变,并用图像分析仪测定表皮组织中的含量变化.结果 随着保存温度的降低,4℃、-20℃、-80℃组的角蛋白均表达下降,而-196℃组与新鲜皮肤组表达相似.结论 皮肤组织的低温损伤与细胞骨架结构密切相关,角蛋白在该低温生物学机制中发挥着重要作用.     

辛伐他汀对心肌梗死大鼠心功能、心肌肌球蛋白重链与肌动蛋白的影响

目的:探讨3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂辛伐他汀对心肌梗死后心肌细胞内α-肌球蛋白重链(α-MHC),β-肌球蛋白重链(β-MHC)及骨骼肌α肌动蛋白(Sk α-actin)表达的影响.方法:结扎Wistar大鼠冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,24 h后存活大鼠随机分为心肌梗死组(MI组)、辛伐他汀(Sim)20 mg组和40 mg组,另设假手术组(SH组).Sim组分别予20 mg/kg·d和40 mg/kg·d灌胃,MI组和Sham组以等量等浓度溶剂灌胃.8 wk后检测各组血流动力学指标,RT-PCR检测大鼠非梗死区心肌α-MHC和β-MHC mRNA表达,免疫组化法测定Sk α-actin表达.结果:MI组左室舒张末压高于SH组,左室收缩压低于SH组;两个Sim组左室舒张末压低于MI组,左室收缩压高于MI组.MI组α-MHC mRNA表达低于SH组,β-MHC mRNA表达高于SH组(均P＜0.01);两个Sim组α-MHC mRNA表达均高于MI组,β-MHC mRNA表达低于MI组(P＜0.01).Sk α-actin在SH组表达少,MI组表达明显增多,在两个Sim组中表达少于MI组.两个Sim组间无统计学差异.结论:辛伐他汀能减少心肌梗死后非梗死区心肌细胞内α-MHC基因mRNA表达,增加β-MHC基因mRNA表达,减少Sk α-actin表达,抑制心肌肥大,改进心脏功能.     

β-actin在无菌性前列腺炎大鼠模型中免疫抑制治疗前后的表达及意义

目的:检测β-aetin在大鼠慢性无菌性前列腺炎(nonbacterial chronic prostatitis,CAP)动物模型免疫抑制治疗前后的表达,探讨其与慢性无菌性前列腺炎发病机制的相关性.方法:成年Sprague-Dawley大鼠40只,随机分成4组:正常对照组(A),单纯造模组(B),造模后免疫抑制治疗组(C),造模后安慰剂治疗组(D).采用去势后苯甲酸雌二醇皮下注射30 d造模,成功复制出大鼠无菌性前列腺炎模型.采用免疫组化SP法分别检测β-actin在各组中的表达,并对检测结果进行统计学分析.结果:单纯造模组β-actin表达明显减弱,与正常对照组相比有显著性差异(P<0.05).经过环孢素A免疫抑制治疗后β-actin表达明显恢复,与单纯造模组相比有显著性差异(P<0.05).而安慰剂治疗组β-actin表达几近消失,染色面积为(0.22±0.31)%,与环孢素A治疗组相比均有显著性差异(P<0.01).结论:β-actin作为紧密连接中的关键性调节因子,在慢性无菌性前列腺炎的发病过程中可能具有重要的调节作用.     

RNAlater在保存甲状旁腺腺瘤中的研究和探索

目的 探讨不同保存方法对甲状旁腺组织保存的影响,为组织库规范化建设提供理论支持.方法 收集北京协和医院2010年8月至2011年11月的散发甲状旁腺腺瘤组织共22例标本,所有标本均经手术病理证实,其中11例标本用传统液氮法保存（A组）,另11例标本用RNAlater保存（B组）,分别提取组织总RNA,测定OD 260/OD 280值;进行RNA质量评价,琼脂凝胶电泳判断RNA完整性;分别利用Realtime-PCR技术检测内参基因β-actin的表达情况.结果 在RNA的提取纯度和浓度及RNA完整性方面对比2组标本结果差异无统计学意义（P＞0.05）;B组内参基因β-actin的表达量明显高于A组（P＜0.05）.结论 RNAlater在保存RNA和预防RNA降解方面和传统液氮法相比无明显差异,但RNAlater保存法对于长期保存组织标本方面优于传统液氮法.     

低温保存皮肤组织中纤维连接蛋白和层粘连蛋白的表达

目的：观察细胞外基质中纤维连接蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)在不同温度保存皮肤组织中的分布及表达，探讨其与皮肤冷冻保存的关系．方法：用FN，LN抗体对新鲜皮肤以及4℃，-20℃，-80℃或-196℃保存的皮肤作免疫组化染色，用图像分析仪测定并比较它们在表皮组织中的含量，并通过HE染色比较观察皮肤的组织结构变化。结果：与新鲜皮肤组相比，-196℃，H抗冻液中皮肤组织结构保存较好，FN，LN含量变化不明显，而4℃，-20℃，-80℃保存皮肤的组织结构均有明显破坏，FN，LN含量亦明显下降。结论：皮肤低温冷冻保存时细胞外基质中FN，LN发生丢失。     

小鼠皮层eaveolin-1蛋白表达与作业成绩的相关性

目的 探讨小鼠作业成绩与皮层中caveolin-1( Cav-1)蛋白表达的相关性.方法 以昆明种小鼠为实验对象,建立y-迷宫模型,根据训练成绩将小鼠分为优良组与不良组,通过Western blot技术检测作业成绩不同的小鼠皮层、海马中Cav-1蛋白的表达并分析与作业成绩的相关性.结果 作业成绩优良组小鼠皮层中Cav-1蛋白的表达(Cav-1/β-actin为5.71±1.11),高于作业成绩不良组(Cav-1/β-actin为1.69±0.20),差异具有显著性(P＜0.01);而优良组小鼠海马中Car-1蛋白的表达(Cav-1/β-actin为0.22±0.09)与不良组(Cav-1/β-actin为0.26±0.04)相比,差异无显著性(P＞0.05).结论 小鼠y-迷宫作业成绩优劣与脑内皮层中Cav-1蛋白的表达具有明显相关性.     

全麻复合硬膜外阻滞对高血压大鼠心肌c-fos和HSP70基因表达的影响

目的 通过检测高血压大鼠心肌组织c-fos和HSP70基因的表达水平,研究全麻复合硬膜外阻滞减轻应激反应的效果.方法 18只SHR和18只SD大鼠随机分3组:气管切开全麻复合硬膜外阻滞组(A1、A2)、气管切开全麻组(B1、B2)和对照组(D1、D2).全麻以氟芬合剂(0.1～0.3 ml/kg)复合地西泮(3～6mg/kg)腹腔注射,气管切开连接简易呼吸装置.硬膜外阻滞选择T11-T12棘突间隙切开直接向头端插入硬膜外导管2 cm,缓慢注入1%利多卡因0.2 ml.A1、A2、B1、B2组施行脾脏切除术.尾动脉置管连接监护仪监测MAP、HR,同时观察呼吸改变.术后24h处死动物,取心肌组织2块,液氮保存.用RT-PCR方法检测c-fos和HSP70两基因反应产物相对于β-actin值.结果 高血压大鼠全麻复合硬膜外阻滞组(A1)的c-fos/β-actin比值显著低于单纯全麻组(B1),而HSP70/β-actin比值显著高于全麻组.结论 与单纯全麻比较,全麻复合胸段硬膜外阻滞可以减少高血压大鼠手术刺激时心肌c-fos表达、降低应激反应水平,同时增强HSP70表达,对心肌具有一定的保护作用.     

皮肤基底细胞癌组织中β-连环素和PTEN蛋白的表达

目的:检测基底细胞癌组织中β-连环素和PTEN蛋白的表达.方法:应用免疫组织化学SP法检测20例基底细胞癌和25例正常皮肤组织中β-连环素和PTEN蛋白的表达.结果:皮肤基底细胞癌组织中β-连环素的异常表达率(70.0%)明显高于正常皮肤组织(12.0%)(P=0.000);PTEN蛋白阳性表达率(60.0%)低于正常皮肤组织(92.0%)(P=0.014),PTEN蛋白的表达与β-连环素的异常表达相关(P<0.05).结论:β-连环素的异常表达和PTEN蛋白的低表达在基底细胞癌发生、发展中起重要作用.