组织工程角膜基质的体外构建及移植的实验研究

目的探讨利用组织工程技术体外构建角膜基质进行板层角膜移植的可行性和有效性。方法将猪角膜基质去细胞处理后制备成组织工程角膜基质载体;取幼兔角膜基质细胞体外培养,将其种植在载体上,体外构建成组织工程角膜基质,用PKH26荧光标记兔角膜基质细胞示踪角膜基质的构建;将16只兔的角膜基质内植入壳聚糖膜使之形成无菌性角膜溃疡,随机从16只兔中选8只,进行组织工程角膜基质移植;另外8只作为对照组,进行新鲜的同种异体兔板层角膜移植。术后对角膜进行裂隙灯、光学显微镜、透射电镜观察。结果体外构建的组织工程角膜的基质细胞具有活性,其结构与正常角膜基质相近。移植治疗无菌性角膜溃疡术后,1~2周有新生血管侵入组织工程角膜基质植片边缘,植片为灰白色半透明状;3~4周随着新生血管减退,组织工程角膜基质植片局部开始透明变薄;术后8~10周角膜溃疡完全修复,角膜恢复透明性,角膜神经可再生;观察最长达10月,角膜仍保持透明,无免疫排斥发生,与对照组疗效相同。结论体外构建的组织工程角膜基质无免疫原性、具有良好的生物相容性,可作为临床治疗角膜溃疡的移植材料。     

羊膜移植及角膜板层移植治疗蚕蚀性角膜溃疡

目的 探讨羊膜移植及羊膜联合板层角膜移植治疗蚕蚀性角膜溃疡的作用。方法 对12例14眼蚕蚀性角膜溃疡患者,按照溃疡的大小与程度分别进行单纯羊膜移植或羊膜和板层角膜同时移植术。结果 随访观察6个月,除1例溃疡复发外,余均无溃疡复发和移植片排斥反应。结论 羊膜是重建眼表的理想材料,球结膜和坏死组织去除联合羊膜和角膜板层移植术是治疗蚕蚀性角膜溃疡的有效方法。     

羊膜移植联合结膜瓣遮盖术治疗深层细菌性角膜溃疡

目的探讨羊膜移植联合结膜瓣遮盖(复式遮盖)术治疗深层细菌性角膜溃疡的可行性,并对其疗效进行评价。方法观察角膜深层溃疡濒临穿孔患者30例(30只眼),分为复式遮盖和单纯遮盖组(单纯羊膜移植术),手术清创后采用抗体阴性无菌处理后的新鲜羊膜,于角膜深基质层溃疡底层放置2~3层羊膜,并将邻近的结膜瓣加压遮盖于羊膜表面,随访3~10个月,观察角膜溃疡愈合情况。结果复式遮盖组的15只眼,术后有2只眼结膜瓣回退,再次行球结膜覆盖;有1只眼羊膜自行溶解,无1例穿孔,溃疡均治愈,视力提高0.1以上8只眼。单式移植组中1周后羊膜脱落7只只眼,视力提高0.1以上2只眼。结论羊膜移植能促进角膜溃疡快速修复,减少瘢痕形成,为角膜溃疡缺损区提供理想的基底膜,在其上加固球结膜瓣(复式遮盖)可促进局部血液循环并使药物向溃疡处缓慢渗透,达到控制炎症预防角膜穿孔的目的。     

病灶切除联合冷冻及羊膜移植治疗蚕蚀性角膜溃疡的临床研究

目的 探讨应用病灶切除联合冷冻及羊膜移植的方法治疗蚕蚀性角膜溃疡的有效性和安全性.方法 选择2005年1月至2007年5月的蚕蚀性角膜溃疡患者,共12例(14只眼),病程为15 d至2年(平均3.5月).所有患者均行病灶切除联合冷冻及羊膜移植术,术后随访5～24个月,裂隙灯显微镜观察角膜溃疡愈合及羊膜组织转归,荧光素钠染色观察角膜上皮的愈合情况.同时观察并发症及复发情况.结果 眼部疼痛、畏光、流泪等刺激症状明显缓解,表层羊膜于3～7 d开始脱落或自溶吸收,内层羊膜与角膜组织牢固愈合.角膜溃疡在1～3周修复,角膜融解得到控制,角膜厚度增加.14只眼中首次手术9只眼治愈,3只眼好转,治愈及好转率为85.71%,无并发症发生.结论 病灶切除联合冷冻及羊膜移植治疗蚕蚀性角膜溃疡是有效、安全的.     

载药羊膜移植治疗感染性角膜溃疡的实验研究

背景 应用羊膜移植术治疗角膜溃疡的方法在临床上已广泛开展,但目前国内有关将羊膜作为药物载体治疗感染性眼表疾病的研究较少见. 目的 探讨载药羊膜在治疗眼表感染性疾病中的缓释性能并评价其疗效.方法 利用体外抑菌实验比较羊膜浸泡不同质量浓度(5、20、30 g/L)的左氧氟沙星不同时间(5、15、30、60 min)后平均抑菌环直径的改变.利用角膜基质层接种法将浊度为0.7麦氏单位的金黄色葡萄球菌菌悬液0.1ml自角膜近中央处注入角膜基质层,形成直径4.0～6.0 mm的混浊区,建立20只家兔单眼感染性角膜溃疡模型,采用随机数字表法将动物模型随机分为单纯羊膜移植联合点药组和载药羊膜移植组,每组各10只,两组家兔造模后24 h分别行单纯羊膜移植术或载药羊膜移植术.单纯羊膜移植联合点药组术后用质量分数0.5％左氧氟沙星滴眼液点眼,每日3次,分别于点眼后0.5、1.0、2.0、3.5、5.5h抽取房水0.1ml,载药羊膜移植组于术后1、3、7、10、14、21d抽取房水0.1ml,用高效液相色谱分析法检测各时间点兔眼房水中左氧氟沙星的质量浓度.各组大鼠在裂隙灯显微镜下观察角膜病变情况及角膜溃疡的面积变化,按照改进的McNeill角膜病变程度分级法对角膜病变进行评分,并于术后4周行兔眼角膜组织病理学检查.结果 左氧氟沙星体外抑菌实验表明,平均抑菌环直径随药物质量浓度的增加而增大,相同质量浓度左氧氟沙星浸泡15 min的羊膜与浸泡5 min相比抑菌环直径增大,差异均有统计学意义(P＜0.01),但与浸泡30 min、60 min的羊膜相比差异均无统计学意义(P＞0.05).单纯羊膜移植联合点药组术后房水中左氧氟沙星质量浓度随时间的延长而逐渐降低,0.5h为(0.873 ±0.264) mg/L,5.5h为(0.106±0.027) mg/L;载药羊膜移植组术后1、3、7d房水中左氧氟沙星质量浓度仍高于单纯羊膜移植联合点药组点药后0.5h,差异均有统计学意义(均P=0.00).载药羊膜移植组家兔用药后1、2、4周角膜病变评分分别为1.7±0.6、1.3±0.5和0.2±0.4,明显低于单纯羊膜移植联合点药组的2.2±0.8、2.0±0.6和1.5±0.8,差异均有统计学意义(F分组=9.49,P=0.01;F时间=22.96,P=0.01).术后1周载药羊膜移植组角膜溃疡面积明显小于单纯羊膜移植联合点药组,差异有统计学意义[(1.6±0.6)mm2 vs.(3.2±0.8)mm2,t=3.98,P=0.00].组织病理学检查显示,单纯羊膜移植联合点药组术后4周角膜各层排列不规则,出现1～2层新生鳞状上皮,基质层结构紊乱,可见较多炎性细胞浸润及残留血管腔;载药羊膜移植组术后4周角膜有4～5层新生鳞状上皮,排列整齐,仅见少量炎性细胞浸润及残留血管腔.结论 左氧氟沙星载药羊膜移植至角膜后具有一定的药物缓释性能,可以提高房水中的有效药物质量浓度,对金黄色葡萄球菌感染性角膜溃疡的疗效优于点眼的用药方式.     

人羊膜作为载体体外培养兔角膜上皮细胞移植治疗碱烧伤动物的实验研究

目的观察培养生长于人羊膜的兔角膜上皮细胞使其扩增并移植治疗角膜碱烧伤的效果。为培养角膜上皮细胞移植技术及应用于临床实践提供最佳的理论和实验依据。方法新西兰白兔30只（30眼）,随机分为3组（n=10）,右眼制成碱烧伤模型。A组：角膜上皮细胞羊膜移植组;B组单纯羊膜移植组;C组为对照组（碱烧伤后不作任何移植）。术后观察角膜透明度、角膜新生血管及上皮修复情况,裂隙灯显微镜照相记录。3组均于术后1周、2周、1个月及3个月时各取1眼角膜标本行病理组织检查。结果A组除1眼移植片在第7天脱落外,所有移植片在术后3d水肿消退,角膜逐渐透明。B组移植片持续水肿,眼前段炎性反应稍重,但较碱烧伤对照组轻。C组角结膜高度水肿浑浊,烧伤后观察3个月未发现角膜恢复透明现象。病理组织检查显示：A组角膜及周边上皮细胞为多层结构,角膜新生血管消失,基质的炎性细胞浸润减退;B组覆盖上皮细胞表现为完整上皮细胞型,C组角膜浑浊,新生血管及肉芽组织形成。结论人羊膜作载体体外培养兔角膜上皮细胞移植重建角膜基底膜和角膜上皮结构治疗兔碱烧伤后的角结膜损伤是一种合理有效的方法。     

羊膜移植治疗眼表烧伤后角膜溃疡的临床观察

目的 观察和评价羊膜移植对眼表烧伤后角膜溃疡的治疗作用.方法 对24例(27只眼)角膜烧伤后溃疡形成患者进行1次或多次的新鲜羊膜移植手术.结果 26只眼角膜溃疡在7～32 d愈合,平均为16 d,角膜有不同程度的新生血管形成.1只眼角膜溃疡最终穿孔.结论 羊膜移植能促进眼表烧伤后角膜溃疡的修复,减轻角膜新生血管的形成.     

羊膜移植治疗深层角膜溃疡的临床观察

目的 观察羊膜移植治疗深层角膜溃疡的临床效果。方法 我们采用同种异体多层羊膜移植治疗深层角膜溃疡6例(6眼)，均为药物治疗无效的细菌性角膜溃疡结果6眼均治愈。术后未见羊膜移植片急性排斥反应，术后5—12天炎症控制，4-5周角膜上皮愈合，溃疡灶留下不同程发的瘢痕。结论羊膜移植治疗深层角膜溃疡是一种有效方法，尤其适用于角膜侈植供体缺乏、抢救药物治疗无效且病情进行性发展的深层角膜溃疡。     

新鲜多层羊膜移植治疗细菌性角膜溃疡的疗效观察

目的观察新鲜多层羊膜移植治疗细菌性角膜溃疡的临床疗效。方法对15例（15只眼）细菌性角膜溃疡进行新鲜多层羊膜移植术,术后观察病灶愈合情况及角膜透明程度。结果15只眼溃疡均达到临床治愈,角膜面残留不同程度的瘢痕。结论新鲜多层羊膜移植能促进角膜重新上皮化,抑制炎症和纤维化,抑制新生血管形成,是治疗角膜溃疡的有效方法。     

羊膜移植治疗眼表疾病观察

目的 探讨施行羊膜移植术治疗眼表疾病的临床效果.方法 采用DMEM和纯甘油（1：1）混合液保存的人羊膜治疗眼表疾病51例（69眼）,充分分离睑球粘连组织,清除角膜病变组织,根据切除病变深浅分别行单纯羊膜移植、角膜板层移植联合羊膜移植、睫状体冷冻联合羊膜移植、小梁切除联合羊膜移植.结果 69眼中64眼术后2～6周上皮愈合,炎性症状明显改善,未见急性排斥反应、植片脱落及睑球粘连等并发症.结论 羊膜移植是治疗角膜溃疡、化学烧伤、热烧伤以及各种原因导致的睑球粘连的有效方法.创伤小、可重复操作.     

脱细胞猪角膜基质的生物相容性与组织工程化兔角膜上皮移植的研究

目的 探讨脱细胞猪角膜基质的生物相容性,评价组织工程化角膜上皮组织作供体的可行性,观察支架材料的细胞化情况和种子细胞的存活情况.方法 实验研究.采用完全随机化设计的方法,用Dispase-Triton-X-100处理猪角膜基质,脱去角膜细胞;以角膜基质囊袋内植入的方法,观察异种角膜基质植入后的生物相容性,A组:脱细胞猪角膜基质,B组:新鲜猪角膜基质,C组:空白对照组.以组织工程化雄性角膜上皮组织为供体,同种雌性为受体,作板层角膜移植,观察角膜的混浊、水肿、新生血管等情况;组织病理学和免疫组化方法检测支架材料的细胞化情况,Y染色体性别决定基因(SRY)-聚合酶链反应(PCR)方法追踪种子细胞的存活情况.结果 猪角膜基质植入兔角膜囊袋后,角膜逐渐恢复透明,排斥反应指数＜6,组织病理学观察角膜结构完整,胶原纤维平行排列,少许细胞长入脱细胞猪角膜基质边缘,各组免疫组化检测未见CIM+、CD8+T淋巴细胞浸润.组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植后,3～4 d上皮光滑,10～20 d变为透明;15 d时角膜上皮、基质、内皮完整,上皮细胞约4或5层结构,少许基质细胞长入支架,1个月时可见角膜上皮细胞约7或8层细胞,基质纤维排列规则,多量细胞长入脱细胞角膜基质.上皮细胞表达CK3,支架内新生细胞表达波形蛋白.SRY-PCR结果显示种子细胞可以在受体内长期存活.结论 脱细胞猪角膜基质生物相容性良好,组织工程化角膜上皮可作为板层角膜移植的供体,脱细胞猪角膜基质细胞化良好,种子细胞可以在受体内长期存活.     

角膜溃疡多层羊膜移植术后早期组织病理学与临床分析

目的观察角膜溃疡多层羊膜移植术后羊膜与角膜早期组织病理学形态与临床特点。方法角膜溃疡患者23例(23眼),以多层羊膜填塞溃疡面,单层羊膜覆盖角膜表面,10-0线间断缝合于角膜缘。角膜组织行病理学检查,裂隙灯观察角膜溃疡变化,并观察术后并发症。结果 21例患者角膜溃疡愈合;2例患者溃疡穿孔再次行光学性角膜移植术,其中1眼继发青光眼。无其他并发症发生。HE染色羊膜呈染色均一结构,18d多层羊膜排列整齐,层次清晰,角膜基质内少量炎性粒细胞浸润,羊膜表面角膜上皮化;30d多层羊膜彼此融合,层次不清,羊膜与角膜基质界限模糊,少量新生血管形成,角膜厚度均一。结论多层羊膜移植后羊膜与角膜基质可有效整合,增加角膜厚度,阻止溃疡穿孔,抑制炎症,促进溃疡愈合。     

羊膜移植联合鸡角膜缘上皮移植治疗兔全角膜表层损伤的组织学改变

目的：研究羊膜移植术和联合鸡角膜缘上皮移植（联合移植）术治疗兔全角膜表层损伤的组织学改变。方法：兔39只分为3组，每组13只。对照组，将角膜及角膜缘外3mm的表层组织去除；羊膜移植组，在去除表层组织的创面上移植羊膜；联合移植组，在羊膜移植片表面角膜缘区移植鸡角膜缘上皮。手术当天各组处死1只兔，7、28、90、105天各组处死3只兔，摘除眼球分别进行光镜、免疫组化，透射电镜及扫描电镜检查。结果：对照组：角膜紊乱，表面不平，上皮表面微绒毛稀少，基质纤维血管化。羊膜移植组及联合移植组：羊膜结构逐渐被基质胶元纤维取代和改建，基质纤维平行排列，角膜表面光滑，上皮表面微绒毛丰富，细胞之间可见桥粒连接。结论：羊膜移植术和联合鸡角膜缘移植术治疗兔角膜广泛损伤，能抑制新生血管和纤维组织向角膜生长，较快促进眼表重建。     

Histologic findings after amniotic membrane graft in the human cornea

OBJECTIVE: To describe the histopathologic findings in the human cornea several months after a stromal amniotic membrane graft. To show the clinicopathologic correlation after the graft in two cases with different follow-up times. DESIGN: Two interventional case reports with clinicopathologic correlation. PARTICIPANTS: Two patients with neurotrophic corneal ulcer unresponsive to medical treatment (one with stromal vascularization and the other without stromal vascularization). INTERVENTION: Amniotic membrane graft was performed in both patients to treat the neurotrophic ulcer. Three and 7 months after amniotic membrane grafting, a penetrating keratoplasty was needed, and the removed corneas were analyzed. MAIN OUTCOME MEASURES: Clinical and histopathologic examinations, including routine histopathologic and immunohistochemical studies. RESULTS: Complete epithelialization was observed on histologic examination over the basement membrane of the amniotic membrane graft. The amniotic membrane was slowly reabsorbed in the cornea without stromal vascularization with no inflammatory reaction produced. In the cornea that had stromal vascularization the amniotic membrane was rapidly reabsorbed because of the presence of abundant inflammatory cells. Once reabsorbed, the amniotic membrane was replaced by new fibrotic stroma, that was different from that found in the rest of the cornea but that helped to maintain corneal thickness. CONCLUSIONS: The amniotic membrane graft allows for correct epithelialization in cases of neurotrophic corneal ulcer. Once the amniotic membrane is reabsorbed, it is replaced by a new fibrotic stroma, which can reduce corneal transparency. In corneas that have no stromal vascularization, the graft may remain in the stroma for many months, compromising corneal transparency during this period.     

骨髓间充质干细胞移植治疗眼表损害的初步实验研究

目的观察体外培养的人骨髓间充质干细胞（hMSCs）移植到碱烧伤的兔角膜表面后,干细胞的成活、迁移和分化情况。方法采用NaOH溶液制作兔角膜碱烧伤模型,1个月后将培养有hMSCs的羊膜缝合到碱烧伤的兔角膜表面,以羊膜作为对照组,在裂隙灯显微镜下观察角膜的临床改变。术后1个月,摘除眼球,石蜡切片,苏木素-伊红（HE）染色观察角膜组织结构的变化,并进行抗人核抗体和细胞角蛋白12（CK12）的免疫组化染色以观察hMSCs的分布和分化情况。结果兔眼碱烧伤1个月后,角膜表面和基质层均可见大量血管,角膜呈瓷白色混浊,表面粗糙干燥,出现大量杯状细胞。hMSCs移植1个月后,角膜表面粗糙程度减轻,新生血管略有减少,但是角膜混浊未见明显改善,角膜表面杯状细胞消失;角膜表面和基质浅层存在抗人核抗体染色阳性的细胞;角膜表面细胞CK12染色阳性,而基质层未见CK12阳性细胞。对照组在羊膜移植1个月后,角膜状况较移植前无明显改善,角膜表面仍可见杯状细胞,角膜各层均未见抗人核抗体和CK12染色阳性的细胞。结论hMSCs移植到碱烧伤兔角膜表面后,能够成活并向角膜基质迁移,未发生移植排斥反应。hMSCs由于所在部位不同,可以在周围组织的诱导下向不同方向发生分化,角膜表面的细胞向角膜上皮细胞分化。而基质层中的细胞未分化为角膜上皮细胞。移植后角膜表面结膜化程度有所减轻。     

Corneal endothelial regeneration and tissue engineering

Human corneal endothelial cells (HCECs) have a limited proliferative capacity. Descemet stripping with automated endothelial keratoplasty (DSAEK) has become the preferred method for the treatment of corneal endothelial deficiency, but it requires a donor cornea. To overcome the shortage of donor corneas, transplantation of cultured HCEC sheets has been attempted in experimental studies. This review summarizes current knowledge about the mechanisms of corneal endothelial wound healing and about tissue engineering for the corneal endothelium. We also discuss recent work on tissue engineering for DSAEK grafts using cultured HCECs and HCEC precursor cell isolation method (the sphere-forming assay). DSAEK grafts (HCEC sheets) were constructed by seeding cultured HCECs on human amniotic membrane, thin human corneal stroma, and collagen sheets. The pump function of the HCEC sheets thus obtained was approximately 75%–95% of that for human donor corneas. HCEC sheets were transplanted onto rabbit corneas after DSAEK. While the untransplanted control group displayed severe stromal edema, the transplanted group had clear corneas throughout the observation period. The sphere-forming assay using donor human corneal endothelium or cultured HCECs can achieved mass production of human corneal endothelial precursors. These findings indicate that cultured HCECs transplanted after DSAEK can perform effective corneal dehydration in vivo and suggest the feasibility of employing the transplantation of cultured HCECs to treat endothelial dysfunction. Additionally, corneal endothelial precursors may be an effective strategy for corneal endothelial regeneration.     

In vitro tissue engineering of lamellar cornea using human amniotic epithelial cells and rabbit cornea stroma

AIM:To reconstruct the lamellar cornea using human amniotic epithelial (HAE) cells and rabbit cornea stroma in vitro using tissue engineering technology.METHODS: Human amnia taken from uncomplicated caesarean sections were digested by collagenase to obtain HAE cells, and the cells were cultured to proliferate. Rabbit corneal epithelial cells were removed by n-heptanol to make lamellar matrix sheets. The second passage of HAE cells were cultured on the corneal stroma sheets for 1 or 2 days, then transferred to an air-liquid interface environment to culture for 2 weeks. Tissue engineered lamellar cornea (TELC) morphology was observed by Hematoxylin-eosin (HE) staining; its ultrastructure was observed by transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM); corneal epithelial cell-specific keratin 3 and keratin 12 were detected with immunofluorescence microscopy.RESULTS:HAE cells grew on the rabbit corneal stroma, forming a monolayer after 1-2 days. About 4-5 layers of epithelial cells developed after 2 weeks of air-liquid interface cultivation, a result similar to normal corneal epithelium. Rabbit corneal stromal cells were significantly reduced after one week, then almost completely disappeared after 2 weeks. TEM showed desmosomes between the epithelial cells; hemidesmosomes formed between the epithelial cells and the basement membrane. SEM revealed that the HAE cells which grew on the lamellar cornea had abundant microvilli. The tissue-engineered cornea expressed keratin 3 and keratin 12, as detected by immunofluorescence assay.CONCLUSION: Functional tissue-engineered lamellar corneal grafts can be constructed in vitro using HAE cells and rabbit corneal stroma.     

异体角膜缘上皮细胞培养后移植的实验研究

目的观察含培养的角膜缘上皮细胞的羊膜片移植到角膜缘干细胞损伤的异体兔眼角膜上的效果。方法把羊膜为载体组织块培养的角膜缘上皮细胞移植到角膜缘干细胞损伤的异体兔眼角膜上,术后观察角膜混浊度、角膜新生血管、角膜上皮等情况,定期兔进行病理组织学检查。结果角膜缘上皮细胞在羊膜上培养16d形成3～4层,用含有培养的异体角膜上皮细胞的羊膜片移植的12只兔眼,术后第5天,损伤的角膜表面全部上皮化,第16天开始,12只兔眼逐渐出现排斥反应。结论含培养的角膜缘上皮细胞羊膜片异体移植术后早期角膜全部上皮化,晚期则出现排斥反应。