羊软骨细胞在生物反应器中的培养和扩增

[目的]探索在旋转生物反应器内，应用微载体技术快速扩增分化良好的羊软骨细胞的方法。[方法]将培养的羊软骨细胞应用Cytodex-3微载体在旋转生物反应器（RCSS）内，进行动态培养，应用倒置显微镜对微载体表面的软骨细胞进行动态观察，并对收获的软骨细胞进行Ⅰ、Ⅱ型胶原的细胞免疫化学染色分析。[结果]关节软骨细胞于1d内贴附于Cytodex-3微载体表面，细胞初期为圆球形、半球形凸起，逐渐向周围伸展，随时间的延长，贴附于微载体的细胞逐渐增多，到培养后期，细胞密度可达最初接种的15～17倍，在微载体上收获的软骨细胞经Ⅰ型胶原的免疫细胞化学染色呈阴性，Ⅱ型胶原染色则呈强阳性。[结论]利用微载体细胞培养技术可简便快速地在体外扩增羊软骨细胞，可为构建组织工程化人工软骨提供大量活性、分化良好的软骨细胞。     

多孔明胶微载体旋转培养hMSC的研究

[目的]观察利用多孔微载体结合旋转细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)培养人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cell,hMSC)对其增殖的影响。[方法]体外分离hMSC,扩增至第2代(P2)后分为两组。实验组采用多孔明胶微载体CultiSpher G在RCCS内进行动态培养,对照组则继续静止培养。应用倒置显微镜、扫描电镜对微载体表面的细胞粘附、生长情况进行观察,并在不同的时相点取样,行细胞计数、MTT检测,了解细胞的增殖情况。[结果]接种24 h后,大部分细胞贴附于微载体表面,随培养时间延长细胞数量增多并分泌大量基质。MTT检测及细胞计数提示细胞对数生长期较静止培养方法延长,达到生长高峰时旋转培养方法收获细胞总量为接种时10.75倍,而静止培养方法为3.19倍;细胞周期检测两种方法差别不大,大部细胞均处在S1期。[结论]Culti Spher G微载体旋转培养系统是体外扩增hMSC的有效方法,利用该系统可为工程化组织的构建提供大量特性稳定的种子细胞。     

自体富血小板血浆诱导兔脂肪干细胞成软骨分化的实验研究

[目的]体外分离、培养、鉴定兔脂肪干细胞,探讨富血小板血浆体外诱导脂肪干细胞成软骨分化潜能。[方法]取Ⅰ型胶原酶消化兔脂肪后,贴壁法分离培养脂肪干细胞,取第3代细胞分别予以成脂、成骨诱导,证实其多向分化潜能;同时取第3代细胞予以富血小板血浆诱导,2周后倒置显微镜观察细胞形态,行Ⅱ型胶原免疫荧光细胞化学染色、甲苯胺蓝染色和实时荧光定量PCR检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。[结果]可以从兔脂肪中培养出脂肪干细胞,成脂、成骨诱导证实其多向分化潜能。经自体富血小板血浆诱导的脂肪干细胞,其Ⅱ型胶原免疫荧光细胞化学染色、甲苯胺蓝染色均为阳性。实时荧光定量PCR检测发现经自体富血小板血浆诱导的兔脂肪干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于对照组未经诱导的兔脂肪干细胞(P<0.01)。[结论]自体富血小板血浆可以有效诱导兔脂肪干细胞表达II型胶原和蛋白聚糖,可以诱导兔脂肪干细胞向软骨细胞方向分化。     

转壁生物反应器中动态分化组织工程软骨的实验研究

目的 :在转壁生物反应器动态环境中分化骨髓间充质干细胞 (bMSC) ,制备立体组织工程软骨。方法 :穿刺吸取成年兔骨髓 ,分离扩增bMSC ,复合于纤维蛋白凝胶制成圆柱状三维组织 (细胞密度2 0× 10 7/ml) ,置于转壁生物反应器中进行分化培养 ,同时设单纯静止培养组。 5周后观测大体形态和组织学形态、Ⅰ和Ⅱ型胶原免疫组织化学表达 ,测量分化组织的细胞活力。结果 :动态培养可以有效保持材料大体形态 ,甲苯胺兰染色阳性 ,无明显Ⅰ型胶原表达 ,大量表达Ⅱ型胶原 ,人工组织的细胞活力显著高于单纯静止培养方法。结论 :转壁生物反应器培养明显改善组织工程软骨的活力 ,有利于进行三维材料体外软骨分化。     

可注射性组织工程软骨源性微载体的微观结构及其生物相容性观察

[目的]改进软骨源性微载体的制备方法.对其微观结构特征及其与骨髓间充质细胞的生物相容性进行观察,探索新的可注射性组织工程软骨的制备方法.[方法]将新鲜的猪关节软骨在液体中粉碎,梯度离心后制备成150～300 μm的颗粒,去细胞处理后采用常规组织学方法观察软骨微粒的空间结构及化学组成,采用扫描电镜观察软骨源性微载体的形态特征,随后体外获取扩增骨髓间充质细胞,与软骨微粒复合,然后采用旋转式生物反应器扩增,构建可注射性组织工程软骨细胞.[结果]本研究制备的软骨微粒呈圆形或椭圆形,表面呈毛刷状结构,主要成分是Ⅱ型胶原和GAG,而毛刷的主要成份Ⅱ型胶原、骨髓间充质干细胞不仅与微载体结合良好,还能够在其表面大量扩增.[结论]与传统的微载体不同,软骨源性微载体与细胞复合后,不需要再将细胞消化,避免了软骨细胞外基质的损失,可以作为可注射性组织工程软骨的理想材料和方法.     

去分化关节软骨细胞生物反应器培养反分化的实验研究

目的 观察体外经传代培养去分化的成人关节软骨细胞，在生物反应器培养后生物学性状的变化，探索去分化软骨细胞反分化的手段，为软骨细胞移植修复关节软骨缺损建立合适的体外培养方法。方法 无菌条件下取成人关节软骨组织，Ⅱ型胶原酶消化法（0．2％，37C，3h）分离软骨细胞，分成两组：一组常规单层传代培养，另一组添加重组人的生长因子（1ng／ml转化生长因子β1＋5ng／ml成纤维细胞生长因子2）体外培养传代大量扩增后，无微载体生物反应器内培养3周。血小板计数器行细胞计数，计算各代细胞倍增时间；细胞爬片和石蜡、冰冻切片进行HE、蕃红O、阿利新蓝染色，Ⅰ、Ⅱ型胶原和aggrecan免疫组织化学检测，观察细胞表型变化。结果 成人关节软骨细胞体外培养3代后迅速去分化，增殖缓慢。添加生长因子培养细胞去分化速度减缓；传10代，细胞扩增2000倍以上，部分去分化，但细胞扩增增殖能力仍很强；传20代软骨细胞表型基本丢失，但仍有增殖能力；置于生物反应器继续培养3周，细胞番红O染色强阳性、aggrecan和Ⅱ型胶原阳性，Ⅰ型胶原阴性，表型恢复良好。结论 软骨细胞在体外大量扩增后，在生物反应器培养，可恢复其表型，可望用于在体外培养时去分化软骨细胞的再分化。     

转化生长因子β1缓释载体诱导骨髓基质干细胞成软骨分化

目的探讨转化生长因子β1（TGF—β1）缓释对骨髓基质干细胞诱导成软骨分化的影响。方法乳化交联法制备TGF—β1壳聚糖缓释微球并将其与壳聚糖支架复合，将骨髓基质干细胞置于复合载体中立体培养，通过HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、扫描电镜观察复合载体对细胞的增殖、分化及功能的影响。结果骨髓基质干细胞于复合载体中培养，细胞形态类似软骨细胞，并可见细胞增殖及细胞外基质分泌，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示基质中有Ⅱ型胶原表达，其细胞增殖率及Ⅱ型胶原分泌功能均较对照组明显增强。结论复合载体能够控制TGF-β1的释放并保持其活性，可促进骨髓基质干细胞的增殖并诱导其向软骨细胞分化。     

脐带Wharton胶干细胞外基质的制备及其细胞相容性观察

[目的]建立制备脐带Wharton胶干细胞细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的方法并对其生物相容性进行观察。[方法]无菌条件下收集人脐带组织,采用酶消化法分离培养脐带干细胞,使用普通培养基培养7 d后,在原培养基中添加抗坏血酸,再连续培养8 d;加入含有0.5%Triton X-100和20 mM NH 4OH的PBS溶液进行脱细胞处理后,用Hoechst 33258染色观察其DNA残留,采用扫描电镜对其微结构进行观察,通过天狼星红、甲苯胺蓝、番红花O组织学染色和I型胶原、II型胶原、纤维粘连蛋白及层粘连蛋白免疫荧光染色观察微载体的主要成分;将异体脐带干细胞种植在无细胞核DNA残留的ECM上,通过MTT法观察脐带干细胞的增殖生长情况。[结果]通过本实验方法得到的天然脱细胞脐带干细胞ECM,表面无细胞及DNA残留,整体表面有细胞陷窝形成,基质紧密连接。Hoechst 33258荧光染色阴性;天狼星红、甲苯胺蓝和番红花O组织学染色阳性;I型胶原、II型胶原、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白免疫荧光染色阳性;在MTT检测细胞增殖中,种植于该ECM上的异体脐带干细胞组的OD值高于单纯平面培养组(P<0.05)。[结论]此次实验所得的脱细胞脐带干细胞外基质具有良好的生物相容性,能够为组织工程提供高质量的种子细胞,有望成为组织工程种子细胞的新型培养载体。     

应用旋转生物反应器和微载体技术体外大规模扩增人骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞 (ＭＳＣｓ)因其自身所具有的特殊性而日益受到关注[1,2 ] 。我们采用微载体技术在旋转生物反应器内扩增人骨髓间充质干细胞。一、材料与方法1.试剂 :细胞培养基ＤＭＥＭ购自美国Ｇｉｂｃｏ公司 ;旋转生物反应器购自美国Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ公司。2 .ＭＳＣｓ的分离与培养 :骨髓来源于正常献髓者 ,将人骨髓经ＤＭＥＭ稀释后用一种细胞分离液Ｐｅｒｃｏｌｌ分离 ,Ｐｅｒｃｏｌｌ分离液的比重为 10 73 ｇ/Ｌ。分离后收获单个核细胞 ,ＤＭＥＭ洗 2次 ,接种于 2 4孔板内 ,浓度为 2 .0× 10 5个 /ｃｍ2 ,各孔内加入 10 %胎牛血清 …     

血清浓度对脂肪成体干细胞向软骨细胞分化的影响

[目的]比较不同浓度的血清,在转化生长因子-β1(TGF-β1)存在的条件下,对脂肪成体干细胞(ad-ipose-derived adult stem cells,ADASCs)向软骨细胞分化的影响,探讨较为合适的血清浓度。[方法]取成年新西兰兔颈部脂肪组织,剪碎后通过Ⅰ型胶原酶消化,得到脂肪成体干细胞;稳定传代后,分别用含1?S和10?S的软骨诱导液干预ADASCs 2周,采用MTT检测方法对细胞增殖活性进行比较,应用甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色进行软骨细胞鉴定,利用Leica病理图像软件分析两组间Ⅱ型胶原免疫组化染色后的灰度,比较两组细胞分化的效果。[结果]MTT检测显示10?S组细胞增殖活性高于1?S组(P<0.05),两组细胞的甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性,并以10?S组更为显著;灰度分析提示10?S组Ⅱ型胶原表达量高于1?S组(P<0.05)。[结论]体外研究表明,含10?S的软骨诱导液更有利于脂肪成体干细胞向软骨细胞方向增殖和分化,这将为作者采用这种新型的干细胞修复软骨缺损做好前期的准备。     

脂肪间充质干细胞向髓核样细胞诱导分化的初步研究

[目的] 定向诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化为髓核样细胞,为椎间盘退变性疾病的细胞移植治疗奠定生物学基础.[方法] (1)200 g SD雄性大鼠断颈处死后,取腹股沟脂肪垫处脂肪,0.1%胶原酶消化,体外接种培养,同时采用极限稀释法纯化细胞;(2)利用流式细胞技术对细胞表面标记进行鉴定;(3)第3代细胞消化计数后,用1.2%海藻酸钠溶液悬浮,调整细胞密度至1×10~6/ml,滴入3.5%CaCl_2溶液形成微球,加入含TGF-beta1的诱导培养基,低氧条件下进行微球联合培养;(4)7 d后,取部分微球进行Alcian Blue染色并收集微球内细胞提取RNA,进行RT-PCR检测.[结果] (1)体外培养的脂肪间充质干细胞主要呈梭形和多角形,核大、核仁明显,平行排列生长或呈漩涡状生长;(2)流式细胞仪检测显示Sca-1、CD44的阳性率分别为95.2%、99.7%,CD45、CD11b的阳性率分别为0.4%、1.5%;(3)微球联合培养7 d后,Alcian Blue染色表明,实验组细胞外基质的生成明显多于对照组;(4)RT-PCR结果证实,髓核细胞标志基因和软骨细胞标志基因的表达,实验组明显高于对照组.[结论] (1)本实验方法可以获得大量均一的脂肪间充质干细胞;(2)脂肪间充质干细胞可以被定向诱导分化为髓核样细胞;(3)首次探讨了将脂肪间充质干细胞体外诱导后移植治疗椎间盘退变性疾病,为椎间盘退变性疾病的干细胞移植治疗提供了新的思路.     

生长分化因子5促进软骨细胞肥大成熟的实验研究

[目的]探讨生长分化因子5(GDF-5)在诱导成人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成软骨分化的同时,促进其肥大成熟的作用.[方法]体外分离培养hBMSCs,取第四代细胞实验.将细胞消化、悬浮,以5×106/ml的细胞密度进行高密度培养,分别用含0.500ng/ml GDF-5的软骨诱导液(CM)诱导培养3、4周.免疫组化、甲苯胺蓝染色检测Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和蛋白多糖的表达情况.荧光实时定量RT-PCR检测两组微团Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和蛋白多糖mRNA的表达情况.[结果]实验组微团中的细胞体积较对照组稍大,细胞密度稍低.甲苯胺蓝和免疫组化染色结果显示各组微团均有Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和蛋白多糖的表达和分泌,且4周实验组的表达最为强烈.荧光实时定量RT-PCR检测示,干预后3周实验组Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因表达量明显高于3周对照组(P＜0.05),但Ⅹ型胶原基因表达与对照组相比无显著性差异(P＞0.05);干预后4周实验组Ⅹ型胶原基因表达高于其余各组(P＜0.05),Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因表达明显高于两对照组(P＜0.05),但与3周实验组相比较,差异无统计学意义(P＞0.05).[结论]GDF-5在诱导细胞成软骨分化的同时,还可促进其成熟肥大.     

胰岛素样生长因子-1基因转染脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的研究

目的 观察胰岛素样生长因子(IGF)-1基因转染的脂肪间充质干细胞(ADSCs)向软骨细胞分化的效果.方法 原代培养兔ADSCs,免疫荧光法检测细胞表面抗原CD44、CIM9;脂质体介导人IGF-1基因转染兔ADSCs联合低浓度血清培养基向软骨细胞分化诱导,RT-PCR及Western blot方法检测IGF-1的表达,MMT法绘制细胞增殖曲线、甲苯胺蓝染色软骨结节、免疫组织化学检测Ⅱ型胶原的表达.结果 脂肪间充质干细胞CD44、CD109表达阳性,基因转染后细胞IGF-1表达阳性,细胞增殖速度增快,出现软骨结节,Ⅱ型胶原表达增高.结论 从脂肪组织中能够分离出增殖旺盛的ADSCs,IGF-1在ADSCs内获得稳定表达,细胞增殖能力增强,促进其向软骨细胞分化.     

Gene and Protein Expression During Differentiation and Matrix Mineralization in a Chondrocyte Cell Culture System

Endochondral bone formation occurs through a series of developmentally regulated cellular stages, from initial formation of cartilage tissue to calcified cartilage, resorption, and replacement by bone tissue. Nasal cartilage cells isolated by enzymatic digestion from rat fetuses were seeded at a final density of 10⁵ cell/cm² and cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 10% fetal calf serum in the presence of ascorbic acid and β-glycerophosphate. First, cells lost their phenotype but in this condition they rapidly reexpressed the chondrocyte phenotype and were able to form calcified cartilaginous nodules with the morphological appearance of cartilage mineralization that occurs in vivo during endochondral ossification. In this mineralizing chondrocyte culture system, we investigated, between day 3 and day 15, the pattern expression of types II and X collagen, proteoglycan core protein, characteristic markers of chondrocyte differentiation, as well as alkaline phosphatase and osteocalcin associated with the mineralization process. Analysis of labeled collagen and immunoblotting revealed type I collagen synthesis associated with the loss of chondrocyte phenotype at the beginning of the culture. However, our culture conditions promoted extracellular matrix mineralization and cell differentiation towards the hypertrophic phenotype. This differentiation process was characterized by the induction of type X collagen mRNA, alkaline phosphatase, and diminished expression of type II collagen and core protein of large proteoglycan after an increase in their mRNA levels before the mineralizing process. These results revealed distinct switches of the specific molecular markers and indicated a similar temporal expression to that observed in vivo recapitulating all stages of the differentiation program in vitro. Received: 12 December 1996 / Accepted: 26 June 1997     

Low calcium levels in serum-free media maintain chondrocyte phenotype in monolayer culture and reduce chondrocyte aggregation in suspension culture

OBJECTIVE: Extracellular calcium influences chondrocyte differentiation and synthesis of extracellular matrix. Previously, calcium concentrations ranging from 0.1 mM to 2 mM have been used in vitro and these studies indicated that low calcium concentrations were generally favorable for chondrocyte culture. Our objective was to extend these findings to yet lower calcium concentrations and to comprehensively examine effects on morphology and phenotype in two culture systems. METHODS: Serum-free media containing 1 mM, 50 microM or 15 microM of calcium and a serum-containing medium were used to culture chondrocytes in suspension and in monolayer, at high and low inoculation density. RESULTS: In monolayer, at low and high density, removing serum and decreasing calcium concentration decreased cell spreading and lowered collagen type I expression whereas collagen type II expression remained stable. In suspension, cells aggregated for all media tested; however, aggregates were smaller and looser in the absence of serum. CONCLUSION: The serum-free 50 microM and 1 mM calcium media provide good alternatives to classical media for monolayer culture since both growth and chondrocyte phenotype were maintained. In suspension culture, the serum-free 1mM calcium medium also possesses the beneficial properties of limiting aggregate size while maintaining growth and phenotype.     

Microcarrier enhanced survival of human and rat fetal ventral mesencephalon cells implanted in the rat striatum

The transplantation of tissue containing dopamine-producing cells into the mammalian central nervous system is an emerging treatment for Parkinson's disease, despite relatively poor survival of implanted tissue. Recent evidence has suggested that Cytodex microcarriers enhance the survival of dopaminergic rat chromaffin cells transplanted into the rat striatum in the absence of immunosuppression. The current study was undertaken to evaluate the survival of rat and human fetal ventral mesencephalic neurons (VM) implanted alone or after attachment to microcarriers in the striatum of rats without immuno suppression. Rat fetal VM neurons demonstrated enhanced survival in the rat striatum when transplanted on microcarriers, compared to their transplantation alone during the 3-mo period examined in the present study. Transplants of human fetal VM neurons on microcarriers also survived remarkably well in the rat striatum without systemic immunosuppression. In contrast, human fetal VM cells transplanted alone into the rat striatum did not survive without systemic immunosuppression. There was no evidence of TH fiber sprouting in the vicinity of any transplant site. These data indicated that Cytodex microcarriers provide enhanced survival of both rat allograft and human xenograft fetal mesencephalic cells in the rat striatum without the necessity of systemic immunosuppression, perhaps by inducing a unique neuron-glia environment.     

两种诱导方法对去分化软骨细胞II型胶原的诱导

目的用两种不同的诱导方法使去分化的永生化软骨细胞第50代重新表达软骨细胞的Ⅱ型胶原标志性表型。方法利用NA无血清诱导培养法以及离心管聚集体诱导培养法分别诱导培养去分化的永生化人关节软骨细胞第50代,继用I、II、III型胶原的免疫组化染色、II型胶原的RT-PCR检测、胶原定量检测该永生化软骨细胞的II型胶原表型表达情况。结果NA无血清诱导培养法和离心管聚集体诱导培养法均能成功诱导去分化永生化人关节软骨细胞的II型胶原表达,但二者促进II型胶原分泌并无显著差异。结论去分化永生化人关节软骨细胞可以经不同的诱导方法而重新表达II型胶原表型,无血清诱导培养基与离心管聚集体培养法都能使II型胶原重新表达。