登革2型病毒深圳分离株的鉴定及E基因序列分析

分支上,核苷酸同源性最高,达99.8%,氨基酸同源性为100%,与Indonesia-76、Somalia-84和Sri Lanka-90同属基因Ⅳ亚型.结论 首次从深圳市登革热患者血清中分离到1株登革2型病毒,证实该毒株可能来源于马来西亚.     

福建口岸输入登革I型病毒E基因序列分析

目的研究分析福建口岸输入登革I型病毒E基因序列,为登革热诊断的分子溯源提供参考。方法收集2012—2013年福建口岸截获的7例入境Ⅰ型登革热病例资料及血清标本,用C6/36细胞培养分离病毒,提取病毒RNA,用RT-nested-PCR扩增包含E基因全长的核酸片段,扩增产物经纯化、测序,用生物学软件进行DNA序列比对分析。结果用C6/36细胞从7例登革热病例血清中成功分离出7株登革病毒株,经RT-nested-PCR证实均为DENV-Ⅰ型,构建E基因全长进化树分析发现,分离株与新加坡、越南和菲律宾等地的病毒株同源性最高,与病例入境时进行的流行病学调查资料完全吻合。结论从分子水平证明登革热病例血清中分离到的毒株为DENV-Ⅰ型病毒,结合流行病学调查资料,证实均为输入性感染病例,最有可能来源于东南亚一带。     

登革4型病毒广东流行株NS2a-NS2b基因序列分析

目的分析登革4型病毒(DV4)广东株的基因序列，比较其同源性，追查DV4的地理来源。方法RT—PCR扩增DV4 NS2a—NS2b基因片段，克隆至PGEM T载体，分析其序列。结果1990年分离的4个毒株在所分析的区段具有相同的序列，与DV4H241、814669株、1978年广东株(GD785682)和1993年广东株(GZB5)的核苷酸(氨基酸)同源性分别是97％(98％)、94％(96％)、93％(98％)和99％(98％)。GD785682株与DV4H241、814669株和1993年广东株(GZB5)的核苷酸(氨基酸)同源性分别是93％(98％)、96％(97％)和98％(93％)。结论1990年引起广东省登革热流行的毒株很可能只有1个，1990年的毒株与1978年的毒株可能来自不同的疫源地。     

广东省中山市登革Ⅰ型病毒的分离鉴定及E/NS1基因序列分析

目的分离鉴定中山市2007年及2012年流行的登革病毒,从分子水平分析其地域来源和系统进化情况。方法用C6/36细胞分离10份2007年登革病毒特异性IgM抗体阳性血清和4份2012年登革病毒核酸阳性血清中的病毒,采用Real time-PCR对毒株进行血清型鉴定,RT-PCR扩增毒株E/NS1基因并进行序列测定,分析其与不同区域流行株和国际标准株的同源性和系统进化情况。结果共分离鉴定到6株登革I型病毒,其中2株为2007年流行株,4株为2012年流行株,分别命名为2007ZSDengue1-2和2012ZSDengue1-4。2012ZSDengue1-2与柬埔寨、越南等东南亚国家近年流行的登革I型毒株相似性高(大于99.0%),进化距离最短(0.011~0.012)。2012ZSDengue3-4,2007ZSDengue1-2与广东省珠海市2007年流行和新加坡、日本、泰国等亚洲国家近年流行的登革I型毒株相似性高(大于99.0%),进化距离最短(0.007~0.024)。中山流行株与登革I型国际标准株、非洲和美洲流行株相似性在90.0%~94.0%之间,进化距离较远(0.065~0.108);与登革Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型国际标准株NGC、H87、H241相似性约为68.0%、66.0%、71.0%,进化距离最远(0.369~0.505)。结论中山市2007年及2012年流行株为登革I型病毒,可能属于东南亚国家输入性毒株,但输入源头有所不同。     

登革3型病毒07CHLS001株全基因组序列测定和分析

目的对登革3型病毒浙江分离株07CHLS001进行了全基因组序列测定和分析，为探讨其基因组特征和来源提供依据。方法根据登革3型病毒98TW407株设计22对引物，利用RT-PCR法扩增出07CHLS001株基因组不同区段的eDNA片段，通过序列测定和拼接获得其全基因组序列。结果07CHLS001株基因组全长10707 nt，包含一个开放读码框（95-10 267nt），编码3390个氨基酸。它与登革3型病毒ThD3-1687-98株、98TW407株和80-2株的全基因组序列核苷酸相似性依次为98．7％、98．5％和94．6％。prM／M-E核苷酸序列系统发生树分析表明，07CHLS001与来自泰国的5个株系形成了一个Bootstrap支持率为90％的分枝。结论07CHLS001属于登革3型病毒的亚型Ⅱ。07CHLS001株全序列的测定，对进一步研究该株系的特性有十分重要的意义。     

广州市2010年登革4型病毒的分离及其E基因进化分析

登革病毒(DEN)E蛋白在病毒与宿主细胞融合和诱导机体产生抗体等过程中发挥重要作用[1].本研究通过对分离株E基因全序列测定,从分子水平确定其型别,并与广州市历年同型DEN流行株及相关国际流行株进行同源性比较,构建系统进化树,追踪其可能输入来源.     

3株登革病毒1型广东分离株NS 1基因序列测定

登革热 (Ｄｅｎｇｕｅｆｅｖｅｒ ,ＤＦ)是一种急性虫媒传染病 ,严重者表现为严重的登革出血热或登革休克综合征 ,后者死亡率可达 5 %。广东省自 1978年以来 ,先后有 10多次登革热暴发流行。目前认为 ,我国登革热为传入性 ,但登革热的病原登革病毒 (ＤＶ)流行株的来源还不明确。我们通过测定我国广东省ＤＦ病人血清中分离的 3株ＤＶ - 1的ＮＳ 1基因序列 ,比较其核苷酸及其编码氨基酸的差异 ,探讨 1999、1997和 1995年在广东流行的登革热的可能来源。1　材料和方法　 (1)材料 :试剂为ｐＵＣｍＴ载体、3ＳＧｅｌＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉ…     

疏水性区域及稀有密码子对登革2型病毒E基因原核表达影响的分析

登革病毒E蛋白是病毒主要毒力蛋白,带有型特异及属特异抗原决定簇,既能诱导宿主产生保护性的中和抗体,又能诱导产生血凝抑制抗体,与登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)的致病机制有关[1].有学者已经利用包括大肠埃希菌、毕赤酵母、昆虫细胞等多种表达系统对其表达条件进行了探讨,由于受未知因素的影响,登革病毒E蛋白的原核重组表达一直不理想[2～4].本研究对登革病毒E蛋白不同区域的原核表达进行了较为系统的分析,探讨疏水性区域及稀有密码子登革病毒E蛋白表达的影响,并对部分区域进行了高效原核表达.广东省科技计划项目(20006836008005);全军医药卫生科研基金资助课题(06MA129)     

登革2型病毒浙江分离株的鉴定与分子流行病学研究

目的 为了对2004年浙江省报告的输入性疑似登革热病例查明病因，从分子水平分析流行毒株的生物学特征，追踪传染源，为疾病的预防控制提供实验室依据。方法 对疑似患者血清标本采用ELISA、IFA和荧光RT—PCR方法分别检测登革病毒IgM、IgG抗体和病毒核酸，并用C6／36和BHK-21细胞分离登革病毒。采用RT—PCR方法扩增病毒E基因和NS1基因后分别进行序列测定，并与不同国家和地区的登革热毒株进行同源性和进化树分析。结果 从患者血清中检测到登革病毒IgM、IgG抗体和登革2型病毒核酸，并分离到登革2型病毒；浙江省登革2型病毒分离株（ZJ／01／04）与登革2型国际标准株Jamaica、国内Fujian／10／99株和Saudi／92株在E基因上氨基酸的同源性分别为97．1％、99．2％和99．6％，而与登革1、3、4型毒株相同区域氨基酸同源性分别为68．7％、66．9％和63．6％。基因进化树显示ZJ／OI／04分离株与Saudi／92株亲缘关系最近，在进化树的同一分支上。结论 从病原学、血清学和分子生物学特征上均证实该输入病例是由登革2型病毒引起，该毒株最有可能来源于沙特阿拉伯。     

广东省江门地区登革病毒分离株的鉴定及结构蛋白序列分析

目的：对广东省江门地区2001年夏、秋季一批发热、出疹患者进行确诊，并从分子水平分析流行株的可能来源。方法：分别采用免疫荧光、细胞毒力、乳鼠毒力实验以及逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）技术进行病毒鉴定，并对其结构蛋白基因序列进行克隆、测序及同源性搜索。结果：37份患者血清登革病毒（DV）IgM抗体阳性率为97％（36／37），IgG抗体阳性率为59％（22／37），最高抗体滴度均可达1：640。所得病毒可致C6／36细胞病毒，具有乳鼠神经毒力；其结构基因序列长度为2325bp，编码774个氨基酸；与其他登革2型病毒株TSV01、GD06／93、NGC、44、ThNH、04'GD08/98及S1进行比较，其核酸序列同源性（％）分别为98、96、94、94、92、92、92、91。结论：2001年江门地区登革热流行为登革2型病毒感染所致，推测其可能是输入性传染。     

Molecular characterization of the E gene of dengue virus type 1 isolated in Guangdong province, China, in 2006

We determined the genetic relationships and origin of the dengue virus (DENV) responsible for an outbreak of dengue fever (DF) in Guangdong province, China, in 2006. Five DENV type 1 (DENV-1) isolates were obtained from human serum samples collected from DF patients during the outbreak. The nucleotide sequences of the E (envelope) gene were compared with those of 48 previous DENV-1 isolates: 18 from Guangdong province, one from Fujian province, one from Zhejiang province, and 28 from other countries in the South Asian region. The results suggested that four DENV-1 isolates identified in Guangdong province in 2006 might be in general circulation there, although these DENV-1 viruses may have been originally introduced into the province from other countries. In contrast, one isolate from Guangzhou city in 2006, may have been introduced by a recently imported case from Cambodia.     

浙江省不同宿主来源狂犬病病毒N基因分子特征分析

目的 测定浙江省不同宿主（人、鼬獾、犬）来源的狂犬病病毒街毒株N基因序列, 分析病毒遗传变异特征及其与流行的关系。方法 采用直接免疫荧光试验和反转录聚合酶链式反应检测狂犬病病毒阳性标本N基因核苷酸序列, 利用生物信息学软件分析基因序列和编码蛋白。结果 共获得浙江省2 个人源、5 个鼬獾源和11 个犬源狂犬病病毒街毒株N基因核苷酸序列, 18 个核苷酸和氨基酸序列同源性在89.7%～100.0%和98.4%～100.0%, N蛋白一级结构上绝大部分为稳定区域, 编码基因的核苷酸变异多为无义突变, 系统发育分析显示18 个街毒株均属于传统的基因1 型。结论 浙江省不同宿主来源狂犬病病毒的流行具有地域性特征, 同类宿主动物病毒株或来自同一县域/相邻县域的毒株在地理位置上最为近缘, 但人源株病毒更具有复杂性。浙江省狂犬病病毒街毒株的流行具有通过犬向鼬獾和人传播, 并在犬、鼬獾中跨区域循环传播的特点。     

广东省麻疹病毒血凝素基因的序列分析

目的 探讨广东省麻疹病毒的基因型别和特征。方法 对2000年和2001年分别在广东省中山和韶关地区分离的两株麻疹病毒，通过RT－PCR方法扩增麻疹病毒血凝素（H）基因全序列，并克隆pMD18-T Vector进行序列测定；并分析这两株麻疹病毒和Genbank中麻疹病毒的各基因型代表株序列的同源性。结果 两株广东麻疹流行株H基因之间同源性为97％，和它们在核苷酸水平上同源性最高的毒株分别是China93-4和China94-7，达到99％。和其它已知麻疹病毒的21个基因代表株相比，广东省麻疹毒株在核苷酸水平上最大变异为7．0％，其中广东省2000年流行株在氨基酸240位由丝氨酸（S）突变成天门酰胺（N），造成一个N型糖基化位点丢失。结论 广东省麻疹流行株属于H1基因型。     

广东省流行的3株登革热2型病毒基因组全序列测定及分析

目的测定广东省3株登革热2型病毒的全序列,探讨其来源及基因型。方法运用RT PCR法扩增来自广东省的登革热2型GD09/93、GD05/98和GD19/2001病毒株的全序列,采用遗传距离法构建进化树。结果3株登革热2型病毒的全基因组长度均为10 723 nt,5′及3′端各有一非编码区,结构基因和非结构基因位于基因组97~10 269 nt之间,共编码3391个氨基酸,读码结构完全相同。GD05/98与GD09/93、GD05/98与GD19/2001、GD09/93与GD19/2001之间的碱基序列同源性分别为93.3%、92.4%和97.6%,氨基酸序列同源性分别为96.7%、96.5%和98.5%。结论3株登革热2型病毒均对乳鼠致病,与对乳鼠不致病的参考株（DEN2-04株）比较共有18个氨基酸位点的差异引起极性或电荷变化,PrM-134、NS2A-153、NS4B-102所带电荷的变化对抗原性影响较大。GD05/98株与泰国分离株同为Ⅱ基因型,GD09/93和GD19/2001株与印度尼西亚、澳大利亚、台湾株分在Ⅳ基因型;表明我国登革热2型病毒有不同的基因型,而不同时期也存在同一种基因型传播。     

深圳登革热患者血清中2型病毒株的分离鉴定

目的:对深圳市2004年-2006年登革热病原体进行分离鉴定。方法:采用酶链免疫吸附试验和胶体金免疫层析法检测疑似登革热患者血清中的特异性IgM、IgG抗体。用C6/36细胞对早期病例血清进行病毒分离,以MGB荧光PCR方法鉴定。并用逆转录-半套式PCR(RT-semi-nested-PCR)方法和荧光PCR方法对其进行型别鉴定。结果:从10份抗体阳性的病人血清标本中成功分离到一株登革病毒,经鉴定为登革2型病毒,将其命名为DEN2-SZ0521。结论:首次从深圳市登革患者血清中分离到一株登革2型病毒,为进一步研究和控制该地区登革热提供了科学依据。     

DEN-2分离株E基因部分序列原核蛋白表达

目的 通过构建登革2型病毒(DEN-2)临床分离株(B株)E基因区1-476bp的原核表达载体,进行原核表达,为DEN-2E蛋白功能的研究提供基础依据。方法 将DEN-2B株E基因区部分序列克隆入原核表达载体pET28a(+),命名为pET28a(+)-Eb;经酶切、PCR及测序鉴定后转化BL21(DE3)菌株,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹(Western blot)鉴定表达蛋白;对表达蛋白进行纯化,并滴定对C6/36细胞的细胞半数致死量(TCID50)。结果 成功构建了pET28a(+)-Eb原核表达重组质粒;SDS-PAGE分析表明,E基因区部分序列获得高效表达,其相对分子量约为23kDa,表达量约占菌体总蛋白的29%;Western blot表明,该目的蛋白可与DEN-2鼠单克隆抗体结合。用Ni柱亲和层析法纯化原核表达蛋白,纯度达90%。DEN-2B株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞的TCID50为10-5.31。结论 pET28a(+)-Eb可在BL21(DE3)菌株中高效表达;DEN-2B株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞有明显的细胞毒作用。     

广州市2010-2019年4型登革热病例流行特征及其病毒E基因

目的  了解2010-2019年广州市4型登革热病例的流行病学特征和4型登革病毒的分子生物学特征。方法  2010-2019年,收集广州市登革热病例相关资料及血清标本,使用RT-PCR法检测血清标本并分型,对4型登革热病例标本进行登革病毒包膜(envelope, E)蛋白基因序列测定,并进行进化树构建及基因重组分析。结果  2010-2019年,广州市共报告43 174例登革热病例,其中23例为4型登革热病例。4型登革热病例仅分布在5个区,曾在2010年出现本地流行。广州市的4型登革热输入病例主要来自东南亚国家,病毒E基因序列与东南亚国家的序列有较高相似性,病毒基因型归属于印度尼西亚基因型和东南亚基因型,未检测到基因重组。结论  应加强对广州市4型登革热病例流行状况和输入病例的监测和关注,并进一步加强对东南亚回国人员登革热常识和个人防护的健康宣传。某些区需要预防出现4型登革病毒的扩散和蔓延。登革病毒基因型转换并未引起登革热在广州市流行强度的变化,有待进一步的观察和研究其是否会发生重组。