人源抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体的构建

目的构建以人HBsAg单链抗体(HBScFv)为导向作用、α干扰素为治疗作用的融合蛋白酵母表达载体pPICZ-αB/ScFv-IFN-α。方法通过重叠PCR构建目的蛋白质基因,再亚克隆到酵母表达载体pPICZαB中,DNA测序后,转化巴氏毕赤酵母宿主菌GS115 ,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定重组酵母,重组酵母经甲醇诱导后,通过SDS PAGE分析鉴定表达产物。结果DNA测序结果显示构建的目的基因片段(HBScFv IFN-α)的序列与原设计序列相符合;菌落PCR结果显示目的基因已整合到酵母菌中;诱导表达后,SDS PAGE结果显示在相对分子质量约4 4 0 0 0处可见目的蛋白质表达带。结论成功构建了抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体     

抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2融合蛋白的构建与序列测定

目的:构建以人抗乙肝表面抗原（HBsAg）单链抗体（ScFv）为导向作用,白细胞介素-2（IL-2）为治疗作用的融合蛋白原核表达载体pQE 40/ScFv-IL-2。方法:应用PCR技术将抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2在分子水平上进行基因重组,构建中间载体pGEM7Zf（+）/ScFv-IL-2,经酶切鉴定及序列测定正确后,将目的基因片段克隆到pQE 40表达载体中,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量约4.3×104Da处,可见蛋白表达带。以鼠抗人IL-2单克隆抗体经免疫印迹验证,该表达蛋白为所设计的融合蛋白。结论:融合蛋白ScFv-IL-2的成功构建及表达,为融合蛋白的纯化和研究开发新型的乙肝导向治疗的基因工程药物打下良好的基础。     

人源抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达

目的：探讨抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母(P．Pastoris)中的表达以及初步的纯化、活性鉴定方法。方法：用PCR将目的蛋白基因从质粒PGEM7Zf( )-HBScFv-IL-2上扩增出来，再亚克隆到酵母表达载体pPICZaA中，转化P．Pastoris宿主菌GS 115，菌落：PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定转化子，重组酵母经甲醇诱导后，通过SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定表达产物；再通过亲和层析法纯化目的蛋白；用间接ELISA实验鉴定其活性。结果：表达的重组蛋白分子质量约为44ku，表达量可达12％；纯化后凝胶成像分析目的蛋白的纯度达到95％；重组融合蛋白能与HBsAg、鼠抗IL-2单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建了抗HBsAg单链抗体与IL-2融合蛋白酵母表达工程菌，并初步建立了对目的蛋白的纯化及活性鉴定方法。     

抗EGFR/抗KDR双特异性单链抗体的构建及表达

针对EGFR或VEGFR信号通路的相互作用导致的耐药性,为增强抗EGFR或抗VEGFR2抗体单独使用疗效不佳的癌症的治疗效果,本文利用重叠PCR将抗人EGFR胞外区单链抗体基因scFv-E10和抗人VEGFR2(KDR)的单链抗体基因scFv-AK404R融合在一起,得到抗EGFR/抗KDR双特异性单链抗体(bispecific single-chain diabody,scDb)基因,scDb的连接肽序列为15个氨基酸(G4S)3,在肽链的C端引入His标签及myc标签。将scDb基因连接入载体pHEN2,转化大肠杆菌HB2151并诱导表达,经镍柱纯化获得电泳纯scDb蛋白,产量约为570μg.L 1发酵液。ELISA测定显示,scDb与EGFR胞外区的结合与亲本scFv-E10相当,与KDR胞外区的结合略低于亲本scFv-AK404R,表明抗EGFR/抗KDR scDb可与EGFR和KDR两种抗原特异性结合,可用于进一步的抗肿瘤活性研究。     

抗幽门螺旋菌单克隆抗体的研制及临床应用

抗幽门螺旋菌单克隆抗体的研制及临床应用０５００８１中国人民解放军空军石家庄医院赵满仓，刘菊林，贾艳岩，段雪梅幽门螺旋自（ＨＰ）是一种常见的引起胃粘膜病变的致病菌，它是１９８３年由Ｗａｒｒａｎ和Ｍａｒｓｂａｌｌ首先从胃粘膜组织中培养得到的［１］．此菌与...     

PCR定点诱变改造低效价抗胶质瘤单克隆抗体的初步报告

目的：抗胶质瘤单克隆抗体建株初期效价为1：10^5,经长期传代培养后效价下降至低于1：10^4,为探索其分子机制并将其改造为有活性的单链抗体,为构建靶向基因转移载体奠定基础。方法：通过RT－PCR克隆该单抗可变区基因,发现轻链可变区CDR1区出现一终止密码子,为此利用PCR定点诱变技术将其突变为该亚组相应的氨基酸,进一步构建单链抗体表达载体,并在大肠杆菌表达。结果：改造后的单链抗体能高效表达,Western blot和免疫荧光证实能与相应的膜抗原特异结合。结论：成功地改造并构建单链抗体,可用于胶质瘤靶向基因治疗。     

抗超氧化物岐化酶单克隆抗体制备及免疫学特性分析

目前国内多采用化学法和化学发光法来检测超氧化物岐化酶(SOD)的活力,而直接应用SOD单克隆抗体(McAb)ELISA双抗夹心法来检测其活性单位的报道还甚少。本文应用细胞杂交瘤技术,成功制备出了抗SODMcAb,并对其免疫学特性进行了分析,现介绍如下: 1 材料与方法 1.1 SOD:购自北京化学试剂公司。 1.2 人SOD、牛SOD、羊SOD:本室自制。取人、牛、羊的红细胞,分别用生理盐水洗四次,加等量蒸馏水使其溶血,缓慢加入0.4体积的-30℃三氯甲烷/乙醇液(3:5混合),再加入0.1体积蒸馏水,离心,收     

抗钙调素单克隆抗体的制备及开发利用

目的：抗钙调素单克隆抗体的制备及开发利用。方法：以碳化二亚胺法将钙调素-卵清蛋白偶联物作为免疫原，采用常规免疫方法免疫BALB/c小鼠，杂交瘤技术制备抗牛脑钙调素单克隆抗体。酶联免疫吸附法(ELISA)检验，应用硫酸铵盐析法进行了抗体的纯化。结果：采用免疫印迹、免疫酶斑点法及液相竞争法鉴定了抗钙调素单克隆抗体的性质，表明该抗体对钙调素有较强的特异性。结论：此研究制备出的高特异性、高亲和力及高效价的抗牛脑钙调素单克隆抗体可用于胞外钙调素促进皮肤创伤修复的基础研究，也可用于免疫学定量分析、免疫学定位分析及共沉淀分析，具有较好的经济价值。     

重组人抗HBsAg单链抗体工程菌的中试发酵工艺研究

目的研究表达重组人抗HBsAg单链抗体工程菌的中试发酵工艺。方法首先采用摇瓶培养,对培养基配方、pH值、诱导表达时机和诱导剂量进行优化,确定基本发酵参数,然后在30L发酵罐上进行中试规模发酵培养。结果在摇瓶培养时,发现含有甘油和微量元素等成分的改良培养基效果明显优于LB培养基和2×YT培养基,另外,工程茵的最佳pH值为7.0,最佳诱导时机为对数中期,最佳诱导剂浓度为0.4mmoL/L异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖,最佳诱导时间为4h,将摇瓶培养确定的关键参数应用到30L发酵罐中,控制溶氧大于30%,进行3批发酵试验,发现发酵产物的湿菌产量可达58-61.9g/L,目的蛋白质表达量可达28.9%-31.2%以上。结论建立了工程菌M15[pQE-scFv]的中试发酵工艺,为进一步开发打下良好基础。     

肿瘤抑制蛋白质P53单克隆抗体的制备及其免疫活性分析

目的制备可特异性地识别肿瘤抑制蛋白质P53的单克隆抗体。方法应用重组人野生型P53蛋白为免疫抗原,采用经典的细胞融合技术制备单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白;ELISA测定抗体滴度。纯化的抗体作用于含有不同p53基因型的MDA-MB-231〔p53(mutant)〕和〔H1299,p53(null)〕肿瘤细胞系,Western印迹、免疫组化和免疫荧光染色法检测抗体与内源性P53蛋白的结合特异性。结果对筛选到的3株单克隆抗体1P15,2P37和3P40,进行了亲和层析技术纯化。SDS-PAGE结果显示,纯化后的3株抗体纯度均在90%以上;ELISA滴度测定结果显示,3株单抗的滴度均在1∶6000以上。免疫印迹结果表明,3株抗体在p53检测中具有较高的灵敏度,其中3P40的灵敏度最高,可以达到5 ng。Western印迹、免疫组化以及免疫荧光染色结果显示,抗体与细胞内源性P53蛋白的结合特异性,说明3P40可以特异性地结合细胞总蛋白提取物以及细胞中内源性P53蛋白,而在检测不表达P53蛋白的细胞系样品时,没有非特异性结合。结论成功制备3株对P53具有高亲和力的单克隆抗体,其中3P40的抗体滴度和灵敏度最佳。     

金葡菌肠毒素SEC2的抗体制备及应用

生产厂家以金葡菌肠毒素C2(SEC2)的标示量作为金葡素注射液的质量控制标准，但其真正的含量由于滤液成分复杂而很难检测，本实验试图建立一种方便的鉴定金葡素注射液中的SEC2的方法。首先将重组的SEC2分别免疫BALB/c小鼠和新西兰兔，制备并纯化了单克隆及多克隆抗体。采用自制的抗体建立了检测SEC2的生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附实验，检测目标蛋白的质量浓度范围为2～20 ng·mL^-1，在检测范围内检测值的平均变异系数为5.08%，采用本法检测质量浓度分别为100 ng·mL^-1的重组肠毒素(SEA/SEO/SEM/SEN/SEG/SEI)，均呈现阴性反应，说明此检测方法的专一性较好。采用此方法对金葡素注射液中的SEC2含量进行了检测，发现SEC2标识量与实际含量存在一定的差距。     

抗重组人骨唾液酸蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的研制重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法以纯化的rhBSP免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗rhBSP mAb;用亚型鉴定试剂条鉴定IgG亚类;ELISA鉴定mAb的特异性和效价。结果获得2株能稳定分泌特异性mAb的抗rhBSP的杂交瘤细胞系AHB1和AHB5,Ig亚类分别为IgG2a和IgG1,轻链均为κ型,其效价分别为1×10-3和1×10-7。腹水mAb经Protein A亲和色谱柱纯化后,纯度达92%以上。结论获得抗rhBSP的mAb,为进一步研究BSP的生物学功能和用于临床诊断实验研究创造了条件。     

海洋硫酸多糖类药物聚甘古酯单克隆抗体的制备及其特性研究

目的制备和纯化聚甘古酯(911)单克隆抗体,为911药代动力学的免疫学方法的建立提供依据。方法 用还原胺化法,制备911-BSA和911-HSA复合物,间接ELISA法检测抗体生成。以Isostrip^TM试剂盒测定抗体亚型,流式细胞仪测定DNA含量。结果获得了一株阳性杂交瘤细胞DD3,腹水效价可达1×10⁵,其抗体亚型为IgG2a(κ),细胞株的DNA含量约为脾细胞和NS-1细胞之和,亲和力常数为2.0×10⁸ L·mol^-1。结论本实验制备了特异性针对911的单克隆抗体DD3,且与内源性多糖和褐藻酸无交叉反应,为911药代动力学的免疫学检测提供了依据。     

小鼠Metrnl单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备抗小鼠Metrnl单克隆抗体,并进行初步筛选鉴定。方法 分别制备小鼠Metrnl多肽片段和全长蛋白作为免疫小鼠抗原,取免疫后小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞,并亚克隆获得稳定细胞株,制备腹水。用ELISA方法检测腹水抗体效价;用Western blot方法鉴定抗体。结果 由14种多肽抗原制备的56株单克隆抗体中,未筛选出可用于Western blot识别Metrnl的抗体;由全长蛋白制备的25株抗体中,有12株可识别Metrnl蛋白。结论 本实验成功制备了12株单抗,可用于识别检测小鼠Metrnl蛋白。     

抗哇巴因单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗哇巴因单克隆抗体。方法以半抗原哇巴因与蛋白质载体卵清蛋白(OVA)的耦联物为抗原,免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,获得两株分泌抗哇巴因的单克隆抗体的细胞株(OUA1,OUA2)。结果两株细胞染色体数目均为100条左右,证实为杂交瘤细胞;所分泌抗体为小鼠IgG1亚类;小鼠腹水效价测定分别为5×106,8×106;和地高辛交叉反应率分别为1.342%和2.323%;ELISA相加试验表明,两株单克隆抗体可能针对同一抗原决定簇。结论成功制备出小分子物质哇巴因的单克隆抗体。     

人绒促性素单克隆抗体的制备与分离纯化

目的制备人绒促性素(hCG)单克隆抗体。方法hCG抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1融合,间接ELISA法筛选阳性孔,有限稀释法进行克隆化培养;制备腹水抗体;间接ELISA法测定抗体效价;采用HiTrap rProtein A FF亲和色谱柱纯化抗体。结果得到2株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清中抗体效价达10-3以上,腹水抗体效价达10-7以上,纯化后的单抗纯度达98%以上,回收率达75%。结论成功获得两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,可用于早孕、肿瘤等诊断的研究。     

人C型凝集素受体dectin-1单克隆抗体的制备

目的:克隆获得并原核表达人dectin-1基因的胞外段,以其作为抗原,制备人C型凝集素受体dectin-1的单克隆抗体.方法和结果:利用RT-PCR技术从人的外周血中克隆获得人dectin-1基因,克隆到pCDNA 3.0(+)载体中,获得pCDNA3.0(+)-dectin-1质粒.将dectin-1胞外段[dectin-1(202 bp-744 bp)]克隆到pET28a(+)载体,构建原核表达质粒pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp),转到大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)中,IPTG诱导目的片段原核表达,得到高效表达的dectin-1(202 bp-744 bp),镍柱亲和层析纯化后免疫BALB/c小鼠,取抗体滴度高的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,获得1 5株阳性杂交瘤细胞株,利用有限稀释法进行单克隆杂交瘤细胞株的筛选,获得5株单克隆细胞株.用单克隆细胞株制备小鼠腹水模型,经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化获得dectin-1的单克隆抗体.经蛋白质印迹法验证,此单克隆抗体能有效地识别人和小鼠的dectin-1蛋白.结论:成功制备获得dectin-1蛋白的特异、高效的单克隆抗体.     

抗童虫表膜单克隆抗体与吡喹酮协同杀血吸虫作用

目的为观察抗血吸虫童虫表膜单克隆抗体与吡喹酮协同杀灭血吸虫的作用。方法用药物加单克隆抗体被动转移小鼠试验，计算小鼠抗攻击感染的减虫率和减卵率。结果在单抗被动转移小鼠感染3d后加吡喹酮组，其减虫率减卵率分别为91.9％和90.3％，均明显高于单用药物组17.2％、26.9％的减虫率和减卵率;在单抗被动转移小鼠感染38d后加吡喹酮组，其减虫率、减卵率分别为96.9％和83.4％，亦明显高于单用药物组84.9％、31.9％的减虫率和减卵率。结论被动转移的单抗与吡喹酮表现为一种明显的协同杀虫减卵作用。宿主免疫水平的高低明显影响吡喹酮的杀虫作用，提高宿主体内特异性抗体水平，可显著加强吡喹酮预防血吸虫感染和杀灭血吸虫的作用。