人VEGF基因慢病毒介导RNA干扰有效靶点的设计及筛选

目的:设计并筛选人血管内皮生长因子(VEGF)有效RNA干扰片段,构建VEGF慢病毒表达载体。方法:对人VEGF基因编码区分析,筛选序列3条,阴性对照序列l条,通过连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测干扰效果。结果:测序证实3个VEGF基因RNAi慢病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度分别为3.23×109、3.30×109、3.73×109TU/mL。3个慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L后,VEGF基因在mRNA水平受到抑制,其中miR-200序列效果最佳,对VEGF基因表达的干扰效率可达72%。结论:成功构建并筛选了人VEGF基因RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步深入研究VEGF基因与抗肿瘤药物药效关系提供实验基础。     

STAT1过表达慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达

目的：构建STAT1基因过表达慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。方法：根据人STAT1基因mRNA序列,全基因合成STAT1基因,构建至过表达载体并转化至感受态细胞DH5OC,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用荧光定量PCR和Westernblot检测原始细胞株（MHCC97L）,稳转细胞株（MHCC97－statl）中STAT1的表达情况,确定STAT1过表达的有效性。结果：测序证实STAT1基因过表达载体构建成功。过表达慢病毒包装成功。慢病毒转染人肝癌细胞MHCC97L48h后,STAT1基因在mRNA水平和蛋白质水平上表达显著增加。结论：STAT1基因过表达慢病毒载体构建成功,并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。     

人CCL5基因RNA干扰慢病毒载体的构建

目的 构建人CCL5基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体.方法 根据人CCL5基因信息,构建4个携带RNAi序列的pGCSIL-GFP质粒,与pHelper 1.0、Helper 2.0质粒一起利用293T细胞进行慢病毒包装.用CCL5 RNAi慢病毒载体感染人宫颈癌细胞(Hela),使用RT-PCR方法验证其干扰效率.结果 4个靶点中有3个靶点(a1、a2、a3)在Hela细胞上对CCL5基因的表达都有非常显著的敲减效果,敲减效率均达到95%以上.结论 构建的CCL5 RNAi慢病毒载体在Hela细胞中有较高的敲减效率,提示RNAi技术能够使细胞CCL5基因沉默.     

人生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1基因重组慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

目的 探讨构建人类生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1(Gab1)基因重组慢病毒RNA干扰载体的方法,研究其对人脐静脉血管内皮细胞株EA.hy926的沉默效率.方法 针对人类Gab1基因设计5个靶点的小干扰RNA (siRNA)序列,并分别合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I限制性内切酶双酶切后的GV118载体连接,产生Gab1-RNA干扰(RNAi)转化子,聚合酶链反应(PCR)筛选阳性克隆并进行测序鉴定.将测序正确的Gab1-RNAi、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染239T细胞,包装产生LV-Gab1-RNAi慢病毒并测定其滴度.将获得的慢病毒分别转染EA.hy926细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,测定其转染效率;通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后的EA.hy926细胞中Gab1 mRNA表达水平来验证慢病毒干扰载体的基因沉默效率.结果 经PCR分析和测序证实,成功构建LV-Gab1-RNAi慢病毒载体;病毒滴度为3×109 TU/ml;荧光显微镜下转染组细胞GFP荧光表达强烈,转染效率达70％以上;RT-PCR证实干扰组细胞Gab1 mRNA表达水平(0.088 ±0.003)较对照(0.947±0.087)组和空白组(0.999±0.067)显著降低(P＜0.01).结论 成功构建人Gab1基因RNAi慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够的病毒滴度,能明显抑制Gab1基因在EA.hy926细胞株中的表达.     

小鼠RelB基因siRNA慢病毒载体的构建及鉴定

默效率.用pVSVG,plp1,plp2慢病毒包装系统质粒在磷酸钙介导下共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 聚合酶链反应(PCR)和测序证实,成功构建RelB-shRNA的慢病毒载体pLentiLox-sh-RelB.Western blot鉴定最有效的siRNA序列为5'-TGTGGTCAGGcATCTGCTTG-3',病毒液过滤后测定滴度为8×1010 pfu/L.结论 成功构建小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体.     

免疫基因CD1d和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体。方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定。取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察荧光表达。结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致。重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光。结论:成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究CD1d基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体。     

慢病毒介导的RNA干扰沉默Wip1基因对人脑胶质母细胞瘤细胞生长的影响

目的 构建人Wip1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默人胶质瘤U251细胞的Wip1基因并观察其对细胞生长的影响.方法 设计并合成3条Wip1基因特异性RNAi靶序列,构建到慢病毒pFU-GW-iRNA载体中.慢病毒包装转染HEK293T细胞,获得病毒上清并测定其滴度;感染U251细胞,实时定量聚合酶链反应(PCR)及Western blot鉴定RNA干扰效率;筛选出基因沉默效率最高的慢病毒感染U251细胞,CCK-8法检测细胞的增殖,Western blot检测RNA干扰后的bcl-2蛋白表达.结果 PCR扩增和测序表明成功构建Wip1慢病毒干扰载体,病毒载体包装获得的病毒上清滴度在3×10~8～8×10~8 TU/ml.可以有效地沉默U251细胞中Wip1基因的表达,构建的RNAi慢病毒载体感染U251细胞后Wip1基因的mRNA表达量同对照组比较分别为36.3%、32.9%、23.8%.稳定Wip1 RNA干扰后的U251细胞4 d后细胞增殖能力下降35.1%.结论 慢病毒介导的RNA干扰可以高效稳定地沉默基因表达,Wip1基因促进了U251细胞的增殖.     

E-cadherin重组慢病毒载体的构建及表达

[目的]构建E-cadherin过表达和RNAi慢病毒载体,转染A549肿瘤细胞,观察E-cadherin的表达。[方法]根据Gene Bank E-cadherin的序列,选择设计两条序列和一条无关RNAi序列作为对照,通过Mlu I和Nde I两个酶切位点,将设计好的siRNA片段插入包装质粒PHR-SIN-CSGW-H1a(PHR)构建E-Cadherin RNAi慢病毒载体PHR-EA、PHR-EB。PCR扩增E-cadherin基因与pc DNA3.1质粒使用Bam HI、Xho I双酶切,连接鉴定后,亚克隆至慢病毒载体PHR,构建-E-cadherin过表达慢病毒载体PHR-E-cadherin。慢病毒包装后,感染A549肿瘤细胞,观察表达。[结果]成功构建E-cadherin过表达和RNAi慢病毒载体,并分别经PCR和质粒酶切鉴定。RTPCR检测E-cadherin的干扰和过表达情况,两个E-cadherin的RNAi病毒感染细胞后,都能使目的基因表达下调,而E-cadherin过表达慢病毒转染后细胞的E-cadherin表达明显提高了。Western Blot检测证实E-cadherin的表达确实被慢病毒所上调和干扰。[结论]成功构建出E-cadherin基因过表达和RNAi慢病毒载体,并在A549肿瘤细胞中成功表达,为进一步转染神经干细胞观察其生物学影响及对脊髓损伤修复的效果奠定基础。     

ELL慢病毒表达载体的构建及其感染前列腺癌PC3细胞的研究

目的构建ELL基因的慢病毒表达质粒,探讨其感染人前列腺癌PC3细胞的可行性。方法将含有全长ELL的质粒和慢病毒表达载体经双酶切后连接,构建成重组慢病毒载体质粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-ELL。对慢病毒载体质粒进行双酶切和测序鉴定后,制备包装病毒并转染人前列腺癌细胞系PC3。结果慢病毒载体质粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-ELL的酶切和测序结果与预计的序列一致。慢病毒感染人前列腺癌PC3细胞后能稳定高表达ELL。结论成功构建了ELL的慢病毒表达载体,ELL可被成功转染入人前列腺癌细胞。     

介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定

目的：构建介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,为进一步包装慢病毒载体奠定基础.方法：以大鼠Ppif基因为靶基因,根据RNA干扰（RNAi）序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,并对质粒进行PCR及测序鉴定.结果：Ppif的短发夹RNA（shR-NA）片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4对插入序列与设计的靶基因片段完全一致.结论：构建了能够表达4个含Ppif靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导Ppif基因沉默的慢病毒载体奠定了基础.     

NEP1-40基因慢病毒载体构建及鉴定

目的构建NEP1-40(Nogo extra cellular peptide residues 1-40)基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞奠定基础,并实现在细胞中高效、稳定表达。方法从含有NEP1-40基因的cDNA文库中,利用PCR方法钓取NEP1-40基因编码区片段。将目的基因与酶切线性化的载体pGC-FU进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的目的质粒。将构建成功的目的质粒和两种辅助包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒,荧光显微镜下观察慢病毒转染293T细胞后荧光表达情况,采用Western blot检测NEP1-40及绿色荧光蛋白融合蛋白表达情况。结果 PCR产物经电泳分析表明成功获取NEP1-40基因cDNA克隆,测序提示慢病毒转染质粒连接构建正确;荧光表达检测显示293T细胞中产生慢病毒颗粒;Western blot显示NEP1-40在细胞内稳定表达。结论成功构建NEP140基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞后从分子水平探讨NEP1-40基因功能奠定了实验基础。     

人前脑啡肽基因修饰人胚胎肾细胞的构建

目的 构建人前脑啡肽基因(hPPE)修饰的人胚胎肾细胞(HEK293细胞).方法 重组质粒pcDNA3.1(+)/hPPE经限制性内切酶HindⅢ和Not Ⅰ进行双酶切获得hPPE基因,运用基因重组技术将hPPE基因与表达载体同源重组,转染293T细胞进行慢病毒包装、扩增、纯化,测定病毒滴度,再将重组的慢病毒载体转染HEK293细胞.用Western blot法检测hPPE基因在HEK293细胞中的表达.结果 重组慢病毒载体阳性克隆测序结果和基因库的hPPE基因序列完全一致.含有hPPE基因的慢病毒载体,滴度为2.07×108TU/ml.转染慢病毒载体后的HEK293细胞,在荧光显微镜下未见到GFP荧光.转染Ubc-GFP-L.V.空病毒载体的HEK293细胞,可见到较强的荧光.Western blot法检测到经慢病毒载体转染后的HEK293细胞中hPPE基因表达呈阳性.结论 成功构建了hPPE基因修饰的HEK293细胞,使hPPE基因可在HEK293细胞中稳定表达.     

肝癌特异性启动子调控的双靶位慢病毒载体的构建、鉴定及其在肝癌基因治疗中的应用

目的探讨survivin-CMV特异性启动子调控的双靶点慢病毒对肝癌细胞生长的影响。方法 RT-PCR扩增anti-AFP-scFv,测序鉴定,双酶切连接,获得pMD2G-anti-AFP-scFv质粒。针对已经筛选确定的IGF1R基因干扰有效序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与质粒pPRIME连接得到pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R质粒。RT-PCR扩增survivin-CMV肝癌特异性启动子,测序鉴定,与双酶切的质粒pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R连接,得到质粒sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R。用sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R, psPAX2, pMD2G-anti-AFP-scFv共转染293T细胞,经过病毒空斑纯化,包装成慢病毒,测定病毒滴度。RT-PCR、Westernblot检测IGF1R表达,竞争抑制实验检测抗人AFP单链抗体活性。CCK-8法检测细胞生长。结果成功构建survivin-CMV肝癌特异性启动子调控的慢病毒AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R;滴度为4.58×109PFU/mL;AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R抑制了肝癌细胞IGF1R表达,竞争实验显示抗人AFP单链抗体的基因高效表达,该慢病毒抑制肝癌细胞的生长。结论本次实验构建的慢病毒载体具有良好的靶向性,为肝癌生物治疗奠定了理论基础,提供了新的思路。     

人胸腺素β4 RNA干扰载体的构建及其对293T细胞目的基因表达的影响

目的探讨人胸腺素β4（thymosin β4,TMSB4）基因RNA干扰慢病毒载体的构建,观察病毒感染293T细胞后TMSB4 mRNA和蛋白表达,为进一步研究TMSB4基因的功能提供基础。方法设计特异性干扰人TMSB4基因的小发卡RNA序列,合成含有干扰序列的双链DNAoligo,与经AgeI和EcoRI双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生慢病毒载体。转化感受态大肠杆菌DH5a并对阳性克隆进行PCR扩增测序鉴定。慢病毒载体、包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度。将获得的慢病毒感染293T细胞,分别采用实时定量PCR和免疫细胞化学染色方法观察TMSB4 mRNA和蛋白的表达情况,利用生成的TMSB4 shRNA慢病毒感染原代成纤维细胞。结果感染重组慢病毒的293T细胞与空病毒转染阴性对照细胞的TMSB4 mRNA表达分别为0.56±0.11和1.00±0.06（P=0.0006）,实验组细胞的敲减率为44%。实验组TMSB4蛋白表达水平0.042±0.007比阴性对照组细胞0.093±0.009的表达降低55%（H=461.342,P〈0.001）。感染重组慢病毒的原代培养的成纤维细胞与空病毒转染的对照细胞相比,TMSB4蛋白表达水平亦明显降低。结论TMSB4基因干扰慢病毒构建成功并能显著降低TMSB4基因和蛋白在293T细胞中的表达,成功感染原代成纤维细胞使其目的基因蛋白减少,为进一步研究TMSB4基因的功能奠定研究基础。     

表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体.方法 根据大鼠Cdh1基因的核苷酸序列,合成目的基因片段并亚克隆到慢病毒表达载体pGC-FU的Age I酶切位点间,命名为pGC-FU-Cdh1.对pGC-FU-Cdh1进行PCR扩增及测序鉴定.将293T细胞按完全随机法分为实验组(每组3只)及对照组(每组3只),分别将pGC-FU-Cdh1及空质粒pGC-FU以脂质体法转染至293T细胞,倒置荧光显微镜观察后,Western blot法检测Cdh1-GFP的表达情况,慢病毒载体LV-Cdh1的包装浓缩及滴度测定. 结果 重组慢病毒表达载体pGC-FU-Cdh1经PCR扩增鉴定及测序鉴定均显示有特异性基因片断,证明大鼠Cdh1基因正向插入慢病毒表达载体pGC-FU中;转染293T细胞后,Western blot法检测到实验组有外源性融合蛋白Cdh1 -GFP的表达(每组3只),对照组无Cdh1-GFP的表达(n=0)(P=0.014);慢病毒载体LV-Cdh1包装浓缩后,Reahime PCR法测定滴度为2E+8 TU/ml. 结论 成功构建表达大鼠Cdh1基因的重组质粒pGC-FU-Cdh1,并包装为慢病毒,为进一步研究Cdh1功能及基因治疗奠定了基础.     

人碱性成纤维生长因子基因重组慢病毒载体的构建

目的 构建携带人碱性成纤维生长因子(bFGF)基因的重组慢病毒表达载体.方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法钓取人源性的bFGF和FGF4两个目的 基因片段,将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU[含绿色荧光蛋白(GFP)]中,得到pGC FU-FGF4-bFGF,通过PCR、酶切、测序和对比验证bFGF后,通过Lipofectamine 2000的介导把pGC FU-FGF4-bFGF质粒和包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染至包装细胞293T,经同源重组产生重组慢病毒pGC FU-FGF4-bFGF,pGC FU-FGF4-bFGF在293T细胞内大量扩增,应用实时定量PCR法鉴定和测定滴度.结果 克隆得到500bp目的 bFGF全长基因,经过PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实,bFGF基因成功克隆到慢病毒载体中,可实现bFGF基因的表达,且病毒滴度为2.0×109 TU/ml.结论 成功构建表达人bFGF基因的慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够高的病毒滴度,可作为后续基因治疗研究工作的基因转染工具.     

构建携带hTERT基因的慢病毒重组载体及其包装和表达

目的构建含hTERT基因的慢病毒重组载体,进行病毒包装并检测hTERT在293T细胞中的表达。方法PCR扩增hTERT．插入慢病毒载体,并与包装质粒转染293T细胞,进行病毒包装,并测定其滴度。Western—Blot检测慢病毒液感染293T细胞后hTERT的表达。结果成功构建了含hTERT的慢病毒重组载体,滴度为2．79×10^7Tu／mL,Western-B10t检测显示慢病毒液感染的293T细胞中hTERT基因高表达。结论含hTERT的慢病毒重组载体成功构建并包装后能够顺利感染293T细胞．并阳性表达目的基因。     

人PPFP基因的重组慢病毒载体的构建和表达

目的 构建含人PAX8/PPARγ/融合基因(PPFP)基因重组慢病毒载体并检测其表达性能.方法 从已构建好的含PPFP的质粒克降模板PEGFP-C-PPFP中,利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取目的 基因PPFP,将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含Flag基因)中,得到重组的pGC-FU-PPFP,通过PCR、酶切、测序和分析比对验证PPFP基因后,将pGC-FU-PPFP质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞,获得携带PPFP基因和Flag基因的重组慢病毒,收集并浓缩病毒上清液,测定重组病毒的滴度.通过Western blot鉴定PPFP-Flag融合蛋白在靶细胞内的表达进一步验证目的 基因在靶细胞中的表达.结果 经PCR扩增获得2591 bp的目的 基因片段,构建的重组质粒经PCR、酶切及测序和分析比对鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达3.5×10~7转导单位TU/ml;感染的293T细胞,Western blot结果显示条带大小为90 KDr,可判断目的 基因PPFP在293T细胞中表达.结论 成功构建PPFP基因慢病毒载体质粒pGC-FU-PPFP,并建立慢病毒过表达系统.     

PKCγ基因RNAi慢病毒载体的构建

目的 构建蛋白激酶Cγ(PKCγ)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体.方法 针对已经筛选确定的PKCT基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的短发夹RNA(shRNA)寡核苷酸序列(Oligo)DNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后的pGCSIL-GFP载体[含U_6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接,转化DH5a大肠杆菌,挑选重组阳性克隆行PCR鉴定和DNA测序.用pGCSIL-GFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0三质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,逐孔稀释滴度法测定病毒滴度.结果 PCR鉴定结果显示,以经双酶切后未插入片断的pGCSIL-GFP空载体(PCR产物为306 bp)为对照,重组细菌克隆的PCR产物为343 bp(插入片段为37 bp),鉴定结果与预期相符.测序结果显示,合成的PKCT基因shRNA寡核苷酸链序列插入正确.包装慢病毒,浓缩慢病毒悬液的滴度为1×10~9 TU/ml.结论 成功构建了PKCT基因shRNA慢病毒载体.     

短发卡RNA对人胃癌细胞STAT3基因的沉默作用

目的:探讨STAT3基因小发夹RNA（shRNA）表达质粒对胃癌MKN-45细胞STAT3基因的干扰作用。方法:根据STAT3 mRNA 编码序列，设计RNA干扰靶点，构建STAT3基因的特异性小RNA干扰质粒（psiRNA-H1/STAT3），使用脂质体转染人胃癌细胞系（MKN-45细胞）。实验分为对照（A）组，psiRNA-H1转染（B）组和psiRNA-H1/STAT3转染（C）组。通过RT-PCR和Western Blot检测STAT3特异性小RNA干扰基因对胃癌细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达的影响。结果:psiRNA-H1/STAT3经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确，并经测序证实。将其成功转染MKN-45细胞后，该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达均明显下降(P<0.05)。 结论:将成功构建的针对STAT3基因的shRNA表达载体转染MKN-45细胞，能有效抑制该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达，为STAT3基因靶向治疗提供一定的实验依据。