猿肾病毒40大T抗原基因永生化大鼠星形胶质细胞株的生物学特性

目的研究猿肾病毒40大T抗原基因永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST)的生物学特性,探讨其作为转基因细胞镇痛载体的可行性。方法取大鼠大脑皮层星形胶质细胞(AST)和IAST 进行体外培养,观察细胞的形态学、超微结构以及传代复苏的情况;绘制细胞生长曲线,免疫细胞化学法检测细胞胶质纤维酸性蛋白的表达;5’溴-2-脱氧尿苷掺入法和流式细胞仪检测细胞增殖周期;双层软琼脂克隆形成实验和裸鼠接种实验检测细胞的致瘤性。结果AST体外传代至10代左右即出现复制衰老现象,而IAST可连续传代,未出现衰老迹象;细胞生长呈单层,锚着依赖和接触抑制;传代、冻存和复苏对IAST的存活率无影响,而第6代和第10代AST的存活率降低(P<0.01);与第6代和第10代AST相比,IAST增殖较为旺盛,增殖指数较高,群体倍增时间较短、增殖率较高(P<0.01); IAST胶质纤维酸性蛋白免疫染色阳性,软琼脂培养无集落形成,裸鼠接种无致瘤性。结论大鼠IAST是增殖活跃的非恶性转化细胞,可安全地用于转基因细胞移植镇痛研究。     

猿肾病毒40大T抗原基因永生化大鼠神经前体细胞株的构建

目的建立猿肾病毒40大T抗原基因(SV40Tag)永生化大鼠神经前体细胞株,为细胞移植治疗和转基因治疗提供稳定的细胞来源。方法利用脂质体介导的基因转染技术将含有SV40Tag的质粒pCMVSV40T/PUR转染原代培养的新生大鼠神经前体细胞,经嘌呤霉素筛选,阳性克隆扩大培养并连续传代。应用巢蛋白抗体进行细胞鉴定,5%胎牛血清诱导细胞分化后,应用免疫细胞化学法检测其分化能力,观察细胞的形态及其生长状况,绘制细胞生长曲线。用RT-PCR、Southern印迹杂交和免疫细胞化学法检测SV40Tag在转染细胞中的表达。结果转染细胞经筛选培养后获得1 个阳性细胞克隆,免疫细胞化学结果显示细胞的巢蛋白和微管相关蛋白2染色为阳性,增殖能力较强。5%胎牛血清可诱导转染细胞分化为微管相关蛋白2阳性和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。Southern印迹杂交结果显示转染细胞基因组中存在SV40Tag cDNA,并可检测到SV40Tag mRNA及其蛋白的表达。转染细胞经扩大培养,命名为永生化神经前体细胞。贴壁培养的神经前体细胞,群体倍增时间为(22.9±2.7)h,传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响。结论成功地构建了SV40Tag永生化的大鼠神经前体细胞株。     

四环素调控系统修饰永生化大鼠星形胶质细胞株的构建及鉴定

目的构建四环素及其衍生物强力霉素诱导表达目的基因的永生化大鼠星形胶质细胞株。方法用脂质体法将逆转录病毒载体四环素调控系统中的质粒pRevTet-On转染病毒包装细胞 PT67,经筛选培养后获得病毒载体RevTet-On,采用RT-PCR进行鉴定,并应用NIH313细胞测定病毒滴度。将RevTet-On感染永生化大鼠星形胶质细胞,用有限稀释法挑选阳性细胞单克隆后扩大培养,每个克隆瞬时转染含萤光素酶报告基因的质粒pRevTRE-Lue,加入强力霉素48h后分别检测其萤光素酶活性值,挑选出强力霉素诱导表达高、背景表达低的细胞株并检测其诱导表达的时效、量效关系。结果 RT-PCR结果显示逆转录病毒包装成功,病毒最高滴度为7．4×105CFU／ml。RevTet-On转染永生化大鼠星形胶质细胞后挑选出48个单克隆,瞬时转染pRevTER-Luc后筛选出1株高表达低背景细胞株, 其诱导表达值为876．1 RLU,背景表达值为42．5 RLU,诱导倍数为20．6。该细胞株在加入诱导因子强力霉素1 h后目的基因即开始表达,在24 h时达到高峰,在强力霉素浓度100-2 000 ng/ml的范围内, 其诱导表达活性与药物浓度呈剂量依赖性。结论含四环素调控系统的永生化大鼠星形胶质细胞株诱导活性可靠,可用于调控表达外源基因的研究。     

强力霉素调控表达脑啡肽的永生化大鼠星形胶质细胞株的构建

目的构建受强力霉素（Dox）调控表达脑啡肽的永生化大鼠星形胶质细胞株（IAST）。方法采用脂质体介导法将重组质粒pRevTREhPPE和调节质粒pRevTet-On分别转染逆转录病毒包装细胞PT67；将含有RevTet—On和RevTRE／hPPE病毒上清感染IAST，得到稳定表达脑啡肽的IAST／Tet-On／hPPE细胞株，实时定量PCR检测Dox定量调控该细胞株前脑啡肽原（hPPE）基因的表达，免疫细胞化学及放射免疫分析法检测Dox定量调控该细胞株中脑啡肽的表达。结果IAST／Tet-On／hPPE细胞株中，hPPE基因的表达和脑啡肽的分泌受Dox调控，Dox浓度为100～5000nedml时，随着Dox浓度增高，hPPE基因的表达和脑啡肽的分泌增加，Dox浓度为5000ng／ml时达峰值。结论成功构建了受四环素及其衍生物强力霉素定量调控表达脑啡肽的IAST。     

大鼠骨骺干细胞的分离鉴定及其永生化细胞株的构建

[目的]分离、鉴定大鼠骨骺干细胞并建立永生化的大鼠骨骺干细胞株,为细胞移植和转基因治疗提供稳定的细胞来源.[方法]采用Percoll不连续密度梯度离心法分离骨骺干细胞,利用电穿孔转染技术将含有猿肾病毒40大T抗原基因（SV40Tag）的质粒pCMVSV40T/PUR转染骨骺干细胞,经嘌呤霉素筛选,抗性克隆扩大培养.应用FGFR-3抗体和PCNA抗体进行免疫细胞化学染色,观察细胞的形态及其生长状况并绘制细胞生长曲线.用免疫细胞化学法和RT-PCR检测SV40Tag在转染细胞中的表达.[结果]转染后获得一个阳性细胞克隆,免疫细胞化学结果显示FGFR-3抗体染色阳性.SV40Tag抗体染色和RT-PCR结果显示SV40Tag已稳定转染入骨骺干细胞.转染细胞经扩大培养,命名为永生化骨骺干细胞.[结论]成功纯化大鼠骨骺干细胞并构建了SV40Tag永生化的骨骺干细胞株.     

人脑肿瘤中猴病毒40大T抗原的表达及活性研究

猴病毒 40 (ｓｉｍｉａｎｖｉｒｕｓ 40 ,ＳＶ40 )与人脑肿瘤发生的病因学关系尚不清楚[1 ] 。我们通过研究ＳＶ40早期区域基因编码产物大Ｔ抗原 (Ｔａｇ)在人脑肿瘤中的表达及其与抑癌蛋白 ｐ53、ｐＲｂ的相互作用 ,探讨ＳＶ40在人脑肿瘤发生发展中的意义 ,现将结果报道如下。一、材料与方法1 .材料 :65例人脑肿瘤及 8例正常人脑组织新鲜标本均由全军神经外科研究所标本库提供。组织标本离体后迅速置液氮中冷冻 ,此后储存于- 70℃备用。脑肿瘤按 1 990年ＷＨＯ标准分类 :胶质瘤 45例 ,脑膜瘤、垂体腺瘤各 1 0例。胶质瘤中包括星形细胞瘤 1 …     

慢性神经痛大鼠脊髓背角星形胶质细胞缝隙连接蛋白43表达的变化

目的 研究慢性神经痛大鼠脊髓背角星形胶质细胞缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的变化。方法 20只SD大鼠随机分为两组,神经痛模型(CCI)组:结扎右侧坐骨神经,假手术(Sham)组:未结扎坐骨神经,每组10只。分别于手术前1 d、术后1、3、5、7、14 d(分别记为T0、T1、T2、T5、T7、T14)观察大鼠疼痛行为学变化,测定右后肢热刺激回缩潜伏期(PWTL)、电刺激回缩阈值(PWET),并于T14取L4-5脊髓,采用免疫组化法分析Cx43和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)表达的变化。结果 与T0比较,CCI组T1-14PWTL缩短、PWET降低(P<0.01),Sham组T1-5PWTL缩短、PWET降低(P<0.01),T7后恢复至术前水平(P>0.05)。CCI组右侧脊髓背角GFAP、Cx43染色均强于Sham组,且主要集中在Ⅰ-Ⅱ层。CCI组右侧脊髓GFAP、Cx43阳性染色面积均大于Sham组(P<0.01),CCI组、Sham组GRAP阳性染色面积分别占(29±7)％、(19±5)％、Cx43阳性染色面积分别占(17±3)％、(4±1)％。两组左侧脊髓GFAP与Cx43染色差异无显著性。结论 慢性神经痛大鼠脊髓背角星形胶质细胞Cx43与GFAP增加,提示星形胶质细胞缝隙连接可能在神经痛的形成和维持中起重要作用。     

CTLA4Ig基因和CD40Ig基因转染供肾对异种大鼠移植肾存活的影响

目的 探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4融合蛋白(CTLA4Ig)基因和CD40Ig基因转染供肾对异种大鼠移植肾存活的影响.方法 以PcDNA3.1质粒为载体,通过脂质体2000将CTLA4Ig基因和CD40Ig基因转染豚鼠肾脏,再移植(异位肾移植)给SD大鼠.实验分4组进行:第1组供肾以PcDNA3.1空载体脂质体复合物转染(空载体组);第2组供肾转染CD40Ig基因(CD40Ig转染组);第3组供肾转染CTLA4Ig基因(CTLA4Ig转染组);第4组供肾同时转染CTLA4Ig基因和CD40Ig基因(双基因转染组).术后观察各组血清肌酐、移植肾组织病理改变以及移植肾存活时间.结果 空载体组、CD40Ig转染组、CTLA4Ig转染组和双基因转染组受者的存活时间分别为(6.8±1.9)d、(40.7±10.9)d、(49.3±9.5)d和(75.7±8.0)d,3个转染组明显长于空载体组(P＜0.01),其中双基因转染组移植肾存活时间最长,与其他3组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).各组术后血清肌酐水平呈上升趋势,但升高幅度以双基因转染组为最低(P＜0.01).术后第30天,CD40Ig转染组和CTLA4Ig转染组存活大鼠的移植肾组织中可见大量淋巴细胞浸润,而双基因转染组的移植肾组织中仅见少量淋巴细胞浸润.结论 供肾局部同时转染CTLA4Ig基因和CD40Ig基因可明显延长其异种移植后的存活时间.     

转染可溶性CD40基因的树突状细胞在体外对T淋巴细胞功能的抑制作用

目的探讨转染可溶性CD40(sCD40)基因的树突状细胞(DC)在体外对T淋巴细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的细胞毒活性的影响。方法采用脂质体转染法,将携带鼠CD40胞外区和绿色荧光蛋白的融合基因的质粒pEGFP-N1/sCD40转染小鼠DC细胞株(DC 2.4)。以Balb/c小鼠淋巴细胞为反应细胞,分别以转染组DC、空载体转染组(空载体组)DC和未行转染处理的DC(空白DC)作为刺激细胞,进行单向混合淋巴细胞培养,四唑氮化合物比色法检测细胞增殖情况。用乳酸脱氢酶释放试验和流式细胞术检测转染组DC及其培养上清液对CTL细胞毒活性及其凋亡的影响。结果转染组DC及其培养上清液对同种细胞刺激的淋巴细胞增殖反应有显著的抑制作用(P<0.05),并对特异性CTL的细胞毒活性具有明显的抑制作用(P<0.05);转染组DC可诱导CTL凋亡(P<0.05)。结论稳定表达sCD40-EGFP融合蛋白的DC,在体外对T淋巴细胞的增殖和CTL的细胞毒活性具有明显的抑制作用,并可诱导CTL凋亡。     

Immunological purification of rat precartilaginous stem cells and construction of the immortalized cell strain

Precartilaginous stem cells (PCSC) are adult stem cells that control limb growth of animals and can differentiate directionally. In a previous study, PCSC was reported to begin differentiating at the fifth passage; therefore, sufficient uni-phenotype PCSC cannot be harvested from primary cell culture. The purpose of this study was to examine whether simian virus 40 large T antigen gene (SV40Tag) could induce rat PCSC to immortalize. Immunomagnetic separation was used to isolate PCSC labeled with fibroblast growth factor receptor-3 (FGFR-3). Plasmid pCMVSV40T/PUR containing SV40Tag was transfected into PCSC by liposome transfection method. One anti-puromycin cell clone was obtained, which was confirmed as FGFR-3 positive, and expanded to immortalized cell strain. Results from RT-PCR and immunocytochemistry demonstrated that SV40Tag was highly expressed at both mRNA and protein levels after stable transfection. The cells transfected with SV40Tag were expanded to immortalized cell strain, which could maintain its characteristics for 30 passages, named immortalized precartilaginous stem cells (IPCSC). IPCSC were short fusiform or triangular cells with two or three short axons. Immunocytochemistry results of FGFR-3 and Collagen II demonstrated that IPCSC retained the characteristics of PCSC and the high proliferation capability of IPCSC was confirmed by methyl thiazolyl tetrazolium assay. Therefore, we concluded that rat precartilaginous stem cells were purified and immortalized precartilaginous stem cell strain was established. It may provide a stable cell resource for basic research and cell transplantation therapies.     

SV40LT抗原基因逆转录病毒载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的　构建含SV 40LT抗原基因的逆转录病毒载体并转染鼠肝细胞 ,检测SV 40LT抗原基因在肝细胞中的表达情况 ,为肝细胞移植研究打下基础。方法　利用体外基因重组技术构建含SV 40LT抗原基因的逆转录病毒载体并酶切、测序鉴定 ,脂质体介导转染PA3 17细胞 ,G 418抗性筛选阳性克隆 ,通过NIH 3T3细胞测定病毒滴度 ;分离、纯化大鼠肝细胞后 ,将含SV 40LT抗原基因的假病毒颗粒感染肝细胞 ,用PCR及免疫组化法检测转染肝细胞中SV40LT抗原基因的表达情况。结果　( 1)酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV 40LT抗原基因 ;( 2 )病毒滴度为 1.3× 10 6 cfu/ml ;( 3 )转染后的肝细胞含有SV40LT抗原基因 ,其表达在转染后 2 4h明显高于 96h(P <0 .0 5 )。结论　成功构建含SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体 ,转染后的肝细胞表达有目的基因 ,有望作为肝细胞体外培养的可用技术     

Construction and identification of immortalized rat astrocyte cell line expressing enkephalin

Objective ： To provide a sound cell source for further ex-vivo gene therapy for chronic pain, we attempt to develop an immortalized rat astrocyte cell line that expresses enkephalin regulated by doxycycline. Methods. Retrovirus infection method was employed to develop an immortalized rat astrocyte cell line that could express enkephalin regulated by doxycycline. The hPPE gene expression level of immoralized astroyte cells （IAC）/ hPPE was detected by RT-PCR, indirect immunofluorescence staining and radioimmunoassay. Results. IAC carrying Tet-on system transfected with preproenkephalin gene could secrete enkephalin that was regulated by doxycycline in a dose-dependent manner and hPPE gene activation could be repeated in on-off-on cycles through administration or removal of doxycycline. Conclusion： An immortalized rat astrocyte cell line that secrete enkephalin under the control of doxycycline is established successfully, which provides a research basis for transgenic cell transplantation for analgesia.     

猿肾病毒40介导的人前软骨干细胞永生化的实验研究

目的 构建猿肾病毒40大T抗原基因(SV40Tag)介导的永生化人前软骨干细胞株,为下一步基因打靶研究其分化分子机制提供稳定的细胞来源. 方法采用脂质体介导的基因转染技术将含有SVd0Tag的质粒pCMVSV40T/PUR转染人前软骨干细胞(PSCs),经嘌呤霉素筛选,阳性克隆扩大培养并连续传代.用免疫组化、RT-PCR、Southern印迹杂交法对转染细胞进行鉴定,并检测SV40Tag在转染细胞中的表达及其与基因组的整合情况. 结果 筛选获得的阳性克隆扩大培养,命名为永生化前软骨干细胞(IPSCs),能连续传代培养,细胞生长迅速.免疫组化和RT-PCR证实IPSCs成纤维生长因子受体-3阳性,并可检测到SV40Tag mRNA及其蛋白的表达.Southern印迹杂交显示IPSCs基因组中存在SV40Tag cDNA. 结论 成功构建了SV40Tag介导的永生化人前软骨干细胞株.