一个三姐妹同患P450c 17α缺陷家系的分子遗传学研究

目的 研究1个三姐妹同患P450c 17α缺陷家系的分子遗传学机制.方法 采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)、限制性内切酶酶切及自动测序等方法检测患者家系中CYP17基因的突变情况.结果 3例患者CYP 17基因中一等位基因的第6号外显子有杂合点突变His373→Leu,用等位基因特异性扩增的方法证明此点突变来自父方;另一等位基因第8号外显子另有9个碱基缺失的突变,使位于羧基端487-489位的Asp-Ser-Phe缺失,并用限制性内切酶酶切的方法证实患者的母亲和一个胞弟是该缺失突变的携带者.结论 1个三姐妹同时患病的中国人P450c 17α缺陷的家系是由于CYP 17基因的复合杂合突变所致.     

17α羟化酶17，20碳链裂解酶缺陷症家系分子诊断研究

目的 对17α羟化酶17,20碳链裂解酶缺陷症(17OHD)1个家系4人进行分子诊断。方法 对2013年南京军区福州总医院收治的17OHD患者及其母亲、小姨和妹妹全血中抽提基因组DNA,设计8对引物,采用PCR扩增产物直接测序方法进行基因突变分析。结果 先证者的临床表现符合17OHD,其家族中未有其他病例。先证者序列分析表明,其CYP17A1基因第8外显子存在9个碱基(GACTCTTTC)缺失,导致第487~489位氨基酸缺失,使P450c17酶完全失活,从而导致17OHD。其母亲和小姨为该位点杂合缺失,妹妹未检测到同一缺失。结论 建立了基于CYP17A1基因突变分析的分子诊断方法,可以对17OHD进行准确的分子诊断,并可为遗传咨询及其产前诊断奠定基础。     

罕见的CYP17A1基因外显子剪接突变导致17α-羟化酶缺陷的分子病因学研究

目的 对一例46XY性发育异常的患者进行CYP17A1致病基因分析,并探讨新的突变对患者表型的影响.方法 对患者及其父母的CYP17A1基因的8个外显子进行PCR扩增,扩增产物直接测序.将野生型和含有新突变位点的突变型PCR片段连入表达载体,构建Mini-gene系统,转染HEK-293T细胞,RT-PCR观察新突变位点对剪切的影响.进一步构建野生型和剪切异常的CYP17A1 cDNA全长表达质粒,转染HEK-293T细胞,体外检测CYP17A1酶活性.结果 基因分析显示患者的CYP17A1基因为复合杂合突变,其中一个等位基因为外显子6中c.985_987delinsAA突变,另一等位基因含有新的同义突变(c.1263 G＞A:GCG＞GCA).体外研究表明,这种同义突变会产生新的剪切位点,导致CYP17A1基因mRNA异常剪切,剪切产物中CYP17A1的415位氨基酸残基后缺失6或7个氨基酸.体外转染和酶活性检测证实异常剪切产物使酶活性丧失;但此突变对剪切的影响并不是完全的,在患者体内还应存在部分正常的剪切产物,发挥残余酶活性,与患者的表型相一致.结论 本研究首次报道了由于CYP17A1基因外显子剪切突变导致的17α-羟化酶缺乏的患者,并且启动对异常剪切体的功能研究.     

CYP17A1基因与心血管疾病的相关性研究

CYP17A1基因位于10q24．3,有8个外显子及7个内含子,主要在肾上腺及性腺表达。CYP17A1基因编码P450c17蛋白,该酶属于细胞色素P450超家族酶之一,催化许多反应,包括药物代谢及胆固醇、类固醇和其他脂类的合成,它含有17α-羟化酶和17,20-碳链裂解酶两种酶活性,是类固醇合成途径的关键酶。近年来研究发现,CYP17A1基因与某些心血管疾病的发生有关系。现对该基因与心血管及其相关疾病做一综述。     

基因型明确的17 α-羟化酶/17,20-裂解酶缺陷症杂合子肾上腺皮质功能的研究

目的 明确携带CYP17A1基因突变的杂合子个体肾上腺类固醇激素合成功能.方法 对17α-羟化酶和17,20-裂解酶缺陷(17OHD)5个家系的8例患者和14例家系成员,通过PCR产物直接测序的方法来鉴定CYP17A1基因突变,并测定CYP17A1基因突变携带者与45名年龄、性别匹配的正常个体在ACTH兴奋前后肾上腺皮质激素的变化.结果 发现5个家系14例CYP17A1基因突变的携带者中,7例为D487_F489del,6例为Y329fs,1例为H373L.杂合携带者基础和ACTH刺激后的皮质醇水平均低于正常对照,而兴奋后的皮质酮水平高于正常.杂合子的皮质酮与皮质醇的比值在ACTH兴奋前后皆高于正常对照.而男性杂合子在ACTH兴奋前后孕酮水平以及孕酮与17-羟孕酮比值也均都高于正常对照.D487_F489del和Y329fs两组杂合子之间的激素水平无显著差异.结论 与CYP21A2基因突变的携带者体内的21-羟化酶活性轻度受损相类似,CYP17A1基因突变杂合携带者的肾上腺类固醇激素合成已有异常.     

新复合杂合突变致非经典型21-羟化酶缺陷症

目的分析1例不典型表型的21-羟化酶缺陷症（210HD）患者的诊断过程和分子遗传学资料。方法根据患者临床资料、激素测定及影像学资料确诊，PCR产物直接测序方法检测CYP21基因突变。结果患者为老年女性，以高血压就诊；基础激素测定示孕酮、睾酮、雄烯二酮、空腹17-羟孕酮等高于正常水平；双侧肾上腺结节样增生；快速ACTH兴奋试验显示，激发后17-羟孕酮水平为68．3μg／L。基因测序发现，CYP21基因编码区C1187T（R356W）杂合突变，合并启动子区域C-125T，G-112A，T-109C三个位点相联杂合突变，该复合杂合突变类型尚未见文献报道。结论CYP21基因编码区C1187T杂合突变合并启动子区域C-125T，G-112A，T-109C三位点相联杂合突变可能与不典型表现的210HD的发生有关。     

中国汉族人群慢性胰腺炎的CPA1基因突变筛查

目的对羧肽酶A1(carboxypeptidase A1,CPA1)基因进行突变分析,探讨中国汉族人群慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)的分子发病机制.方法收集2014-10/2016-04就诊于四川省人民医院和四川省人民医院崇州分院的CP患者146例作为病例组,另选取200例健康体检者为对照组.采用PCR扩增及DNA直接测序法对CPA1基因全部外显子进行测序,并与CPA1基因的正常序列对比分析.结果在CPA1基因第3外显子上,分别检测出1例c.281AG杂合错义突变和1例c.370AG杂合错义突变,另检测到2例第8外显子c.1074CT杂合同义突变,在正常对照中均未检测到上述突变.同时在第3外显子检测到rs1126899单核苷酸多态性位点,且该位点基因型在病例组和对照组的分布具有统计学差异(P=0.040),病例组r s1126899位点G等位基因携带率高于对照组(74.0%vs 63.0%,c2=4.641,P=0.031),病例组rs1126899位点G等位基因的频率分布也高于对照组(49.0%vs 39.2%,c2=6.479,P=0.011),在不存在酒精因素的病例组与对照组中,CC型携带者与CG+GG型携带者的分布差异具有统计学意义(OR=1.779,95%CI:1.026-3.087,P=0.039).结论C P A 1基因c.281AG、c.370AG和c.1074CT突变可能与中国汉族人群CP的发病有关,CPA1基因rs1126899 C/G多态性与中国汉族人群CP的易感性相关.     

一例Fabry病患者α-半乳糖苷酶基因突变和酶活性分析

目的 分析1例临床诊断的15岁典型Fabry病男性患者的临床表现、α-半乳糖苷酶A(α-GalA)基因(GLA)突变位点及其活性,并对无临床表现的患者母亲进行了相应的对照分析.方法 收集该例患者的临床资料,提取患者及其母亲、1名健康对照者的外周血基因组DNA,PCR分段扩增GLA基因的7个外显子,产物纯化后克隆入T载体进行DNA测序,检测是否存在突变位点,进一步应用荧光底物法榆测α-Gala的活性.结果 基因检测证实患者GLA基凶第7号外显子发生一个错义突变,即10036-10038位的AAG缺失(10036-10038delAAG),导致其编码的第374位的赖氨酸和第375位甘氨酸突变成精氨酸,该突变位点经国内外文献检索未见报道.该患者为带有突变基因的半合子,母亲为携带突变基因的杂合子,健康对照者未发现突变.α-GalA酶活性检测结果显示,携带该突变位点GLA基因的患者,其α-GalA酶活性只有健康对照者的50%左右,患者母亲的α-GalA酶活性为健康对照者的70%左右.结论 对临床疑似的Fabry病患者及其亲属,进行GLA基冈突变检测,结合α-GalA酶活性检测,有助于早期筛选出家系中的其他患者,能更加深入地了解Fabry病的分子发病机制.     

外显子测序技术在一个尿道下裂家系基因分析及产前诊断中的应用

目的采用外显子测序(exon sequencing,ES)联合Sanger测序技术检测1个尿道下裂家系的致病基因,并对这一致病基因进行产前诊断。方法采集先证者及其父母的外周血,并提取DNA。对先证者的DNA进行性腺疾病相关基因的外显子测序找到致病基因,并针对该致病基因对先证者父母的DNA进行Sanger验证,明确是遗传自亲代。对先证者母亲再次妊娠的羊水标本提取DNA,采用Sanger测序对该致病基因行产前诊断。结果先证者SRD5A2(NM_000348):c.607GA,P.(Gly203Ser)杂合突变及c.680GA,P.(Arg227Gln)杂合突变组成的复合杂合突变。而其表型正常的母亲为SRD5A2(NM_000348):c.607GA,P.(Gly203Ser)杂合突变;其表型正常的父亲为SRD5A2(NM_000348):c.680GA,P.(Arg227Gln)杂合突变。先证者母亲再次妊娠产前诊断结果为SRD5A2(NM_000348):c.680GA,P.(Arg227Gln)杂合突变。结论 ES联合Sanger测序可用于检测尿道下裂家系的致病基因及进行产前诊断。且此方法快速、准确、经济。     

重型遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系分子遗传学分析

目的 探讨遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症家系基因突变的类型。方法 检测凝血和止血指标以明确诊断;用DNA直接测序法对先证者及其家庭成员FⅦ基因的全部外显子及其侧翼、5’和3’非翻译区进行分析;将含杂合缺失突变外显子克隆入pMD18-TTA克隆载体中,对来自父母的两条染色体的相应序列分别测序。应用限制性内切酶StuI、MspI进行酶切分析。结果 先证者FⅦ的6号、8号外显子分别发现了1个错义杂合突变：9482位G→T,导致Arg(CG-A)152被Leu(CU-G)替代;11348位C→T突变,导致Arg(C-GG)304Trp(U-GG)突变;克隆的pMD18-TTA克隆载体测序结果显示一个杂合缺失：在11487～9位(CCC)缺失一个C,引起框移突变(已证实,后两种杂合突变均来自母亲),使351位His变为Thr,在其后编码与正常氨基酸序列完全不同的6个氨基酸后出现了翻译终止密码。其中,先证者Arg152 Leu杂合突变来自父亲,其祖父具有相同的杂合突变,父亲还含有Arg353Gln杂合多态性;其祖母为Arg304Trp杂合突变且含有Arg353Gln杂合多态性;姑姑和大伯分别为Arg353Gln杂合多态性和Arg304Trp杂合突变。PCR辅助限制性酶切证实了先证者及其家系成员的两种错义突变。结论 在该例家系中发现了Arg304Trp、Arg152Leu、11487～9位(CCC)缺失一个C三种杂合性突变,其中后两种突变为国际首次报道。     

2例不同染色体17α-羟化酶/17,20-裂解酶缺陷症患者的临床特征与基因分析

目的:对2例不同染色体17α-羟化酶/17,20-碳链裂解酶缺陷症(17α-hydroxylase/17,20-lyase deficiency,17OHD)患者的临床特征及基因突变类型进行回顾性分析。方法:对患者行常规体格检查,采空腹静脉血行电解质、内分泌激素、染色体、SRY基因检测,肾上腺CT检查通过高压注射造影剂后行增强扫描,子宫卵巢经超声检查,最后通过CYP17基因检测确诊。结果:例1染色体为46,XX,SRY(-),超声可探及缩小的子宫卵巢。例2染色体为46,XY,SRY(+),腹腔未探及子宫卵巢,右侧腹股沟区探及异位的睾丸。2例患者的共同表现为高血压和第二性征不发育。皮质醇水平在上午8∶00和下午4∶00明显降低,而同步采血的促肾上腺皮质激素(ACTH)水平均明显增高。雌激素(E2)及睾酮(T)降低,而促卵泡素(FSH)及促黄体素(LH)明显增高。卧、立位时肾素活性(PRA)降低,而醛固酮(ALD)水平明显增高。肾上腺CT示双侧均为弥漫性增生改变。基因测序结果:例1的CYP17A1基因上检测到纯合突变c.985-987delinAA(p.Y329KfsX89),该突变生成包含417个氨基酸的截短蛋白;例2第6外显子上发现复合杂合突变c.987CA(p.Y329X)和c.985del(p.Y329TfsX89),分别生成了329个和418个氨基酸的截短蛋白。结论:例1的17OHD由纯合突变c.985-987delinAA所致,例2由复合杂合突变c.985del和c.987CA所致。2例患者不同染色体性别17OHD的临床特征主要为性器官发育的差异。     

黑龙江省东部地区汉族人群PCSK9基因第8、9外显子多态性与冠心病的相关性

目的揭示前蛋白转化酶枯草溶菌素(PCSK)9基因第8、9外显子多态性突变位点与冠心病(CHD)的关系。方法选取经冠脉血管造影(CAG)确诊CHD者为CHD组共303例,非CHD者为对照组共233例。收集两组一般资料及临床资料,并记录入院后大生化数据(如血脂、血糖)。采用聚合酶链反应(PCR)对所提取的DNA基因组中PCSK9基因第8、9外显子扩增,测序,确定PCSK9第8、9外显子单核苷酸多态性(SNP)形式及突变频率,揭示其与低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度的关系。结果在黑龙江省东部地区汉族人群中,未发现PCSK9基因第8外显子的突变位点,在第9外显子的筛查中共发现3个突变位点:c.477 T>C、c.604 C>T、c.606 C>T。对照组基因位点c.477 T>C突变患者血清LDL-C浓度水平与非突变者相比无明显变化(P>0.05)。CHD组基因位点c.604 C>T突变患者血清LDL-C浓度水平与非突变患者比较存在明显差异(P<0.05);基因位点c.606 C>T突变患者的血清LDL-C浓度水平与非突变患者相比无明显变化(P>0.05)。结论在黑龙江省东部地区汉族人群PCSK9基因第9外显子的c.604 C>T突变与CHD存在相关性。     

甲状腺过氧化物酶基因c.2268dupT突变与甲状腺结节的相关性研究

目的 探讨先天性甲状腺功能减退症(先天性甲减)患者及其家系成员发生甲状腺结节与突变位点的关系.方法 58例先天性甲减患者入选,提取外周血白细胞基因组DNA,根据甲状腺功能及超声检查结果选择靶基因.PCR扩增甲状腺过氧化物酶(TPO)、双氧化酶2(DOUX2)、双氧化酶成熟因子2(DOUXA2)、促甲状腺激素受体(TSHR)、钠/碘协同转运体(NIS)基因的所有外显子,对纯化PCR产物进行测序.发现突变后对其家系成员进行筛查.患者及家系成员行甲状腺功能和99mTc甲状腺扫描或超声检查,然后分析5个基因的突变位点与甲状腺结节的关系.结果 16例先证者为复合杂合子或纯合子,其中10例为TPO基因突变,含c.2268dupT突变者6例.37例家系成员为杂合突变,其中TPO基因突变25例.TPO基因c.2268dupT突变先证者及杂合携带者共20例,其中12例并发甲状腺结节.与其他所有突变位点组相比,c.2268dupT突变组的甲状腺结节患病率较高,差异有统计学意义(x2=13.545,P ＜0.01).结论 TPO基因c.2268dupT突变为高频突变,该突变携带者发生甲状腺结节危险性较高.     

细胞色素P450亚型基因多态性分析及对华法林用药剂量的影响

目的探讨细胞色素P450亚型(CYP2C9)基因多态性与华法林抗凝治疗维持剂量的相关性。方法选择服用华法林的汉族患者200例,男性和女性各100例。患者均为心脏瓣膜置换术后。通过CAPS技术及常规DNA测序方法对CYP2C9基因的3个候选位点(CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*c65)进行测定。并分析携带不同基因患者华法林应用剂量差异。结果 200例患者中,并未检测到CYP2C9*2位点发生突变,仅检测到1种等位基因C,基因型全部为C/C野生型。检测到CYP2C9*3A和C位点,其中A/A野生型为171例,占85.5%;A/C杂合子突变型为18例,占9.0%;C/C纯合子突变型为11例,占5.5%。等位基因A频率为94.3%,等位基因C频率为5.7%。CYP2C9*3基因突变与服用华法林剂量存在显著差异(P0.05),A/C型患者服药剂量较A/A型患者降低了18.5%,C/C型患者服药剂量较A/A型降低了76.0%。CYP2C9*c65位点检测出G和C位点2种等位基因,G/G野生型182例,占91.0%;G/C杂合子突变型为18例,占9.0%;这2种基因突变患者的华法林维持剂量之间不存在明显相关性。结论 CYP2C9基因多态性与华法林抗凝治疗维持剂量有一定相关性。     

两例46,XY同患17α-羟化酶缺陷症家系的临床和分子遗传学研究

目的 对一个有两例46,XY同患17α-羟化酶缺陷症的家系进行临床、生化和分子生物学研究,探讨纯合突变和杂合突变在促肾上腺皮质激素(ACTH)兴奋实验前后相关生物学指标的改变.方法 收集一个17α-羟化酶缺陷症家系患者及其他成员的临床和实验室资料,采用PCR产物直接测序方法检测17α-羟化酶基因(CYP17A1)序列;进行1h ACTH兴奋试验.结果 患者CYP17A1基因第6号外显子329位密码子发生了TAC329AA纯合突变,引起Tyr329Lys错义突变和以后的移码突变;携带该突变基因的杂合子在ACTH兴奋前后激素水平的变化介于纯合基因型与正常对照之间.结论 本研究家系中CYP17A1基因突变是17α-羟化酶缺陷症的致病基因,携带该突变基因的杂合子能导致一定程度的生物学功能变化.     

CYP17A1基因TAC329AA纯合突变致17α-羟化酶缺陷症一例家系研究

目的　通过对一个 17α 羟化酶缺陷症家系的临床和分子生物学研究 ,探讨其分子机制。方法　针对在本中心就诊的一个 17α 羟化酶缺陷症家系 ,全面收集患者及其家庭成员的临床和实验室资料 ,同时采用PCR和亚克隆测序方法检测 17羟化酶基因 (CYP17A1)序列。结果　患者临床及内分泌功能检查完全符合 17α 羟化酶缺陷症。CYP17A1基因序列分析发现 ,第 6号外显子 3 2 9位密码子发生了TAC3 2 9AA突变 ,引起Tyr3 2 9Lys错义突变和以后的移码突变。患者为纯合突变 ,患者的父母均为携带该突变基因的杂合子。结论　本研究的这个家系 ,CYP17A1基因突变是 17α 羟化酶缺陷症的致病基因。CYP17A1第 6号外显子 3 2 9位密码子TAC被AA替代为一新的纯合突变类型。     

TRβ基因突变致甲状腺激素抵抗综合征

目的 研究一甲状腺激素抵抗综合征家系的甲状腺激素受体β( thyroid hormone reecptorβ)的基因突变情况.方法 提取患者及其家系5名成员的外周血基因组DNA,PGR分段扩增TRβ基因1-10号外显子,产物直接进行DNA测序检测突变位点.结果 测序结果显示,该家系中有2名成员TRβ基因第10外显子1642位核苷酸发生C转换为A的错义突变,使该位点所编码的氨基酸由脯氨酸变为苏氨酸(P453T),此种突变为杂合子突变.结论 经基因测序检测诊断证实患者TRβ基因第10外显子存在P453T突变,该突变可能导致了甲状腺激素抵抗综合征发生.     

Ⅰ型原发性草酸尿症家系AGT基因新突变鉴定

目的分析Ⅰ型原发性草酸尿症(PH)家系的遗传方式、临床特征及致病基因丙氨酸乙醛酸氨基转移酶(AGT)突变。方法以2012年11月上海交通大学医学院收治的1例PH患者为研究对象,通过家系调查和血尿草酸浓度离子色谱分析,直接测序法分析AGT基因。同时选取100名健康正常人作为对照。结果该家系共有2例患者确诊为Ⅰ型原发性草酸尿症(PH1),遗传特点符合复杂常染色体隐性遗传。AGT基因测序分析发现先证者与其父亲8号外显子均存在一个新的杂合插入突变(C.946_947insAG),在蛋白水平上该突变引起AGT第275位丝氨酸开始的移码突变,导致羧基末端的119个氨基酸替换缩短为异常的38个氨基酸(P.Ser275Arg fs*38),且先证者与其母亲第2号外显子第467位碱基均存在杂合点突变(C.467GA),导致(P.Gly116Arg),此突变为已报道过的致病点突变。结论一个新的AGT突变位点被确定与隐性遗传性PH1有关。这是国内首次对遗传性PH1进行基因学研究。     

醛固酮合成酶基因多态性与心血管疾病关系的研究进展

正醛固酮合成酶由醛固酮合成酶基因细胞色素P45011B2(CYP11B2)编码,是体内调节肾上腺皮质球状带细胞合成醛固酮最后一步生化反应的催化酶,其催化11-去氧皮质醇通过皮质醇和18-羟皮质酮生成醛固酮,在醛固酮生物合成中起着举足轻重的作用。CYP11B2基因定位于染色体8q21-22,全长约7284bp,包含9个外显子和8个内含子,编码503个氨基酸残基,编码的蛋白属于线粒体CYP450酶超家族中     

新疆两例尼曼-皮克病家系分析

目的对2例老年C型尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease type C,NPC)患者及家系的NPC1和NPC2基因进行测序,分析基因型与表型关系。方法采集2例NPC患者及家系外周血,提取基因组DNA,进行引物设计扩增,直接基因测序检测。结果2例患者在NPC1基因6号外显子发现1个杂合子位点A644G(H215R),导致第215位氨基酸由His突变为Arg;18号外显子发现1个杂合子位点N931N(C2793T),氨基酸编码没有改变;2例家系其他成员未发现异常。结论 NPC患者具有典型NPC临床特征,在基因水平上发现,相关基因突变位点或新的突变位点,但家系基因特征不明显。因此,对于老年NPC患者或存在其他致病因素。