单纯疱疹病毒糖蛋白C模拟表位mgC真核表达载体的构建和表达

目的为鉴定单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白C(gC)一个短肽模拟表位mgC基因作为HSVDNA表位疫苗的可能性 ,需构建含此表位的真核载体。方法合成编码该表位的单链DNA ,经不对称PCR扩增后 ,克隆入真核表达载体pcD NA3.1中 ,并在CHO细胞中表达。用RT PCR法鉴定mRNA的表达。结果含mgC基因的真核表达载体在哺乳动物细胞中可以在mRNA水平表达外源蛋白。结论成功地构建了HSVgC中短肽模拟表位mgC基因的真核表达载体 ,为进一步探讨该HSV模拟表位的功能奠定了基础。     

B细胞表位基因疫苗诱导特异性免疫应答及特性研究

为研究特异性B细胞表位短肽为基础的DNA疫苗的免疫应答特性,将鸭乙肝病毒Pre-S中的P127-138B细胞表位基因克隆到含多肽表达盒(peptideexpressioncassette,PEC)的载体中,体外转染C2C12肌肉细胞,用DOT-EIA检测表位短肽的表达,进一步分别免疫不同品系的BALB/c和C57BL/6小鼠,比较MHC限制性对免疫应答的影响。结果表明,重组pECk-b1b2载体可在体外瞬时高效表达,并保持原有的免疫活性;体内基因免疫能诱导针对表位短肽的特异性抗体;不同品系小鼠抗体产生动力学相似,但抗体滴度差异显著。这些结果提示,以B细胞表位为基础的基因免疫可诱导特异性免疫应答,为DNA疫苗的分子设计提供了新的思路和应用前景。     

可用于短肽基因免疫的真核表达载体的构建及应用

目的: 构建可高效表达表位短肽的基因免疫载体, 并研究其在表位为基础的基因免疫中的免疫效应。方法:将基因表达调控序列插入pUC19载体中, 加入KOZAK增强序列、基因克隆位点及转录起始和终止码, 构建可表达短肽的表达载体, 进一步将表位基因克隆到构建的真核载体中,并研究其在体外的表达和体内基因免疫特性。结果: 成功地构建了高效表达短肽的真核表达载体, 并能在小鼠体内诱导表位特异性的免疫应答。结论: 本实验中构建的含PEC的载体以表位为基础的DNA疫苗研究提供了新的设计策略和工具。     

单纯疱疹病毒糖蛋白模拟位的研究

目的 为了充分认识单纯疱疹病毒（HSV）糖蛋白的抗原表位，寻找HSV多组分疫苗和新型基因工程疫苗更有效的小片段短肽作为该病毒疫苗的备选免疫原。方法 利用有动物保护活性的抗HSV糖蛋白C（gC)单克隆抗体（McAb)1A12淘筛噬菌体随机12肽库，经4轮筛选后进行ELISA检测，随机挑取14个阳性克隆进行序列测定，序列比较后得到保守序列，做ELISA阻断实验进一步鉴定筛选结果并与相关天然蛋白HSV gC进行序列比较。结果 获得保守序列－SG（L）RHII－和其侧翼辅助序列－AK－、－VW－，其与天然相关蛋白HSV gC114-116位氨基酸十分相似。携有此短肽的噬菌体可以与McAb特异结合，并可部分阻断抗体与HSV囊膜抗原的反应。结论 所筛选到的保守序列可模拟McAb针对的抗原表位，可能是HSV的替代抗原。这一研究方法有望使短肽替代庞大的糖蛋白全长氨基酸序列，为研制更有效及更广谱的基因工程疫苗提供依据，也使研制基于抗原表位水平的特异诊断试剂成为可能。     

单纯疱疹病毒糖蛋白C模拟表位mgC真核表达载体的构 …

目的 为鉴定单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）糖蛋白Ｃ（ｇＣ）一个短肽模拟表位ｍｇＣ基因作为ＨＳＶ ＤＮＡ表位疫苗的可能性,需构建含此表位的真核载体。方法 民编码该表位的单链ＤＮＡ,经不对称ＰＣＲ扩增后,克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１中,并在ＣＨＯ细胞中表达,用ＲＴ－ＰＣＲ法鉴定ｍＲＮＡ的表达。结果 含ｍｇＣ基因的真核表达载体在哺乳动物细胞中可以在ｍＲＮＡ水平表达外源蛋白。结论 成功地构建了ＨＳＶ ｇＶ     

SARS病毒N蛋白的表达与DNA疫苗的构建

目的：在大肠杆菌中表达SARS冠状病毒核衣壳N蛋白，并构建其DNA疫苗。方法：构建含N基因的原核表达载体pQEN，并在大肠杆菌M15中表达N蛋白。采用NP亲和层析法纯化目的蛋白。将N基因克隆入真核表达载体pSecTagB中，构建真核重组质粒pSecN。以其免疫小鼠制备抗血清，并用ELISA法检测其与大肠杆菌中表达的重组N蛋白及天然全病毒N蛋白的反应性。结果：重组N蛋白能与DNA疫苗免疫的小鼠血清以及SARS患者血清发生特异性反应；SARS—CoV病毒颗粒也可与DNA疫苗免疫的小鼠血清发生特异性反应。结论：重组N蛋白保留了病毒的一些特异性抗原表位，可作为用ELISA法检测SARS—CoV的抗原。构建的DNA疫苗可在小鼠体内产生高效价的抗SARS病毒N蛋白的特异性抗体，从而为该疫苗的开发奠定了基础。     

SmB/B’抗原表位的表达及其免疫原性研究

为了构建SmB/B’抗原表位的真核表达载体 ,通过体内、外进行表达并研究其免疫原性 ,采用异硫氰酸胍一步法提取BALB/c小鼠脾脏总RNA ,通过RT PCR方法克隆了含编码SmB/B’抗原表位的目的DNA ,构建了其真核表达质粒pcDNA3 fSmB/B’ ,体外转染HeLa细胞检测其表达及与抗体结合活性。体内采用基因免疫的方法对其免疫原性进行研究。结果 :成功构建pcDNA3 fSmB/B’真核表达质粒 ,Westernblot显示其在真核细胞内可有效表达且与抗SmB/B’抗体具有结合活性 ,经基因免疫实验组小鼠皆产生抗SmB/B’抗体。构建的SmB/B’抗原表位真核表达载体可在体内、外有效表达 ,且表达的抗原表位具有免疫原性     

SARS S603-620表位核酸疫苗诱导BLAB/c小鼠产生特异性体液免疫应答

目的构建SARSS抗原的B细胞表位核酸疫苗并观察其免疫效果。方法将已经鉴定的SARSS抗原的B细胞表位S603-620的编码DNA序列插入真核表达载体PCI中,构建核酸疫苗（PCI-S603-620）。使用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切,电泳及DNA测序鉴定。使用脂质体将PCI-S603-620转入293A细胞,使用ELISA检测其在真核细胞中的表达。使用PCI-S603-620免疫小鼠,ELISA检测其诱导的抗体情况。结果对PCI-S603-620进行酶切鉴定,电泳结果表明目的基因片段分子量为100bp左右。PCI-S603-620的DNA测序结果表明其序列与设计序列吻合。PCI-S603-620能在转染的293A细胞中表达。PCI-S603-620免疫小鼠可以诱导特异性抗体产生,效价为1：400。该抗体可以特异性识别SARSS抗原。结论成功构建SARSS抗原的B细胞表位核酸疫苗（PCI-S603-620）。     

LPS表位模拟肽诱导小鼠保护性免疫的研究

目的 鉴定三种LPS模拟位合成肽的抗原性、诱导抗LPS抗体的产生及对细菌攻击的保护性.方法 三种LPS模拟位合成肽与载体BSA交联后,ELISA测定其与多种抗LPS单、多克隆抗体的结合活性;合成肽与蓝载体交联物免疫Balb/c小鼠,观察其诱发小鼠体内抗LPS抗体产生的规律及血清抗LPS抗体效价;鉴定针对细菌感染的保护性效应. 结果 三种合成肽均能与抗鼠伤寒和大肠杆菌LPS抗体结合;用合成肽-蓝载体交联物免疫动物可诱发小鼠体内针对两种LPS的抗体反应,并对细菌攻击的免疫动物具不同程度的保护性作用,以合成肽13a,13b及12W与蓝载体交联物免疫的小鼠在鼠伤寒沙门氏菌攻击后存活时间分别为(6.5±0.77),(9.5±1.38)及(9.3±0.75) d,而PBS/蓝载体对照组存活时间为5 d.结论 本研究所采用的3种LPS表位模拟肽作为疫苗免疫小鼠能够产生针对细菌攻击的保护性效应,提示此3种表位模拟肽作为LPS交叉保护性疫苗候选的可行性与可靠性.     

基于Eppin优势中和B细胞表位的新型DNA避孕疫苗的制备和鉴定

目的制备基于Eppin优势中和B细胞表位的新型DNA避孕疫苗。方法采用PCR技术扩增mIL-4和Eppin B细胞表位基因,将其克隆到真核表达载体pVITR02-mcs,构建双盒表达载体,并将双盒表达质粒转染CHO细胞,检测其体外表达;将双盒表达质粒DNA与具有穿膜活性的HIV-1 TAT49-57阳离子肽,通过正负电荷吸引原理,制备成模拟病毒颗粒样的疫苗,并以DNA阻滞试验、DNaseⅠ保护试验和扫描透射电镜对该疫苗进行鉴定。结果 RT-PCR和免疫印迹结果表明转染细胞中均有目的分子的存在,在电荷比为4的条件下,该疫苗能形成类似病毒样的颗粒。结论成功制备了基于Eppin优势中和B细胞表位的模拟病毒颗粒样疫苗,为进一步研究避孕效果奠定了基础。     

HSV—1 SM44株糖蛋白D基因真核表达载体的构建及其免？…

目的 构建ＨＳＶ－１型ＳＭ４４株糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因的真核表达载体,并用此重组质粒直接免疫小鼠,探讨ＨＳＶ－１ ｇＤ基因作为基因疫苗的可能性。方法 从ＨＳＶ－１基因组中扩增ｇＤ的全编码基因,克隆入载体ｐＵＣ１９中,测序鉴定后转入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）。所得重组质粒ｐｃＤ－ＮＡ－ｇＤ以电穿孔法转染ＣＨＯ细胞,并以荧光染色法鉴定表达效果。用ｐｃＤＮＡ－ｇＤ免疫小鼠,ＥＬＩＳＡ法检测基因免疫     

HSV-2gD核酸疫苗的构建及免疫效果观察

目的:在前期筛选的HSV-2gD模拟抗原表位序列P6的基础上,以pcDNA3.1(-)为载体、IL-18为佐剂,构建P6与IL-18串联的重组表达质粒,并在真核细胞中表达。将重组质粒免疫小鼠,观察免疫效果。方法:采用串联简并引物PCR法构建重组质粒pcDNA3.1-IL18-P6和pcDNA3.1-IL18,以酶切、测序鉴定。将重组质粒分别转染CHO细胞进行瞬时表达,通过间接免疫荧光和Western blot法检测P6的表达情况。将构建的真核表达质粒肌内注射免疫接种BALB/c小鼠3次,每次间隔1周。末次免疫后1周眼眶静脉采血,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体滴度、IFN-γ及IL-18含量;末次免疫后1个月,处死小鼠,无菌分离脾脏,MTT法测定脾淋巴细胞增殖率。结果:构建的串联重组质粒pcDNA3.1-IL18-P6和pcDNA3.1-IL18经酶切及测序显示基因序列完全正确,经间接免疫荧光、Western blot法检测可证实模拟抗原表位序列P6具有近似天然序列的生物学活性。重组核酸疫苗pcDNA3.1-IL-18-HSV P6免疫小鼠后可刺激血清特异性抗体的产生,诱导分泌较高水平的IFN-γ和IL-18。可促进小鼠脾淋巴细胞的增殖。结论:成功构建和表达了重组质粒pcD-NA3.1-IL18-P6,其能诱导较强的细胞免疫和体液免疫,从而为构建更加有效的HSV-2DNA疫苗奠定了良好的基础。     

人β防御素-2与前列腺癌特异性膜抗原嵌合蛋白真核表达质粒构建及其诱导的小鼠特异性免疫应答

探索人β防御素2 (h BD- 2 )和前列腺特异性膜抗原(PSMA)共表达重组核酸疫苗针对前列腺癌的免疫治疗。研究以pc DNA3.1为载体,构建重组质粒pc DNA3.1/PSMA和pc DNA3.1/h BD- 2 - PSMA,通过RT- PCR和免疫组化检测其表达。免疫小鼠后,进行血清中抗体检测,CD4 、CD8 T淋巴细胞数目测定及CTL 特异性杀伤作用检测。结果显示构建的质粒转染COS- 7细胞后能表达目的基因,免疫小鼠后能在体内持久表达,可以诱导产生特异性抗体,能有效的刺激T细胞增生,诱导特异性CTL 反应。当以h BD- 2作为免疫佐剂时,CTL 活性更强。本研究成功的构建了含PSMA的表达质粒,免疫小鼠可以诱导出有效的体液和细胞免疫,为前列腺癌的免疫治疗奠定了一定的实验基础     

核小体Th表位和CTLA4Ig双基因共表达真核表达载体的构建

目的将核小体Th表位与CTLA4Ig融合基因融合，研究CTLA4Ig作为真核表达载体的可行性。方法用touchdown PCR法扩增CTLA4Ig基因，同时引入核小体Th表位（H2B14-28）。将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建pcDNA3．1（＋）-CTLA4Ig—H2B。将表达质粒转染COS-7细胞，Western blot检测转染细胞裂解上清中融合蛋白的表达。将构建表达CTLA4Ig—H2B的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207喂饲BALB／c小鼠，取脾脏进行免疫组化鉴定重组蛋白在动物体内的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3．1（＋）-CTLA4Ig—H2B质粒转染后48h细胞裂解上清中，检测到CTLA4Ig融合蛋白的表达，该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。重组蛋白在BALB／c小鼠脾脏免疫细胞胞浆中有阳性表达。结论成功构建了能稳定表达核小体Th表位和CTLA4Ig融合基因的真核表达载体。     

赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的真核表达及基因免疫

目的 在哺乳动物细胞中表达含有赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的重组质粒,并检测其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果.方法 以赖型钩端螺旋体全基因组为模板,PCR扩增出目的基因HlyX,以质粒pcDNA3.1为载体,双酶切构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,双酶切、PCR及测序鉴定重组质粒.将构建成功的重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达.将重组质粒免疫BALB/c小鼠,每两周1次,共3次,ELISA法检测小鼠的体液免疫应答水平.结果 扩增出全长约1100 bp的HlyX基因,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定表明重组质粒构建成功.RT-PCR检测显示重组质粒转染组能扩增出约1100 bp的目的基因片段,Western blot分析可见在相对分子质量(Mr)40×103左右出现特异性的目的条带.DNA免疫后诱导小鼠产生了较高的抗体水平(1∶6561～1∶19 683).结论 赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX真核表达质粒能够诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体,为其作为钩体DNA疫苗的研究和开发奠定了基础.     

幽门螺杆菌Lpp20核酸疫苗的构建及其免疫活性的初步研究

目的 构建幽门螺杆菌脂蛋白Lpp20基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Lpp20,并在HeLa细胞中进行表达.通过肌肉注射免疫C57BL/6小鼠,观察其诱导小鼠产生的体液免疫和细胞免疫应答水平.方法 用PCR法扩增Lpp20全基因,再将Lpp20基因克隆至pcDNA3.1(+)真核细胞表达载体构建pcDNA3.1(+)/Lpp20重组体,观察其在HeLa细胞中的表达.将核酸疫苗PcDNA3.1(+)/Lpp20、对照空质粒pcDNA3.1(+)及PBS分组通过肌肉注射免疫6周龄C57BL/6小鼠.隔2周免疫一次,共免疫4次.间接ELISA法测定小鼠血清中抗Lpp20 IgG抗体水平,双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应.通过PCR法检测小鼠肌细胞中Lpp20基因的存在.结果 小鼠接种pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗后能产生特异性IgG抗体,6周后ELISA测定血清抗体A450值为0.74,效价为1:1024.核酸疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ含量明显升高[(410.36±56.23)ps/ml],与空质粒组[(25.26±10.85)pg/ml]之间差异有统计学意义(P<0.01).脾淋巴细胞增殖反应测定,核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数(2.37±0.22)明显高于空质粒组(1.53±0.47)和PBS组(1.20±0.13),P<0.01.PCR检测Lpp20基因可在小鼠肌细胞中存在.结论 成功构建了pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗,且其在小鼠体内可诱导较强的特异性体液免疫和细胞免疫应答.为进一步研究该疫苗的免疫保护作用提供实验依据.     

乙型肝炎病毒多表位抗原基因真核表达载体的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

将自行设计、合成的乙型肝炎病毒多表位抗原基因BPT ,克隆入真核表达载体pCDNA3 1,构建重组质粒pCDNA3 1/BPT。后者经脂质体法转染小鼠BALB/c 3T3细胞 ,G4 18加压筛选出阳性转染细胞 ,并用间接免疫荧光法鉴定其在小鼠BALB/c 3T3细胞的表达。该重组质粒经胫骨前肌注射小鼠 ,10 0 μg/次每只小鼠 ,间隔 2周加强一次 ,共 3次。免疫诱发了特异性抗体和淋巴细胞增殖反应 ,并用PCR法在小鼠的心脏、肝脏及肺组织中检测到pCDNA3 1/BPT ,这为研究HBV多表达抗原的核酸疫苗提供了初步的资料