HPV31 L1 C端截短基因可在昆虫细胞表达体系中高水平制备L1 VLP疫苗

目的利用昆虫细胞表达体系制备人乳头瘤病毒(HPV)31 L1病毒样颗粒(VLP)疫苗。方法化学合成法获得昆虫Sf9细胞偏性密码子优化的、C端删除27个氨基酸编码序列的HPV31 L1截短基因(HPV31 L1MΔC),构建重组杆状病毒,感染Sf9细胞进行表达;分别采用超声破碎、含离子型表面活性剂(1%SDS等)或含非离子型表面活性剂(0.5%TritonX-100)的裂解缓冲液,制备细胞裂解上清;氯化铯超速离心法纯化后经动态光散射及透射电子显微镜鉴定;0.1μg的HPV31 L1MΔC VLP于第0和2周肌肉免疫BALB/c小鼠,第4周采集血清分析中和活性。结果 3种裂解方法制备的上清均显示HPV31 L1MΔC蛋白的特异表达,其表达量约占裂解上清总蛋白的10%;采用非离子型表面活性剂获得的裂解上清纯化后,目的蛋白纯度高,产量达11.5 mg/L;纯化蛋白的水化分子直径为103.3 nm,均一性好;电镜分析为直径50～60 nm的VLP。免疫血清中HPV31中和抗体滴度为1 440。结论 HPV31 L1MΔC在昆虫细胞表达体系制备的VLP产量高、免疫原性好,可用于生产含HPV31 L1 VLP的多价疫苗。     

人乳头瘤病毒58型衣壳蛋白的表达及其抗体制备

目的：构建人乳头瘤病毒58型(hpv58)衣壳蛋白L1的杆状病毒，昆虫细胞表达系统。方法：用杆状病毒，昆虫细胞表达系统大量表达HPV58L1蛋白，并用HPV58L1病毒相似颗粒(VLP)免疫BALB／c小鼠制备特异性抗血清。结果：HPV58L1蛋白在SF9细胞中被高效表达，其相对分子质量为55kD；CsCI超速离心结合蔗糖密度超速离心可纯化此蛋白。在电镜下可见纯化的病毒衣壳蛋白L1形成VLP。用其免疫小鼠制备的相应抗体能与HPV58L1特异性结合。结论：成功表达了HPV58衣壳蛋白L1，并制备出高滴度的抗体。     

人乳头瘤病毒16型晚期蛋白L1的表达及病毒样颗粒的装配

目的　在昆虫细胞中表达人乳头瘤病毒 16型 (HPV16 )哈尔滨地区分离株的晚期蛋白L1,并分离纯化由L1蛋白在细胞中自主组装成的病毒样颗粒 ,为HPV16预防性疫苗的研制奠定基础。方法　获得含有HPV16L1基因的重组杆状病毒并使目的蛋白L1在昆虫细胞中表达 ;对重组杆状病毒的扩增条件及L1蛋白的表达水平进行优化 ;电镜下观察昆虫细胞中晚期蛋白装配成病毒样颗粒的情况 ,经氯化铯密度梯度纯化病毒样颗粒 ,并经Westernblot进行验证。结果　获得了稳定表达L1蛋白的重组杆状病毒 ;以MOI值为 0 .2感染昆虫细胞可获得较高滴度的重组病毒 ,以MOI值为 10感染昆虫细胞可获得较高水平的L1蛋白表达 ;电镜下可观察到昆虫细胞核内直径为 5 5nm的病毒样颗粒 ;病毒样颗粒可通过氯化铯密度梯度离心获得。结论　获得人乳头瘤病毒哈尔滨地区分离株L1蛋白可在昆虫细胞中自主装配的病毒样颗粒并成功分离纯化。     

人乳头瘤病毒58型L1壳蛋白在原核细胞中的高效表达及抗体制备

目的 人乳头瘤病毒58型（HPV58）是重要的高度致瘤性病毒之一。用原核细胞表达HPV58L1主要壳蛋白（McP）,并制备相应抗体血清,为基因工程疫苗研制打下基础。方法 用聚合酶链反应(PCR）扩增HPV58L1完整编码区基因,并克隆、测序。构建原核表达载体pRSETB58L1,表达的L1蛋白经SDS－PAGE纯化,免疫BALB／c小鼠。结果 在原核细胞中表达了HPV58L1壳蛋白,该壳蛋白的相对分子质量为60000,此蛋白与HPV16L1抗有交叉反应。获得抗HPV58L1壳蛋白特异性抗体,抗体滴度为1：80,并用该抗体屯昆虫细胞中表达的HPV58L1壳蛋白。结论 HPV58壳蛋白在原核细胞中获得的有效表达,纯化免疫小鼠后能产生抗HPV58L1特异性抗体,此抗体可用于鉴定真核细胞表达的HPV58L1壳蛋白。     

人乳头瘤病毒16型野毒株L1-E7融合基因重组腺病毒载体构建及在293细胞中表达嵌合病毒样颗粒的研究

目的制备人乳头瘤病毒HPV16L1-E7重组腺病毒,以期获得防治宫颈癌的重组腺病毒减毒活疫苗。方法以HPV16型的野毒株HPV16-114/K为模板,利用PCR克隆技术制备HPV16L1-E7融合基因pUC19L1-E7,含L1的1～301氨基酸（AA）和E7的1～60AA的编码DNA序列;并转入腺病毒穿梭质粒pCA14L1-E7,与腺病毒质粒pBHG10共转染293细胞,筛选重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7。以PCR、ELISA和Westernblot方法鉴定重组病毒及其表达的L1-E7蛋白,密度梯度超速离心纯化HPV16嵌合L1-E7VLP,电镜观察VLP的形态结构。结果PCR-DNA序列分析表明成功构建了HPV16L1-E7重组质粒pUC19L1-E7;并获得HPV16重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7,在293细胞中可高效表达L1-E7蛋白,并形成嵌合病毒样颗粒（cVLP）。结论构建的重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7可有效表达HPV16L1-E7cVLP,可进一步用于动物实验,研究其在防治宫颈癌中的作用。     

悬浮培养昆虫细胞表达重组HPV16 L1蛋白

目的 用悬浮培养昆虫细胞方式表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1蛋白,为获得病毒样颗粒(VLPs)及进一步深入研究疫苗和诊断试剂盒打基础.方法 优化昆虫细胞Sf9的悬浮培养条件;优化扩增病毒和蛋白的条件;空斑试验测定病毒滴度;SDS-PAGE和Western Blot分析目的蛋白的表达情况;透射电镜观察细胞内HPV16 L1蛋白形成的VLPs.结果 优化后,悬浮培养昆虫细胞初始接种密度为5×105cell/ml,以MOI(Multiplicity ofInfection)=10接种重组病毒rBacV/HPV16 L1,72～84h收获细胞沉淀为最佳.经透射电镜观察,在重组病毒感染的昆虫细胞内,存在HPV16L1蛋白形成的VLPs.结论 优化了细胞悬浮培养、病毒扩增和蛋白表达的条件;电镜观察在重组病毒rBacV/HPV16L1感染的昆虫细胞中,HPV16 L1蛋白可形成VLPs.     

重组人乳头瘤病毒6型病毒样颗粒的免疫原性分析

目的　研究重组人乳头瘤病毒 6型 (humanpapillomavirustype 6 ,HPV 6 )病毒样颗粒(virus likeparticle ,VLP)的免疫原性。方法　重组杆状病毒在昆虫细胞中表达制备的HPV 6L1VLP(L1 VLP)和HPV 6L1+L2VLP(L1+2 VLP)经鉴定后 ,用于免疫BALB/c小鼠 ,对诱导的体液免疫和细胞免疫反应进行了检测。结果　电镜观察显示L1 VLP和L1+2 VLP二者形态上无明显差异 ,为圆形颗粒 ,直径约 5 0nm ,SDS PAGE和Westernblot分析表明 ,L1+2 VLP中L1和L2蛋白摩尔比例为 4∶1。用ELISA法测定免疫小鼠血清抗体滴度 ,加佐剂L1 VLP免疫组和加佐剂L1+2 VLP免疫组血清针对HPV 6L1VLP的滴度在 1∶10 0 0 0以上 ,高于未加佐剂组免疫血清滴度 (1∶2 0 0 0 ) ,L1+2 VLP免疫诱导出了特异于L2抗原的抗体。血清抗体主要识别HPV 6构象依赖性抗原表位 ,与HPV 11抗原显示出一定的交叉反应 ,而与HPV 16无明显交叉反应。免疫小鼠脾淋巴细胞体外经HPV 6L1VLP再激活后出现了特异性增殖反应 ,3H TdR掺入值与未免疫组之间差异有显著性 (P <0 .0 1) ,L1 VLP和L1+2 VLP两组间差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,L1 VLP和L1+2 VLP免疫组刺激指数 (SI)分别为 6 .4和 6 .2 ,阴性对照组SI为 1.1。HPV 6L1VLP再刺激特异地诱导免疫组脾淋巴细胞IL 2和IL 10分     

昆虫细胞表达的HPV-58 L1病毒样颗粒的层析纯化及免疫原性分析

目的 探索利用昆虫杆状病毒表达系统（IBEVS）表达的重组人乳头瘤病毒（HPV）58型主要衣壳蛋白L1病毒样颗粒（VLP）的简单可行的层析分离方法。方法 收集高水平表达HPV-58 L1的昆虫细胞并制备裂解上清,建立硫酸铵沉淀（ASP）联合层析法纯化L1蛋白的最佳条件,对纯化后的蛋白进行体外组装。对L1蛋白的纯化各个阶段中的组分、最终产品（纯品蛋白）及组装状态进行理化性质鉴定,分析其免疫原性。结果 30%饱和硫酸铵（AS）分级分离后,L1蛋白得率为72%,纯度为9.34%;阴离子交换层析经300 mmol/L NaCl缓冲液洗脱后,L1蛋白得率>90%,纯度为13.6%;进一步经羟基磷灰石层析收获流穿液后,L1蛋白得率>80%,宿主蛋白质残留（HCPs）分析和L1蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色显示蛋白纯度>99%。经上述3步分离纯化的L1蛋白,其总得率为55.7%,每升细胞悬浮培养液（约3.0×10⁹个细胞）产量为57～65 mg。动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）分析显示,L1蛋白组装成了形状均一、直径约55 nm的VLPs。该法制...     

昆虫细胞表达的HPV-58 L1病毒样颗粒的层析纯化及免疫原性分析

目的 探索利用昆虫杆状病毒表达系统（IBEVS）表达的重组人乳头瘤病毒（HPV）58型主要衣壳蛋白L1病毒样颗粒（VLP）的简单可行的层析分离方法。方法 收集高水平表达HPV-58 L1的昆虫细胞并制备裂解上清,建立硫酸铵沉淀（ASP）联合层析法纯化L1蛋白的最佳条件,对纯化后的蛋白进行体外组装。对L1蛋白的纯化各个阶段中的组分、最终产品（纯品蛋白）及组装状态进行理化性质鉴定,分析其免疫原性。结果 30%饱和硫酸铵（AS）分级分离后,L1蛋白得率为72%,纯度为9.34%;阴离子交换层析经300 mmol/L NaCl缓冲液洗脱后,L1蛋白得率>90%,纯度为13.6%;进一步经羟基磷灰石层析收获流穿液后,L1蛋白得率>80%,宿主蛋白质残留（HCPs）分析和L1蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色显示蛋白纯度>99%。经上述3步分离纯化的L1蛋白,其总得率为55.7%,每升细胞悬浮培养液（约3.0×10⁹个细胞）产量为57～65 mg。动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）分析显示,L1蛋白组装成了形状均一、直径约55 nm的VLPs。该法制...     

Antibody response for L1, E6 and E7 HPV 16 and HPV 18 antigens in Tunisian women with cervical cancer and controls

Results obtained in the present work indicated that the Luminex assay is more sensitive than ELISA. The reactivity to the early antigens E6 and E7 was 37% versus 42% for HPV 16 and 21% versus 20% for HPV 18 among cervical cancer cases using ELISA. However, these ratios were 44% and 61%, respectively, for E6 and E7 HPV 16 versus 28% and 21% for E6 and E7 HPV 18 when using the Luminex technique. Data also indicated that HPV 16 and HPV 18 showed distinct profiles for the different antigens tested. Finally, the differences in antibody responses between cervical cancer cases and benign cases toward the different antigens were significant.     

HPV18 L1基因重组DNA构建及其免疫小鼠体内特异抗体的测定

目的：人类乳头瘤病毒１８型（ＬＰＶ１８）感染与宫颈癌的发生高度相关。其晚期基因Ｌ１编码的Ｌ１结构蛋白是刺激机体产生中和抗体的主要抗原。利用ＨＰＶ Ｌ１基因重组质粒进行ＤＮＡ疫苗的初步免疫学实验研究。方法：从ＨＰＶ１８－ｐＢＲ３２２质粒中扩增ＨＰＶ１８ Ｌ１基因,测序证明扩增片段的可靠性,构建了两个真核表达重组质粒ＨＰＶ１８ Ｌ１－ｐｃＤＮＡ３和ＨＰＶ１８Ｌ１－ｐｃＥＰ４。将提纯的质粒ＤＮＡ直接免疫     

Nuclear import strategies of high-risk HPV18 L2 minor capsid protein

We have investigated the nuclear import strategies of high-risk HPV18 L2 minor capsid protein. HPV18 L2 interacts with Kap α₂ adapter, and Kap β₂ and Kap β₃ nuclear import receptors. Moreover, binding of RanGTP to either Kap β₂ or Kap β₃ inhibits their interaction with L2, suggesting that these Kap β/L2 complexes are import competent. Mapping studies show that HPV18 L2 contains two NLSs: in the N-terminus (nNLS) and in the C-terminus (cNLS), both of which can independently mediate nuclear import. Both nNLS and cNLS form a complex with Kap α₂β₁ heterodimer and mediate nuclear import via a classical pathway. The nNLS is also essential for the interaction of HPV18 L2 with Kap β₂ and Kap β₃. Interestingly, both nNLS and cNLS interact with the viral DNA and this DNA binding occurs without nucleotide sequence specificity. Together, the data suggest that HPV18 L2 can interact via its NLSs with several Kaps and the viral DNA and may enter the nucleus via multiple import pathways mediated by Kap α₂β₁ heterodimers, Kap β₂ and Kap β₃.     

Human Papillomavirus (HPV) L1 and L1-L2 Virus-Like Particle-Based Multiplex Assays for Measurement of HPV Virion Antibodies

Humoral immunity to human papillomavirus (HPV) has not been fully characterized, and there is currently no standard serologic test for the measurement of HPV antibodies. Most HPV serologic assays developed to date are based on virus-like particles (VLPs) of the major HPV capsid protein, L1. We sought to compare the performance of a multiplex HPV L1 VLP-based serologic assay to that of an assay based on VLPs comprised of both L1 and the minor capsid, L2. We developed HPV L1 VLP and L1-L2 VLP-based multiplex seroassays for the detection of HPV type 16 (HPV16) and HPV18 virion binding antibodies using Luminex fluorescent bead technology. We compared the performance of these assays to that of established pseudovirion-based neutralization and L1 VLP-based enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs). A total of 391 serum specimens from unvaccinated adult males and females were tested. The L1 and L1-L2 VLP multiplex seroassays each demonstrated substantial agreement with both the neutralization assays and the ELISAs for the detection of HPV16 antibodies (κ = 0.60 to 0.64). However, the L1-L2 VLP seroassay demonstrated better agreement with neutralization assays for the detection of HPV18 antibodies than the L1 VLP seroassay (κ = 0.74 and 0.43, respectively). L1 and L1-L2 VLP seroassays showed excellent agreement with one another for the detection of HPV16 antibodies (κ = 0.86) but only moderate agreement for HPV18 antibodies (κ = 0.44). The HPV L1-L2 VLP seroassay performs well for the concurrent measurement of HPV16 and -18 antibodies in large numbers of samples and may be extended to include other HPV types.     

Expression of HPV L1 capsid protein in cervical specimens with HPV infection

We tried to investigate the expression rate of human papillomavirus (HPV) L1 capsid protein in uterine cervical specimens and correlate it with the grade of dysplasia, HPV genotype and age of the patients. Among uterine cervical specimens proved to have HPV by DNA genotyping test, eighty cytology-biopsy matched cases and 22 unmatched cytology specimens were selected. Immunostaining for L1 capsid protein was performed on both cervical smears and tissue sections. The L1 capsid protein was expressed mainly in the nuclei, but occasionally in the cytoplasm of cells located in the superficial layer of squamous epithelium. The immunostaining for L1 capsid protein showed positive reaction in 47 cases (46.1%) of cervical smears and in 10 cases (12.5%) of tissue sections (P = 0.001). Cytologic diagnosis revealed a higher expression rate in LSILs (25/33; 75.8%) than in HSILs and cervical cancers (8/20; 40.0% and 2/5; 40%, respectively) (P = 0.006). In LSILs, cases with low-risk type HPV showed a higher L1 capsid expression rate than those with the high-risk type HPV (88.9% vs. 70.8%). The L1 capsid expression rate decreased in the over-40-year-old age group compared to the younger age (49.2% vs. 50.8%). Cytology smears were superior to tissue sections for the detection of L1 capsid protein expression. LSILs and HPV low-risk group showed higher L1 capsid expression rate than HSILs and HPV high-risk group, which suggests that L1 capsid expression might be related to a favorable disease biology.     

人乳头瘤病毒16L1原核表达质粒的构建

目的：构建人乳头瘤病毒16L1的原核表达质粒，为下一步探讨蛋白的表达以及蛋白的功能研究作准备。方法：以临床HPV16阳性标本为模板，PCR扩增L1的片段，L1片段经EcoRI和SalⅠ双酶切后，插入载体pGEX4T-1，转化JM109感受态细胞，平板筛选获得pGEX4T-1／HPV L1的阳性质粒。通过酶切、测序验证质粒的正确性。结果：构建了原核表达质粒pGEX4T-1／HPV16L1，并通过酶切、测序等方法验证其完全正确。结论：成功构建的pGEX4T-1／HPVL1为今后的蛋白的表达和功能研究打好了坚实的基础，为HPV16的疫苗研究提供了有益的支持。     

人乳头瘤病毒16型L1基因真核表达质粒的构建及鉴定

研究表明 ,高危型人乳头瘤病毒 1 6型 (Humanpapillo mavirustype 1 6 ,HPV1 6 )的感染与宫颈癌及人类许多肿瘤的发生密切相关。HPV1 6晚期基因L1 (Latergene ,L)编码病毒主要衣壳蛋白 ,能刺激机体产生抗体[1 ] ,保护机体不受同型别HPV的感染 ,体外实验也证明L1蛋白上存在有T细胞和B细胞免疫识别表位 ,是研制HPV预防性疫苗的重要靶抗原之一。自然感染的HPV1 6免疫原性低下 ,不能有效激发机体产生特异性抗肿瘤免疫效应。通过DNA疫苗介导的免疫可望达到增强免疫、防治HPV相关肿瘤的目的 ,具有良好的应用前景[2 ] 。本实验拟构建并…     

乳腺浸润性导管癌中HPV18、HPV16感染的研究

目的 :了解乳腺浸润性导管癌中HPV18、HPV16的感染情况 ,分析其是否是乳腺癌发生的危险因素及与临床病理的相关性。方法 :根据HPV16、HPV18的DNA序列 ,合成相应特异的寡核苷酸片段 ,用加尾标记法制备地高辛标记探针 ,用原位杂交法检测 5 1例乳腺浸润性导管癌、10例相应正常乳腺上皮及 15例良性乳腺病变中HPV18、HPV16的感染 ,并分析其与患者发病年龄、肿块大小及淋巴结转移的相关性。结果 :浸润性导管癌中HPV18或 16的总阳性率达 70 6 % ,其中HPV18与HPV16的阳性率分别为 5 8 8%、4 5 1% ,均明显高于正常乳腺上皮的感染率 (30 0 %、10 0 % ;P <0 0 5 ) ;乳腺良性病变的HPV18、16阳性率分别是 6 0 0 %、6 0 % ,其中HPV18的阳性率亦显著高于正常乳腺上皮 (P <0 0 5 )。结论 :(1)HPV16和18可能是乳腺浸润性导管癌发生的致病因子 ,HPV18尚可能与乳腺良性病变的发生有关。 (2 )HPV的感染与患者年龄、肿块大小及淋巴结转移无相关性。     

人乳头状瘤病毒(HPV)16L1病毒样颗粒蛋白与HPV16L1基因联合免疫的体液免疫反应及其抗体的体外中和实验

目的用含有编码人乳头状瘤病毒(HPV)16L1和HPV16L1病毒样颗粒(VLP)蛋白联合免疫小鼠,与用HPV16L1重组表达质粒比较,观察VLP蛋白免疫对免疫小鼠产生抗体的增强作用,以及抗体的体外中和作用,寻找研制HPV16感染的预防性疫苗的有效途径。方法将c57BL／6小鼠,随机分为4组：Ⅰ组：pcDNA-L1(100μl/鼠),Ⅱ组：pcDNA—L1(70μl/鼠) HPV16K1 VLP,Ⅲ组：pcDNA3.1(100μl/鼠)空质粒,Ⅳ组：PBS缓冲液。质粒免疫3次,间隔3周。ELISA法检测其血清抗体,红细胞凝集实验和HPV16病毒样颗粒结合抑制实验体外检测抗体的中和活性。结果pcDNA-L1 HPV16L1 VLP较pcDNA—L1免疫组,3次免疫后的抗体水平均增高,尤其以第2次和第3次免疫后的抗体水平增加更显著。pcDNA—L1 HPV16L1 VLP联合免疫组血清的抑制活性高于pcDNA—L1免疫组,且．He[a细胞结合抑制实验染色呈阴性。结论HPV16L1 VLP联合免疫可以增加目的抗原的中和抗体产生,可能是HPV16有效预防性疫苗研制的更有希望的策略。