酶双循环法测定一氧化氮合酶活性实验条件探讨

目的运用W ang法与酶双循环法联合测定血清中一氧化氮合酶(NOS)活性。方法先改良W ang法测定NOS活性的实验条件,再探讨W ang法与酶双循环法偶联的实验条件,比较酶双循环前后检测物性质。结果总NOS(tNOS)测定试剂由20 mmol/L L-精氨酸、25μmol/L还原型辅酶Ⅱ(NADPH H )、50.0μmol/LCaC l2、45.0μmol/L二硫苏糖醇(DTT)、36.0μmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、1.8μmol/L苯甲磺酰氯(PMSF)、80μmol/L尼克酰胺、1μg/m l钙调蛋白(CalM)和10μg/m l蛋白酶抑制剂Antipain组成。以上试剂添加诱导性NOS(iNOS)抑制剂NW-硝基-D-精氨酸用于测定结构型NOS(cNOS)。对NOS生成的氧化型辅酶Ⅱ(NADP )采用酶双循环产物6-磷酸葡萄糖酸(6PG)脱氢生成的大量NADPH H ,其放大倍数约为70~80倍。结论酶双循环法提高了测定NOS的灵敏度。     

酶学检测精氨琥珀酸酶方法的建立

目的建立酶学检测精氨琥珀酸酶（ASAL）的方法。方法精氨琥珀酸在ASAL的作用下生成精氨酸和延胡索酸,后者被延胡索酸酶催化生成苹果酸,苹果酸被苹果酸脱氢酶催化生成草酰乙酸,同时NAD^＋（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,即辅酶Ⅰ）还原为NADH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）。pH9．0的肼-甘氨酸缓冲液使反应完全。结果ASAL回收率为97％,在0～87U／L内为线性;批内变异系数（CV）为5．3％,天间CV为6．5％;改良酶学检测方法对255μmol／L胆红素无影响;对0．1g／L血红蛋白有轻度影响。结论所建立的酶学检测方法结果准确可靠,易自动化。     

液体单试剂检测血氨方法的建立

目的配制液体单试剂，建立酶两点动力法测定血浆中血氨含量。方法在荷兰威图科学公司DPU-41型半自动生化仪和美国贝克曼公司CX5-CE型全自动生化仪上研究酶两点动力法，建立实验参数。结果试剂含量：三乙醇胺缓冲液（pH7．4）0．25mol／L，α-酮戊二酸15mmol／L，还原型辅酶0．3mmol／L，谷氨酸脱氢酶大于160U／L。该法最低检出限为1．9μmol／L，线性范围达321μmol／L（r=0．9961），批内CV=2．2％，批间CV=4．4％，平均回收率=99．3％，胆红素〈175．8μmol／L，血红蛋白〈3．4g／L，对测定结果无显著影响。结论本法灵敏度高，线性、精密度好，结果准确，胆红素、血红蛋白干扰小，操作简便，适用于全自动及半自动生化分析仪，可推广运用。     

尿素酰基裂解酶酶偶联法测定血清总钙

目的 介绍尿素酰基裂解酶酶偶联测定血清总钙的方法。方法 双试剂两点法；缓冲液为三乙醇胺（TEA，pH8.0,200mmol/L）；试剂I：含NaHCO326.0mmol/L,NADPH 0.4mmol/L,α－酮戊二酸8.0mmol/L，尿素酰基裂解酶115U／L，GLDH43．0kU/L；试剂Ⅱ：含NaCO3 26.0mmol/L,ATP6.2mmol/L。结果 方法线性范围为0．5－5．0mmol/L，批内和批间平均变异系数分别为2．13％和2．69％。平均回收率为102．7％ 。本法（Y）与邻甲酚酞络合酮法（OCPC法，X1）比较：r＝0．981，Y1＝1．02X1－0．021，与偶氮胂Ⅲ法（X2）比较：r＝0．978，Y＝0．99X2＋0．03。血清胆红素高达300μmol/L，血红蛋白4g/L，镁2.5mmol/L，NH4^ 2.0mmol/L,Trig 8.0mmol/L对本法无明显干扰。结论 本法具有简便、准确、快速，适用于自动分析等特点。     

碳酸酐酶法测定乳汁锌

目的建立灵敏、准确、特异且试剂稳定的碳酸酐酶法测定乳汁锌。方法乳汁灰化后溶于0．1mol／L HCl．测定前先用0．01mol／L NaOH稀释并中和酸．测定时待分析液巾锌离子复活脱辅基的碳酸酐酶，以醋酸对硝基酚作为酶促反应底物进行测定。结果线性范围达61．2μmol／L。回收率95．6％～103．8％，批内和批间变异系数分别小于3．5％与4．9％，本法（X）与原子吸收分光光度法（Y）比较具有良好的相关性，Y=0．986X＋0．033,r=0．988。Cu^2＋、Fe^3＋、Mn^2＋各200μmol／L对锌测定均无影响；Co^2＋10μmol，L以下对本法测定乳汁锌结果也无干扰。结论该法具有特异、准确、灵敏且试剂稳定等优点．适合于生化分析仪检测乳汁锌。     

酶双循环法测定血清中NOS的活性

一氧化氮合酶(NOS)催化精氨酸、NADPH H 和O2,生成胍氨酸、NADP 、NO。以往NOS活性测定的方法主要是测定胍氨酸和NO的含量,由于方法学的弊病使其应用范围受限。W ang[1]建立了生物组织中测定NOS的酶双循环方法,其放大倍数为1000~4000。目前尚未见用酶双循环法测定血清NOS活性的     

高磷对血管平滑肌钙化的影响及骨保护素干预作用

目的研究高磷对大鼠血管平滑肌细胞（RVSMC）钙化的影响和骨保护素（OPG）mRNA表达的影响,及骨保护素对高磷诱导RVSMC钙化的作用及其相关机制。方法用不同的试剂培养RVSMC,分别为正常磷组（Pi1.4mmol/L）、高磷组（Pi2.0mmol/L、Pi2.6mmol/L）、凋亡抑制组（Pi2.6mmol/L＋ZVAD.FMK0.1μmol/L,Pi2.6mmol/L＋ZVAD.FMK1.0μmol/L,Pi2.6mmol/L＋ZVAD.FMK2.0μmol/L）、骨保护素组（Pi2.6mmol/L＋OPG1μg/ml,Pi2.6mmol/L＋OPG10μg/ml,Pi2.6mmol/L＋OPG100μg/ml）。全自动生化仪比色法测定钙含量,BCA法测定蛋白含量,用蛋白含量标化钙含量。同时行VonKossa染色观察细胞钙化情况。用半定量PCR（RT-PCR）法检测RVSMCOPGmRNA的表达。流式细胞仪测定各组的细胞凋亡量。结果①培养3天,6天,9天时,高磷组（Pi2.0mmol/L,Pi2.6mmol/L）与Pi1.4mmol/L相比,RVSMC钙沉积较多（P＆lt;0.05）;②培养第6天时,Pi2．6mmol／L＋ZVAD．FNK0．1μmol／L组的钙沉积与Pi2．6mmol／L组相比无统计学差异,而Pi2．6mmol／L＋ZVAD．FMK1．0μmol／L,Pi2．6mmol／L＋ZVAD．FMK2．0μmol／L组与Pi2．6μmol／L组相比,RVSMC钙沉积较少（P〈0．05）。Pi2．6mmol／L＋OPG10μg／ml、Pi2．6mmol／L＋OPG100μg／ml组与Pi2．6mmol／L组相比,细胞钙沉积较少（P〈0．05）。Pi2．6mmol／L＋OPG100μg／ml与Pi2．6mmol／L相比,细胞钙沉积明显降低（P〈0．01）;③Von Kossa染色显录Pi1．4mmol／L组钙化不明显．Pi2．6mmol／L组细胞有大量黑色颗粒沉积而Pi2．6mmol／L＋OPG100μg／ml组较少。培养第6天时,Pi2．6mmol／L组与Pi2．0mmol／L组;Pi2．0mmol／L,Pil．4mmol／L相比,OPG mRNA表达较多（P〈0．05）。培养第6天时,Pi2．6mmol／L与Pi1．4mmol／L相比,细胞凋亡量较多（P〈0．05）;Pi2．6mmol／L＋OPG100μg／ml与Pi2．6mmol／L相比细胞凋亡量较少（P〈0．05）。结论高磷可能通过诱导RVSMC凋亡而导致钙化,骨保护素对高磷诱导的RVSMC钙化有保护作用,此作用与其降低RVSMC凋亡有关。     

用自动酶法检测血清和尿中肌酸含量

我这里介绍一个用自动酶法测定血和尿中肌酸含量的方法．该法不需预先处理标本，肌酸激酶（CK）和丙酮酸激酶（PK）作为辅酶，乳酸脱氨酶（LD）用作反应的指示剂。CK也被用作初始反应剂，现在的方法与Jaffe法相比，提高了精密度，血肌酸正常参考值：男13～74μmol／L.．女13～89μmol／L．24h尿肌酸；男175～70pμmol／L女150～1200μmol／L.1仪器Hitachi704自动分析仪(BoehringerMannheimMannheim,Germany)2试剂2.1试剂1甘氨酸－MgCl2缓冲液（0．25mol／L甘氨t，16uunol／LMPCI：．PHg．0）测血清中肌酸时，该皈加上ATP370mg…     

不同方法测定同型半胱氨酸结果比较分析

目的探讨目前临床化学实验室测定同型半胱氨酸（Hcy）主要方法学的差异。方法选取2011年1月至今,重庆市西郊医院住院患者中存在心血管疾病家族史的病例35例,冠状动脉狭窄病例43例,慢性肾脏功能障碍病例55例,肝功能损伤病例68例,健康体检人群169例,分别采用甲基转移酶方法试剂与胱硫醚方法测定试剂进行Hcy测定,并且采用成对t检验比较结果。结果采用甲基转移酶循环法与胱硫醚循环法进行Hcy测定,心血管疾病家族史组Hcy水平分别为（19．3±5．3）μmol／L与（18．6士6．4）μmol／L;冠状动脉狭窄组Hcy水平分别为（23．5土4．5）μmol／L与（24．7士5．1）μmol／L;慢性肾脏功能障碍组Hcy水平分剐为（5．3±2．4）μmol／L与（5．7±3．1）μmol／L;肝功能损伤组Hcy水平分剐为（6．7±3．7）μmol／L与（6．5±4．1）μmol／L;健康体检组Hcy水平分别为（4．3±2．5）μmol／L与（4．8±3．0）μmol／L。结论不同方法测定Hcy水平并无明显差异,但血清中的特殊成分会对测定结果造成不同程度的影响。     

Na^＋／H^＋交换抑制剂HMA抑制低氧刺激的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖

目的：观察低氧培养对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响。以及Na^＋／H^＋交换抑制剂HMA对此增殖效应的抑制作用。 方法：实验于2004-12／2005-06在第四军医大学病理生理学教研室完成。健康SD大鼠2只，分离培养肺动脉平滑肌细胞，选择3-6代生长良好的细胞在常氧（O2的体积分数为0．21）或低氧（O2的体积分数为0．02）条件下培养，并分别给予0．3，1，3和10μmol／L等不同浓度的HMA（n=8），采用噻唑蓝比色实验和测定细胞总蛋白含量的方法观察细胞增殖情况，同时光镜观察细胞形态并测定培养液上清乳酸脱氢酶活力以反映药物的非特异性细胞毒作用。 结果：实验所用细胞样本均进入结果分析。①体积分数为0．02氧浓度较体积分数为0．05氧浓度下培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞生长曲线抬高，低氧刺激24h增殖达到高峰。②体积分数为0．05血清培养使此增殖效应更为显著[噻唑蓝光吸收值无血清常氧组（0．238&;#177;0．011），无血清低氧组（0．280&;#177;0加9），体积分数为0．05血清常氧组（0．313&;#177;0．013），体积分数为0．05血清低氧组（0．389&;#177;0．011）]。③HMA可以抑制增殖，显著降低噻唑蓝吸光度值[对照组（0．391&;#177;0．011），0．3μmol／L组（0．377&;#177;0．010），1μmol／L组（0．328&;#177;0．012），3μmol／L组（0．289&;#177;0．006），10μmol／L组（0．246&;#177;0．007）]。④细胞总蛋白含量也显著降低[对照组、0．3μmol／L组、1μmol／L组、3μmol／L组、10μmol／L组分别为（193．30&;#177;8．51）．（177．63&;#177;821），（166．84&;#177;9．48），（155．72&;#177;10.46）和（135．13&;#177;10．30）mnol／L]。⑤各浓度处理组细胞形态无改变，培养液上清乳酸脱氢酶活力也无明显变化[对照组、0．3μmol／L组、1μmol／L组、3μmol／L组、10μmol／L组分别为（212．23&;#177;8．44），（208．80&;#177;6．37），（209．79&;#177;7．12），（208．77&;#177;7．33），（215．42&;#177;7．81）U／L]，细胞无明显损伤。 结论：0．3-10μmol／L浓度的Na^＋／H^＋交换抑制剂HMA可以有效抑制低氧刺激的大鼠肺动脉平滑肌增殖，此作用不是非特异的细胞毒作用所致。