日本血吸虫DNA疫苗的构建及其保护性免疫的研究

为探讨血吸虫ＤＮＡ疫苗保护性免疫效果,首先构建、鉴定和表达日本血吸虫ＤＮＡ疫苗（ｐＣＤ－Ｓｊ３２）。实验结果表明：ｐＣＤ－Ｓｊ３２免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠能诱导产生抗日本血吸虫感染免疫力,减虫率为３５．６％～４４．４％,减卵率为３９．４％～６９．０％;１００μｇＤＮＡ一次肌肉注射,免疫后８周攻击感染组的效果好;ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞、ＩＬ－２、ＴＮＦ和ＩＮＦ－γ可能在血吸虫病免疫功能调控中起重要作用;ｐＣＤ－Ｓｊ３２能诱导宿主产生高滴度特异性抗体,并在体外能介导巨噬细胞产生抗体依赖细胞介导的细胞毒性（ＡＤＣＣ）免疫效应。结果提示,ｐＣＤ－Ｓｊ３２有可能发展为新的预防血吸虫病的亚单位疫苗。     

血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗接种后保护力的观察

为了探讨血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗免疫鼠后对尾蚴攻击感染的保护性作用,采用１０６ＣＦＵ和１０８ＣＦＵ重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗皮下接种ＢＡＬＢ／Ｃ鼠,接种后８周用日本血吸虫尾蚴进行攻击感染,感染后６周剖杀小鼠,计算减虫率、减卵率,同时进行虫卵肉芽肿周长和面积测量,以及抗体水平和抗原水平测定,同时设有ＰＢＳ对照组。结果表明重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗免疫小鼠后,１０６ＣＦＵ、１０８ＣＦＵ组与对照组相比,减虫率分别为２７．３４％、１６．６４％,减卵率分别为５５．７５％、６０．５０％,虫卵肉芽肿的平均周长和平均面积、免疫后血清抗体水平差别均具有非常显著意义;１０８ＣＦＵ与１０６ＣＦＵ组相比,血清抗原水平差别具有显著意义,说明血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗是一种比较理想的新型疫苗,值得进一步深入研究     

血吸虫重组BCG—Sj26GST疫苗接种后保护力的观察

为了探讨血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗免疫鼠后对尾蚴攻击感染的保护性作用，采用１０＾６ＣＦＵ和１０＾６ＣＦＵ重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗皮下接种ＢＡＬＢ／Ｃ鼠，接种后８周用日本血吸虫尾蚴进行攻击感染，感染后６周剖杀小鼠，计算减虫率、减卵率，同时进行虫卵肉芽肿周长和面积测量，以及抗体水平和抗原水平测定，同时设有ＰＢＳ对照组。结果表明重组ＢＣＧＴ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗免疫小鼠后，１０＾６ＣＦＵ、     

日本血吸虫混合DNA疫苗的构建

构建「日本血吸虫混合ＤＮＡ疫苗，为今后多抗原特异ＤＮＡ轩的研究打下基础。在克隆ｐＢｌｕｅｓｅｒｉｐｔ－Ｓｊ２３，ｐＢｌｕｅｓｅｒｉｐｔ Ｓｊ２６，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－３２的基础上，亚克隆构建了真核表达载体ｐＢＫ－２Ｊ２３，ｐＢＫ－Ｓｊ２６，ｐＢＫ－Ｓｊ３２。经过酶切鉴定，ＰＣＲ扩增鉴定及测序后，将此三种不同抗原质粒经不同组合后经肌肉注射免疫小鼠。３周后提取小凤四头肌ＤＮＡ，特异性引物扩增获得目     

血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗对小鼠肝脏虫卵肉芽肿形成过程中TNF-αmRNA表达的影响

目的 检测血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗对小鼠肝虫卵肉芽肿细胞内ＴＮＦ－ｍＲＮＡ表达的影响。方法 用１０～６ＣＦＵ疫苗皮下注射和腹腔注射分别免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠,免疫后８Ｗ用日本血吸虫尾蚴进行攻击感染,感染后６Ｗ剖杀小鼠,分离肝脏,运用原位杂交技术检测ＴＮＦ－α ｍＲＮＡ表达。结果 疫苗免疫,尾蚴攻击后小鼠肝虫卵肉芽肿细胞内ＴＮＦ－α ｍＲＮＡ表达显著加强。结论 血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗能促进宿主Ｔｈ１反应,加强宿主抗血吸虫感染的保护性免疫力。     

血吸虫重组BCG—Sj26GST疫苗对小鼠肝脏虫卵肉芽肿形成？…

目的 检测血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗对小鼠肝虫卵肉芽肿细胞内ＴＮＦ－ｍＲＮＡ表达的影响。方法 用１０＾６ＣＦＵ疫苗皮下注射和腹腔注射分别免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠,免疫后８Ｗ用日本血吸虫尾蚴进行攻击感染,感染后６Ｗ剖杀小鼠,分离肝脏,运用原位杂交技术检测ＴＮＦ－αｍＲＮＡ表达。结果 疫苗免疫,尾蚴攻击后小鼠肝虫卵肉芽肿细胞内ＴＮＦ－αｍＲＮＡ表达显著加强。结论 血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫     

佐剂对日本血吸虫31／32kd蛋白保护性免疫力的影响

本实验用纯化的日本血吸虫３１／３２ｋｄ蛋白（Ｓｊ３１／３２）辅以ｐｏｌｙａｌｐｈａｏｉｅｆｉｎ（ＰＡＯ）佐剂免疫小鼠，同时比较了Ｓｊ３１／３２辅以福氏完全佐剂（ＦＣＡ）对小鼠保护性免疫力的影响。Ｓｊ３１／３２＋ＰＡＯ组小鼠减虫率为４３．１７％，肝减卵率为６７．０２％，Ｓｊ３１／３２＋ＦＣＡ组小鼠减虫率为２８．７４％，肝减卵率为６４．２４％，Ｓｊ３１／３２组小鼠减虫率为２６．９９％，肝减卵率为５１．     

Sj Dad1反义核酸抗日本血吸虫感染的实验研究

目的 进一步鉴定已获得的日本血吸虫新基因 Ｓｊ Ｄａｄ１的功能。方法 构建Ｓｊ Ｄａｄ１反义（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）核酸载体ＰＥＧＦＰ－Ｎ３－Ｓｊ Ｄａｄ１和正义（ｓｅｎｓｅ）核酸载体 ｐＥＧＦＰ－Ｎ３－Ｓｊ Ｄｅｄ１．ＢＡＬＢ／ｃ小鼠感染日本血吸虫尾蚴后第 ３天,通过小鼠尾静脉分别注射ＰＥＧＦＰ－Ｎ３－Ｓｊ Ｄａｄ１（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）、ｐＥＧＦＰ－Ｎ３－Ｓｊ Ｄａｄｌ（ｓｅｎｓｅ）、空载体和生理盐水。４５ｄ后解剖实验小鼠进行保护性效果评价。结果 在ＰＥＧＦＰ－Ｎ３－Ｓｊ　Ｄａｄ１（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）组、ｐＥＧＦＰ－Ｎ３－Ｓｊ　Ｄａｄｌ（ｓｅｎｓｅ）组以及ｐＥＧＦＰ－Ｎ３组小鼠肺部冰冻切片检查发现在童虫周围有绿色荧光出现,而在生理盐水组则无此现象。但各实验组保护性效果无统计学差异（Ｐ＞ ０．０５）。结论Ｓｊ Ｄａｄ１反义核酸无明显的抗日本血吸虫感染的效果,尚需寻找其它方法对 Ｓｊ Ｄａｄ１的疫苗候选基因价值作进一步的鉴定。     

IL—12对日本血吸虫重组SjGST—Sj32免疫小鼠攻击感染后虫 …

目的 观察白细胞介素－１２（ＩＬ－１２）对重组日本血吸虫谷胱苷肽－Ｓ－转移酶－３２ｋＤ融合蛋白（ｒＳｊＧＳＴ－Ｓｊ３２）蛋白免疫小鼠肝脏虫卵肉芽肿大小的影响。方法 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠３６只随机分别ＩＬ－１２加ｒＳｊＧＳＴ－Ｓｊ３２组、ｒＳｊＧＳＴ－Ｓｊ３２组和磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）组，第３次免疫后４周，经腹部贴片感染１０条尾蚴，４５天后杀鼠取肝组织，常规染色，光镜下进行组织学观察及单个虫卵肉芽肿大小     

日本血吸虫32ku抗原基因的克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

日本血吸虫３２ ｋｕ抗原（简称ｓｊ３２ｋｕ）是血吸虫的一种保护性抗原,为研究其重组疫苗的保护作用,将该抗原基因的全编码序列按正确的阅读框顺序插入到穿梭质粒 ｐＢＣＧ２１００,受控于人结核杆菌热休克蛋白 ７０（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏ－ｔｅｉｎ ７０,简称ｈｓｐ７０）启动子,构建成重组表达质粒 ｐＢＣＧ－ｓｊ３２,在大肠杆菌－分枝杆菌两个系统中能稳定复制。重组分枝杆菌于 ４２℃诱导 ２ ｈ或 ４５℃诱导 ３０ ｍｉｎ,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,在 ３２ ｋｕ的位置能见到明显的蛋白条带,表明 ３２ ｋｕ抗原能在分枝杆菌中高效表达。     

日本血吸虫中国大陆株基因重组抗Sj22.6kDa的免疫学活性鉴定

目的：对重组Ｓｊ２２．６ｋＤａ抗原（ｒＳｊ２２．６）进行免疫学活性鉴定,了解其作为疫苗候选抗原的潜力。方法：Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ反应确定ｒＳｊ２２．６的抗原性;将ｒＳｊ２２．６注射家兔,制备特异抗血清;以血吸虫尾蚴对Ｃ５７小鼠进行攻击感染,初步鉴定其免疫保护力。结果：ｒＳｊ２２．６可与特异性抗体发生反应,并刺激家兔产生特异性抗体应答,抗体滴度为１∶１２８０。攻击感染中,免疫组小鼠的减虫率达７７．２％。结论：ｒＳｊ２２．６具有良好的免疫学活性,在诱导抗日本血吸虫感染方面具有一定的潜力     

日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗对小鼠免疫应答的影响

采用日本血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。免疫８周时,断头取血,取脾脏,取腹腔巨噬细胞。以淋巴细胞刺激指数（ＳＩ）反映细胞增殖能力,以ＮＯ释放量检测巨噬细胞吞噬活性,以ＥＬＩＳＡ试剂盒检测血清及脾淋巴细胞培养上清的白细胞介素２（ＩＬ－２）和干扰素－γ（ＩＦＮ－γ）的含量。结果表明,ｒＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗以 １０~６ＣＦＵ剂量经皮下免疫小鼠后,小鼠脾淋巴细胞增殖能力明显高于对照组、载体组和ＢＣＧ组（均为Ｐ＜０．０５）;小鼠腹腔巨噬细胞ＮＯ的含量明显高于对照组和载体组（均为Ｐ＜０．０１）;小鼠血清ＩＬ－２的含量明显高于对照组（Ｐ＜０．０１）和载体组（Ｐ＜０．０５）;而小鼠脾淋巴细胞培养上清ＩＬ－２的含量分别高于对照组４４％、载体组４８％和ＢＣＢ组４２％;小鼠血清ＩＦＮ－γ的含量分别高于对照组２０％、载体组１９％和ＢＣＧ组１３％,均有升高趋势、结果提示,ｒＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗能明显增强小鼠的免疫应答反应,其抗感染作用一方面与ＢＣＧ本身的佐剂特性有关,另一方面与机体产生抗Ｓｊ２６－ＧＳＴ特异性抗体有关。     

原发性肝癌中 HBV X、S、Pre-S、C 基因片段整合与 ras、myc 癌基因表达的关系

用地高辛标记的ＨＢＶ基因组探针检测了６６例肝细胞性肝癌（ＨＣＣ）中ＨＢＶ的存在状态，从中筛选出３２例仅有ＨＢＶＤＮＡ整合的ＨＣＣ作为研究对象，进一步检测了ＨＢＶＸ基因、Ｓ基因、Ｐｒｅ－Ｓ、Ｃ基因ＤＮＡ片段的整合情况，并探讨了ＨＢＶ４种基因亚片段整合与ｒａｓ、ｍｙｃ癌基因表达的关系。结果显示，ＨＢＶＸ、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ和Ｃ基因片段的整合率分别为８７．５％（２８／３２）、６２．５％（２０／３２）、６２．５％（２０／３２）和２５．０％（８／３２）。ｐ２１ｒａｓ、ｐ６２ｍｙｃ在ＨＣＣ中的表达率分别为５０．０％（２０／４０）、８１．２％（２６／３２）。通过对ＨＣＣ中４种ＨＢＶ基因片段整合与ｐ２１ｒａｓ、ｐ６２ｍｙｃ表达之间关系的研究，显示ｐ６２ｍｙｃ的表达与ＨＢＶＸ、Ｐｒｅ－Ｓ基因整合关系密切，ｐ２１ｒａｓ的表达则主要与ＨＢＶＸ基因整合有关（Ｐ＜０．０５）。提示ＨＢＶＸ、Ｐｒｅ－ＳＤＮＡ片段在宿主细胞染色体上的整合可能直接或通过其蛋白启动ｍｙｃ和（或）ｒａｓ癌基因的表达。     

日本血吸虫重组BCG—Sj26GST疫苗对小鼠免疫应答的影响

采用日本血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。免疫８周时,断头取血,取脾脏,取腹腔巨噬细胞。以淋巴细胞刺激指数（ＳＩ）反映细胞增殖能力,以ＮＯ湫得检测巨噬细胞吞噬活性,以ＥＬＩＳＡ试剂盒检测血清及脾淋巴细胞培养上清的白细胞介素２（ＩＬ－２＿和干扰素γ（ＩＦＮ－γ）的含量。结果表明,ｒＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗以１０＾－６ＣＦＵ剂量经皮下免疫小鼠后,小鼠脾淋巴细胞增殖能力明显高于     

血吸虫重组卡介苗—Sj20GTST疫苗的构建及免疫原性的研究

目的 构建含日本血吸虫相对分子质量为２６０００的抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）基因的 且卡介菌（ＲＢＣＧ）疫苗,观察其对ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的免疫保护作用。方法 采用分子生物学技术,将Ｓｊ２６ＧＳＴ ｃＤＮＡ克隆到人结核杆菌热休克蛋蛋白（ＳＨＰ）７０启动子下游,构成融合基因,再将事基因亚克隆到Ｅ,ｃｏｎｌｉＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ（ｒＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ）疫苗,经热诱导,在ＢＣＧ中Ｓｊ２６ＧＳＴ抗原。用ｒＢＣ     

重组日本血吸虫SjGT—Sj32蛋白诱导小鼠保护免疫的研究

应用基因工程技术分别表达出ＳｊＧＳＴ－Ｓｊ３２,Ｓｊ３２和ＳｊＧＳＴ,用于保护性免疫的动物实验及其体液免疫机制的初步探讨。结果：与对照组相比,重组ＳｊＧＳＴ－Ｓｊ３２组,Ｓｊ３２组,Ｓｊ３２＋ＳｊＧＳＴ组均有明显的减虫效果。上述三组及ＳｊＧＳＴ组的肝脏虫卵计数的均较对照组为少。提示重组Ｓｊ３２ｋＤ蛋白可诱导小鼠产生明显的抗日本血吸虫攻击感染的保护性免疫及抗生殖免疫效果,而ＳｊＧＳＴ仅表现出一定的抗     

钩端螺旋体DNA疫苗pcD-flaB的构建及其免疫机制的初步研究

观察钩端螺旋本ＤＮＡ疫苗的保护效果,并探讨疫苗的免疫机制。方法：应用定向克隆的方法构建ＤＮＡ疫苗ｐｃＤ－ｆｌａＢ,肌肉途径免疫豚鼠,观察豚鼠攻击感染钩体后保护率,以ＥＬＩＳＡ法检测特异性抗体ＩｇＧ工观察疫苗对豚鼠腹腔巨噬细胞分泌的ＴＮＦ活性的影响。结果该疫苗对同型钩体的保护率为１００％,特异性抗体水平在疫苗注射第６周达到高峰,ＴＮＦ的活性明显增高。结论：ＤＮＡ疫苗ｐｃＤ－ｆｌａＢ对同型钩体感染有较     

重组日本血吸虫SjGST-Sj32蛋白诱导小鼠保护性免疫的研究

应用基因工程技术分别表达出ＳｊＧＳＴＳｊ３２,Ｓｊ３２和ＳｊＧＳＴ,用于保护性免疫的动物实验及其体液免疫机制的初步探讨。结果：与对照组相比,重组ＳｊＧＳＴＳｊ３２组,Ｓｊ３２组,Ｓｊ３２＋ＳｊＧＳＴ组均有明显的减虫效果（Ｐ＜０．０５）。上述三组及ＳｊＧＳＴ组的肝脏虫卵计数均较对照组为少（Ｐ＜０．０１）。提示重组Ｓｊ３２ｋＤ蛋白可诱导小鼠产生明显的抗日本血吸虫攻击感染的保护性免疫及抗生殖免疫效果,而ＳｊＧＳＴ仅表现出一定的抗生殖免疫效果。     

原发性肝细胞癌p53基因突变检测

为了解在黄曲霉毒素Ｂ１（ＡＦＢ１）低含量区以ＨＢＶ为主要危险因素的ＨＣＣｐ５３基因突变情况，并分析它与ＨＢＶ及其它因素的关系，作者筛检了成都地区３２例原发性肝癌（ＨＣＣ），分别应用ＰＣＲ－ＲＦＬＰＳｏｕｔｈｅｒｎ吸印杂交及免疫组化染色法检测了３２例ＨＣＣ及２７份癌旁肝组织中ｐ５３基因突变、ＨＢＶＤＮＡ整合及ＨＢｓＡｇ表达。结果：所有ＨＣＣ病例均感染过ＨＢＶ，肝癌细胞中ＨＢＶＤＮＡ整合率７１．９％，癌旁组织均有肝硬化或／和慢活肝病变，且ＨＢｓＡｇ表达率９６．３％。３２例ＨＣＣ中检出８例Ｐ５３蛋白阳性（２５％），这种改变与ＨＢＶＤＮＡ整合及ＨＢｓＡｇ表达无明显关系，而与ＨＣＣ发生年龄有关；３２例ＨＣＣ组织中有２例ｐ５３基因第２４９号编码子突变（６．２５％），明显低于ＡＦＢ１高含量区ＨＣＣ，而与台湾、日本等ＡＦＢ１低含量区报道一致，提示：成都地区ＨＣＣ与ＨＢＶ感染确有密切关系；ｐ５３改变在ＨＣＣ发生上有一定作用，但是多数ＨＣＣ并无ｐ５３基因突变又提示ＨＣＣ发生尚涉及其它复杂机制；ＨＢＶ在ＨＣＣｐ５３基因改变中的作用机制值得进一步探索。     

日本血吸虫铁蛋白基因的筛选、克隆与表达

采用Ｓｊ未成熟虫卵抗原超免疫兔血清（ＲＡＳｊＩＥＡ）对Ｓｊ成虫ｃＤＮＡ文库进行筛选，并对可能具有抗日本血吸虫生殖／卵胚发育潜能的抗原分子进行克隆、表达。常规法免疫筛选Ｓｊ成虫文库，获得单个阳性克隆，ＰＣＲ扩增后琼脂糖电泳测定基因大小，ＤＮＡ测序，基因库搜索，找出同源基因。共鉴定出６个不同的基因克隆。选择其中的铁蛋白（ＳｊＦｅｒ）基因亚克隆于ｐＧＭＣ载体。重组蛋白以ＧＭＣＳＦ（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）－ＳｊＦｅｒ融合蛋白的形式在细菌中高效表达。表达产物仅溶于８Ｍ尿素溶液中，分子量为４０ｋＤ。