小鼠Ehrlich实体瘤局部DNA直接转染TGF-β1基因的研究

研究Ｅｈｒｌｉｃｈ 实体瘤局部ＤＮＡ 直接转染ＴＧＦ－β１ 基因的治疗效果。将真核表达载体ｐＳＶＴＧＦ－ β１ 直接瘤周转染Ｅｈｒｌｉｃｈ 实体瘤, 用原位杂交方法检测靶基因的表达, ＭＴＴ法检测脾脏细胞免疫功能, 并观察小鼠生存期及肿瘤生长速度。治疗组肿瘤细胞及瘤周组织有靶基因ｍ ＲＮＡ表达, 脾脏细胞免疫功能高于对照组, 肿瘤生长受到抑制, 治疗组小鼠生存期较对照组明显延长。ＴＧＦ－β１ 基因ＤＮＡ直接转染法可以明显抑制肿瘤生长,不影响全身细胞免疫功能,具有较大的潜在临床应用价值。     

阳离子脂质体介导细胞因子基因对小鼠肝癌抑制的作用

目的观察阳离子脂质体介导细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２基因对小鼠肝癌的抑制作用。方法构建含细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２的质粒载体,用阳离子脂质体ＬｉｐｏｆeｃｔＡＭＩＮＥ或ＤＯＳＰＥＲ介导的含细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２的质粒ＤＮＡ分别体外转染小鼠肝癌细胞株ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,并在荷瘤小鼠体内分别直接注射上述阳离子脂质体－ＤＮＡ复合物,观察瘤体大小及小鼠生存期。结果两种阳离子脂质体介导的细胞因子转染后都具有生物学活性,转染效率为１０％左右,瘤内注射后均能延长荷瘤小鼠的生存期。ＤＯＳＰＥＲ介导细胞因子的治疗效果较佳。结论ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ或ＤＯＳＰＥＲ介导细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２基因均具有抑制小鼠肝癌生长、延长荷瘤小鼠生存期的作用,ＤＯＳＰＥＲ的效果较好。     

hEGF cDNA导入培养的人角朊细胞及其表达

目的 观察外源性人表皮细胞生长因子（ｈＥＧＦ）基因导入正常导入正常角朊细胞后,能否表达及分泌ｈＥＧＦ;为深入探讨ｈＥＧＦ的作用机制及临床应用奠定物质基础。方法 脂质体包埋ｈＥＧＦ－ｃＤＮＡ的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈＥＧＦ转染人角朊细胞,经Ｇ４１８筛选,克隆,扩大及传代培养转基因的角朊细胞,特异性ｎｃｏ探针原位杂交显示转基因细胞内的质粒载体,ｈＥＧＦ抗体免疫细胞化学法观察转基因细胞内ｈＥＧＦ的表     

绿色荧光蛋白GFP在转化细胞和肿瘤细胞中的表达

目的：在肿瘤基因治疗研究中建立一个用绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ,ＧＦＰ）为标记基因的合适条件。方法用带有ＧＦＰ突变体的质粒转染到表达细胞,观察ＧＦＰ瞬时表达的情况：１．直接测定ＧＦＰ在ＣＯＳ－７细胞中的表达并观察表达的稳定性;２比较不同启动子驱动的ｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ和ｐＳＶＫ３－Ｓ６５Ｔ两种质粒在不同肿瘤细胞中的转染效率;３用ＬａｃＺ基因与ＧＦＰ基因共转染     

阻断TGF α-EGFR自泌环对胰腺癌细胞体外生长的影响

目的研究阻断ＴＧＦα－ＥＧＦＲ自泌环对胰腺癌细胞生长的影响。方法构建了反义ＥＧＦＲ的表达载体ｐＣＭＶ－ＡＳ－ＥＧＦＲ,转染已经反义ＴＧＦα转化的胰腺癌ＰＣ－７细胞,经Ｇ４１８筛选,获得稳定的双重转化细胞系ＰＣ－７／ＡＳ－ＴＧＦα／ＡＳ－ＥＧＦＲ。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ、１２５Ｉ－ＥＧＦ结合试验分析双重转染细胞系基因的整合及表达。ＤＮＡ凝胶电泳、流式细胞术、原位凋亡检测细胞凋亡。结果双重转染细胞系有外源ＴＧＦα基因的整合及表达,内源性ＥＧＦＲ及ｃｙｃｌｉｎＤ１ｍＲＮＡ表达下调、细胞表面ＥＧＦＲ受体表达下降,与反义ＴＧＦα单独作用比较,反义ＥＧＦＲ与反义ＴＧＦα的联合作用更强。３Ｈ－ＴｄＲ掺入率由２５％降至１４．５％。生长抑制率由７８．８％提高到８６．０％、软琼脂集落形成能力完全丧失。双重抑制后,细胞更容易发生凋亡。结论对胰腺癌中异常信号传导途径的阻断,能明显地抑制肿瘤恶性生物学行为,使肿瘤细胞恶性表型部分逆转。     

抑癌基因MTS1真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系HO-8910中的表达

目的：构建多肿瘤抑制基因１（ＭＴＳ１）的真核表达载体,将其转入人源性卵巢癌细胞株ＨＯ－８９１０中,并得到稳定表达,为进一步研究其对卵巢癌细胞的影响奠定实验基础．方法：利用ＢａｍＨⅠ与ＥｃｏＲⅠ从ｐＵＣ１９－ｐ１６质粒上切下ＭＴＳ１ｃＤＮＡ片段并克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,构建成ＭＴＳ１真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６;利用脂质体（Ｆｕ－ＧＥＮＥＴＭ６）介导的基因导入法将ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６导入人源性卵巢癌细胞株ＨＯ－８９１０中;采用ＡＢＣ法对转染后的不同代数细胞进行免疫细胞化学检测,观察ｐ１６蛋白的表达．结果：成功构建了ＭＴＳ１真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６,并进行酶切鉴定;转染后经Ｇ４１８筛选２ｗｋ出现阳性克隆８９１０－ｐ１６,并检测到其中有ｐ１６蛋白的稳定表达．结论：成功构建ＭＴＳ１真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６,并可在人源性卵巢癌细胞株ＨＯ－８９１０中得到稳定表达．     

TGF β1基因直接瘤内注射后的表达及其对小鼠肿瘤的影响

用肺腺癌细胞株ＬＭ３小鼠背部皮下接收成瘤。于瘤体内多次多点直接注射ｐＭＡＭｎｅｏ－ＴＧＦβ１质粒ＤＮＡ，并设空质粒和盐水注射对照组进行比较。发现ＴＧＦβ１基因直接注射组肿瘤生长速度增快，肿瘤组织内结缔组织间质明显增多，但转移发生频率的差异无显著性意义。取新鲜的肿瘤组织提取ＲＮＡ，分子杂交证实，直接注入肿瘤组织的ＴＧＦβ１基因获得了高效表达。结果提示，ＤＮＡ直接注射法作为ｉｎ ｖｉｖｏ基因转移手段有     

戊型肝炎病毒（HEV）基因疫苗免疫小鼠的初步研究

本研究将含ＨＥＶ ＯＲＦ３ ｃＤＮＡ的真核表达质粒作为基因疫苗直接注射到ＢＡＬＢ／ｃ小鼠骨骼肌内，引发了实验小鼠特异性抗－ＨＥＶ ＩｇＧ反应。小鼠经２次基因疫苗接种或１次基因疫苗，然后用ＨＥＶ重组蛋白加强免疫后，血清抗－ＨＥＶ ＩｇＧ滴度较接种１次基因疫苗组明显升高。     

戊型肝炎病毒（HEV）基因疫苗免疫小鼠的初步研究

本研究将含ＨＥＶＯＲＦ３ｃＤＮＡ的真核表达质粒作为基因疫苗直接注射到ＢＡＬＢ／ｃ小鼠骨胳肌内，引发了实验小鼠特异性抗－ＨＥＶＩｇＧ反应。小鼠经２次基因疫苗接种或１次基因疫苗，然后用ＨＥＶ重组蛋白加强免疫后，血清抗－ＨＥＶＩｇＧ滴度较接种１次基因疫苗组明显升高。     

阳离子脂质体介导血管内皮生长因子的基因表达

以ＲＴ－ＰＣＲ自人胎肝中克隆和筛选血管内皮生长因子全长ｃＤＮＡ，测序鉴定正确后，插入真核表达载体ｐＡｄＣＭＶｌｉｎｋ１中的ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎＩ位点。用ｌｉｐｏｆｅｃｔ ＡＭＩＮＥ体外介导转染ＣＨＯ细胞，收集转染后２４ｈ至第５ｄ的培养上清，用ＲＴ－ＰＣＲ检测转染细胞中外源ＶＥＧＦ１６５基因的转当，Ｍｉｌｅｓ试验检测细胞培养上清中ＶＥＧＦ的生物活性。     

小鼠红细胞分化相关因子cDNA片段的克隆与分析

目的克隆与小鼠红细胞终末分化相关因子的基因,并对其表达特性进行分析。方法用致贫血Ｆｒｉｅｎｄ病毒（ＦＶＡ）诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾脏产生大量ＦＶＡ原红细胞,后者经分离纯化并在促红细胞生成素作用下进行体外培养。采用减除杂交与ＰＣＲ相结合的方法,用未经培养的ＦＶＡ诱导的原红细胞（０ｈＦＶＡ原红细胞）的ｃＤＮＡ对培养３６ｈ的ＦＶＡ诱导的成红细胞（３６ｈＦＶＡ成红细胞）的ｃＤＮＡ进行多次减除杂交和ＰＣＲ扩增,构建上述３６ｈｃＤＮＡ的质粒减除文库并进行差异筛选。对阳性克隆进行核苷酸序列测定及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析。结果获得１个４７２ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,其中含有１个３０９ｂｐ的开放阅读框架,编码１０２个氨基酸。经ＧｅｎＢａｎｋ进行同源比较,未发现同源序列,已被ＧｅｎＢａｎｋ接受,（编号ＡＡ１１４３６９）。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析表明,该ｃＤＮＡ在培养３６ｈ的ＦＶＡ中、晚幼红细胞中呈差异表达,其ｍＲＮＡ全长约为５００～６００ｂｐ左右。将其暂命名为小鼠红细胞分化相关因子（ＭＥＤＲＦ）基因。结论ＭＥＤＲＦ基因在红细胞分化的中、晚幼阶段特异表达,表明ＭＥＤＲＦ是一个新的与红细胞终末分化相关的因子。     

KAL抗肿瘤的作用及对三种状态下小鼠迟发性过敏反应的影响

报道ＫＡＬ对小鼠实体瘤的抑瘤作用及对腹水型瘤的生存期的作用，结果示ＫＡＬ对Ｓ－１８０实体瘤生长有比较明显抑制作用，ＫＡＬ０，５，１，２ｇ／ｋｇ，ｉｇｘ９天抑瘤率在４１％～６０％之间，ＫＡＬ同前给药对荷Ｓ－１８０腹水型癌小鼠生存期延长率在３９％～４９％间，对荷Ｅｈｒｌｉｃｈ腹水型癌（ＥＡＣ）小鼠生存期延长率在３１％～４９％之间，本文还报道ＫＡＬ对正常小鼠，荷瘤小鼠及环境酰胺造成迟发性过敏反应（ＤＴＨ     

血管内皮细胞生长因子在哺乳动物细胞的表达

目的：本实验试图构建具有生物学活性的ＶＥＧＦ真核表达载体,为ＶＥＧＦ基因治疗提供载体。方法：将已获得的ｈＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ克隆到ＧＳＴ融合表达载体,构建原核表达质粒,转染大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定表达产物。在此基础上构建真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ ／ｈＶＥＧＦ１６５,脂质体介导转染ＣＨＯ－Ｋ１细胞,Ｇ－４１８筛选,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ,Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ ｂｌｏｔ分别检测其在细胞内的转录和表达情况,３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测表达蛋白的活性。结果：实验组的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ出现特异性条带,而对照组在相应部位未出现条带。实验组的大鼠心肌血管内皮细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入率明显高于对照组（Ｐ＜ ０．００１）。结论：本实验所构建的ＶＥＧＦ真核表达质粒能够在真核细胞内获得表达,其表达产物具有血管内皮细胞增殖刺激活性。     

阻断TGF α—EGFR自泌环对胰腺癌细胞体外生长的影响

目的 研究阻断ＴＧＦα－ＥＧＦＲ自泌环对胰腺癌细胞生长的影响。方法 构建了反义ＥＧＦＲ 表达载体ｐＣＭＶ－ＡＳ－ＥＧＦＲ。转染反应反义ＴＧＦα转化的胰腺癌ＰＣ－７细胞,经Ｇ４１８筛选,获得稳定的双重转化细胞系ＰＣ－７／ＡＳ－ＴＧＦα／ＡＳ－ＥＧＦＲ。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ,Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ,＾１２５Ｉ－ＥＧＦ结合试验分析双重转染细胞系基因的整合及表达。ＤＮＡ凝胶电泳,流式细胞术,。原位     

rhG-CSF cDNA高表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５＇ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组入表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ｐＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５２ｎｇ／ｍｌ，７２ｈ为２３０ｎｇ／ｍｌ，显示ｒｈＧ－ＣＳＦ获得了暂时性高表达。结论：ｐＥＤ－ＧＣＳＦ是一个能在哺乳动物细胞中高效表达ｒｈＧ－ＣＳＦ的真核表达质粒。     

rhG—CSF cDNA表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组人表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ＰＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５     

含hBDNF cDNA和HTH_1 cDNA两个转录单位表达质粒的构建及在CHO细胞的表达

在ＣＨＯ细胞同时表达ｈＢＤＮＦ和ＨＴＨ１ｃＤＮＡ两个外源基因。方法构建同时含ｈＢＤＮＦｃＤＮＡ和ＨＴＨ１ｃＤＮＡ两个转录单位的表达质粒并转染ＣＨＯ细胞,筛选出同时表达ｈＢＤＮＦ和ＨＴＨ１的克隆命名为ＣＨＯｈＢＤＮＦＨＴＨ１细胞;用双重免疫组化、ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ及活性测定等方法检测外源ＨＴＨ１、ｈＢＤＮＦ基因在ＣＨＯｈＢＤＮＦＨＴＨ１细胞的表达。结果ｈＢＤＮＦ、ＨＴＨ１同时在ＣＨＯｈＢＤＮＦＨＴＨ１细胞得到表达;ＨＰＬＣ－ＥＣＤ法检测到ＣＨＯ－ｈＢＤＮＦ－ＨＴＨ１细胞培液中Ｌ－ＤＯＰＡ含量为每２４ｈ（２５．３±６．７）ｎｇ／１０６ｃｅｌｓ;ＣＨＯ－ｈＢＤＮＦ－ＨＴＨ１细胞培液可明显促进人胚脊神经根节细胞的存活和生长。结论采用多基因表达技术可以使ｈＢＤＮＦ和ＨＴＨ１ｃＤＮＡ两个外源基因同时在一个细胞中得到表达,而且表达的ｈＢＤＮＦ、ＨＴＨ１具有生物学活性     

大鼠肾脏系膜细胞转染人TGF—β1基因可增强MMP—2表达

目的 研究转化生长因子－β１（ＴＧＦ－β１）对培养的大鼠肾小球系膜细胞（ＭｓＣ）基质金属蛋白酶－２（ＭＭＰ－２）表达的影响。方法 采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将人ＴＧＦ－β１基因转染培养的大鼠ＭｓＣ,经Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ鉴定其转染成功否;又分别应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ,酶谱分析法检测阳性表达人ＴＧＦ－β１的ＭｓＣＭＭＰ－２ｍＲＮＡ蛋白及酶活性变化。结果成功获得稳定过     

含hBDNFcDNA和HTH1cDNA两个转录单位表达质粒的构建及在C …

在ＣＨＯ细胞同时表达ｂＢＤＮＦ和ＨＴＨ１ｃＤＮＡ两个外源因基因。方法 构建同时含ｈＢＤＮＦｃＤＮＡ和ＨＴＨ１ＣＤＮＡ两个转录单位的表达质粒并转染ＣＨＯ细胞,筛选出同时表达ｈＢＤＮＦ和ＨＴＨ１的克隆命名为ＣＨＯｈＢＤＮＦ－ＨＴＨ１细胞;用双重免疫组化、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ及活性测定等方法检测外源ＨＴＨ１、ｈＢＤＮＦ基因在ＣＨＯ－ｈＢＤＮＦ－ＨＴＨ１细胞的表达。结果 ｈＢＤＮＦ、ＨＴＨ１同     

人转化生长因子基因重组克隆及高效表达

目的　克隆人转化生长因子（ＴＧＦβ１） 基因并且在大肠杆菌中表达。方法　从人的血小板中抽提总ＲＮＡ,经逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ） 得到全长ＴＧＦβ１ ｃＤＮＡ,将其克隆于表达质粒ｐＢＬＭＶＬ２ 中,构建了在ＰＬ 启动子控制的含有ＴＧＦβ１ｃＤＮＡ重组子,转化到大肠杆菌ＲＲ１ 菌株中,进行温敏诱导表达。结果　表达产物经ＳＤＳＰＡＧＥ电泳染色后,显示其相对分子质量为１２ ．５ ×１０３ ,计算机灰度扫描分析,表达产物约占全菌蛋白的２０％ 左右,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 分析证实,表达产物为ＴＧＦβ１ ,细胞实验显示其具有一定的生物活性。结论　在大肠杆菌中表达出具有活性的人ＴＧＦβ１ 。这为我们下一步研究其功能和临床应用打下了基础。