PTEN-FAK信号传导通路在白血病细胞迁移、侵袭中的作用

目的 探讨肿瘤抑制基因10号染色体缺失的磷酸酶基因(PTEN)对人慢性粒细胞白血病细胞系K562增殖和凋亡的影响以及PTEN-FAK信号传导通路在白血病细胞迁移、侵袭中的作用.方法 将携带有野生型PTEN及绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-PTEN-GFP)及空载体腺病毒(Ad-GFP)转染K562细胞和慢性粒细胞白血病急变期患者白血病细胞,用MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡率,荧光定量PCR(FQ-PCR)检测PTEN mRNA、FAK mRNA水平变化,Western blot方法 检测蛋白水平变化,Transwell小室检测K562细胞及原代白血病细胞迁移及侵袭能力.结果 Ad-PTEN-GFP以感染复数为200转染K562细胞后,与Ad-GFP组相比,最大生长抑制率为35.2%;Transwell小室结果 显示,转染Ad-GFP组漏人下室内荧光细胞数量为转染Ad-PTEN-GFP组漏入下室细胞数量的9.1倍;转染PTEN基因后原代细胞侵袭迁移能力亦减弱.转染PTEN基因后K562细胞FAK、p-FAK蛋白表达下调为Ad-GFP组的0.72与0.16倍.结论 PTEN可能通过下调FAK及p-FAK表达抑制白血病细胞增殖、迁移及侵袭能力.     

甲异靛对K562细胞bcr-abl信号通路的影响以及诱导细胞凋亡机制研究

目的 探讨甲异靛对K562细胞bcr-abl信号通路的影响以及甲异靛诱导K562细胞凋亡的机制.方法 应用流式细胞术检测甲异靛诱导K562细胞凋亡的情况以及线粒体膜电位稳定性.应用Western blot技术检测bcr-abl信号通路相关蛋白、caspase以及Bcl-2家族成员在甲异靛作用前后的表达情况.RT-PCR技术检测甲异靛作用前后bcr-abl mRNA表达水平,用电泳移动迁移速度分析检测STAT3、STATS的DNA结合能力.结果 20 μmol/L甲异靛町降低ber-abl融合蛋白的表达及其磷酸化水平,但并不改变其mRNA表达水平,甲异靛可降低STATS以及CRKL的磷酸化水平,抑制STAT3、STATS的DNA结合能力.5-20μmoL/L甲异靛可诱导K562细胞凋亡并且具有浓度依赖性.甲异靛诱导K562细胞凋亡中伴随caspase 3、8、9活化以及细胞线粒体膜电位降低,caspase 3、8、9特异抑制剂z-DEVD-fmk、z-IETD-cho和z-LETD-fmk可阻断甲异靛诱导的K562细胞凋亡.甲异靛诱导K562细胞凋亡前后不伴有Bcl-2、Bax、Bid蛋白表达水平的改变.结论 甲异靛通过降低bcr-abl融合蛋白的表达并抑制bcr-abl信号通路中相关蛋白活性从而抑制K562细胞的增殖.甲异靛诱导K562细胞凋亡依赖于caspase活化以及线粒体途径,但Bcl-2家族成员不参与凋亡的调控.     

荧光定量PCR法检测肿瘤细胞株转录因子表达水平

目的 建立荧光定量聚合酶链反应(fluorogenic quantitative PCR)检测方法，以便快速、准确地定量检测细胞株转录因子表达强度。方法 根据基因序列，设计合成引物．采用一步法提取细胞株总RNA，逆转录获取cDNA，通过荧光定量的方法对各细胞株的转录因子T—box expression in Tceils(T—bet)，GATA3的表达水平进行检测。结果 细胞株NK92、QBC939、K562、HO-8910、A549、HeLa转录因子T—bet的表达强度分别为0．90、1．25、0．96、0．92、1．1l和1．17，GATA3的表达强度分别为1．23、1．49、1．30、0．97、1．05和1．34。结论 建立丁肿瘤细胞株转录因子基因表达的荧光定量PCR检测方法，较常规PCR方法更为简便、快速、准确，有很好的应用前景。     

中医药对血管新生相关信号通路的影响

血管新生是机体常见的重要生理、病理过程,其过程涉及多种细胞、细胞因子及相关信号通路,多种疾病的发生发展均血管新生密切相关。细胞因子通过信号转导通路调节血管新生相关细胞的迁移、增殖、凋亡影响血管新生。近年来对血管新生机制的最新研究表明,VEGF通路、Notch通路、PTEN/PI3K/AKT通路、JAK/STAT通路参与调节血管新生。中医药可通过调节信号转导通路调节血管新生,在治疗以血管新生为主要病变基础的疾病上取得了一定成绩。     

胃癌组织中MTLC基因表达研究

目的研究MTLC(c-myc target from laryngeal cancer cells)基因在胃癌组织中的表达规律，探讨其在胃癌发生与发展中的作用。方法用反转录-聚合酶链反应法和免疫组织化学法分别检测MTLC mRNA及蛋白在胃癌组织及配对对照组织中的表达情况；用cDNA阵列分析正常胃组织中MTLC基因的表达差异。结果25份胃癌组织中有19份(76％)MTLC mRNA表达下调；免疫组织化学检测结果表明，MTLC蛋白在胃癌细胞中表达阴性，但在正常细胞中表达阳性；cDNA阵列分析显示，癌旁／正常组织、癌／癌旁组织、转移淋巴结／癌组织比值分别为0．527、0．277和0．466，表明正常胃组织中与癌旁组织中无差异，但癌旁组织、胃癌组织、转移淋巴结组织中MTLC mRNA水平依次递减。结论MTLC基因在胃癌组织中表达下调，其表达水平与胃癌的发展进程相关，提示MTLC基因可能在胃癌发生、发展及转移过程中起重要作用。     

氧化砷诱导早幼粒细胞白血病细胞凋亡及其分子机制的初步研究

目的：了解氧化砷（Ａｓ２Ｏ３）治疗急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）的细胞和分子机制。方法：以早幼粒细胞白血病细胞株ＮＢ４细胞等为研究对象，利用流式细胞仪，ＤＮＡ电泳，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ、Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹，免疫组化等手段，观察Ａｓ２Ｏ３对ＡＰＬ的作用。结果：Ａｓ２Ｏ３能显著诱导ＮＢ４细胞凋亡，而不影响ＨＬ－６０和Ｕ９３７的生长和存活。氧化砷能有效降低ＮＢ４细胞中ｂｃｌ－２基因的表达，而对其它几种凋亡相关基因（包括ｐ５３、ｃ－ｍｙｃ、ｂａｘ和ｂｃｌ－ＸＬ）的ｍＲＮＡ水平无影响。结论：这可能是Ａｓ２Ｏ３诱导ＮＢ４细胞凋亡的分子机制之一。     

体外重组内皮抑素及其抑制肿瘤血管生成机制探讨

目的克隆及表达中国昆明种小鼠的内皮抑素（endostatin）基因。方法RT-PCR方法扩增鼠内皮抑素基因，构建温敏型表达载体pBV220-endostatin，在大肠杆菌DH5“中诱导表达出鼠内皮抑素蛋白。结果筛选出pBV220-endostatin阳性克隆菌株，诱导表达外源蛋白内皮抑素，纯化复性后具有一定生物学活性。结论克隆小鼠内皮抑素基因，重组内皮抑素在大肠杆菌中高效表达，复性后具有抑制血管生长活性。     

抗CD_3抗体(HIT3a)基因突变及其表达研究

目的　提高可溶性抗CD3 scFv片段的表达量 ,并测定其生物学活性。方法　用PCR法致抗CD3 scFv基因突变 ;用DNA限制性酶切指纹图谱以及Westernblot法筛选突变克隆 ;用间接免疫荧光法测定抗体的特异性结合活性 ;用12 5I标记抗体 ,进行竞争抑制试验 ;采用51Cr释放试验 ,进行抗CD3scFv片段介导的T淋巴细胞细胞毒性测定。结果　DNA序列测定结果表明 ,抗CD3 scFv抗体突变克隆菌株m2为重链第六位氨基酸突变 ,即E(GAG)→Q(CAG)。突变后的可溶性抗CD3 scFv片段表达量(1μg/ml)比突变前 (0 .0 1μg/ml)高 10 0倍。突变前、后的抗CD3 scFv片段与Jurkat细胞 (CD3 )的结合特异性未改变。m2能竞争性封闭亲代鼠源性抗体HIT3a与CD3 阳性的Jurkat细胞的结合位点。体外杀伤实验结果显示 ,由m2与IL 2共刺激产生的CD3 AK细胞的细胞毒活性比单用IL 2刺激产生的LAK细胞强。结论　通过对抗CD3 scFv抗体基因进行定点突变 ,实现了该抗体片段的高表达 ;m2能与CD3 的Jurkat细胞结合 ;也能激活人外周血中的T淋巴细胞产生CD3 AK细胞毒活性     

Clinical aspects of urea cycle dysfunction and altered brain energy metabolism on modulation of glutamate receptors and transporters in acute and chronic hyperammonemia

In living organisms, nitrogen arise primarily as ammonia (NH₃) and ammonium (NH₄⁺), which is a main component of the nucleic acid pool and proteins. Although nitrogen is essential for growth and maintenance in animals, but when the nitrogenous compounds exceeds the normal range which can quickly lead to toxicity and death. Urea cycle is the common pathway for the disposal of excess nitrogen through urea biosynthesis. Hyperammonemia is a consistent finding in many neurological disorders including congenital urea cycle disorders, reye’s syndrome and acute liver failure leads to deleterious effects. Hyperammonemia and liver failure results in glutamatergic neurotransmission which contributes to the alteration in the function of the glutamate-nitric oxide-cGMP pathway, modulates the important cerebral process. Even though ammonia is essential for normal functioning of the central nervous system (CNS), in particular high concentrations of ammonia exposure to the brain leads to the alterations of glutamate transport by the transporters. Several glutamate transporters have been recognized in the central nervous system and each has a unique physiological property and distribution. The loss of glutamate transporter activity in brain during acute liver failure and hyperammonemia is allied with increased extracellular brain glutamate concentrations which may be conscientious for the cerebral edema and ultimately cell death.     

Intraplatelet signaling mechanisms of the priming effect of matrix metalloproteinase-2 on platelet aggregation

OBJECTIVE: Platelets contain and release some matrix metalloproteinases (MMPs), enzymes involved in the degradation of extracellular matrix, and one of these (MMP-2) exerts a proaggregatory effect. We explored the signal transduction mechanisms activated by MMP-2 in human blood platelets. METHODS AND RESULTS: Recombinant, human MMP-2, added before stimulation with subthreshold doses of different agonists, potentiated platelet activation, calcium influx, IP3 formation, and pleckstrin phosphorylation. Wortmannin and LY29400, two PI3-K inhibitors, suppressed the potentiating effects of MMP-2 and preincubation with MMP-2 enhanced the thrombin-induced association of the p85alpha PI3-K subunit with the cytoskeleton and increased the phosphorylation of PKB. Protein tyrosine kinase inhibitors, MAP kinase inhibitors, PLA2 inhibitors, cyclooxygenase inhibitors and antagonists of the P2Y1 and P2Y12 receptors did not affect the potentiating activity of MMP-2 on platelets. CONCLUSION: Our data show that MMP-2, at a concentration released by activated platelets, facilitates platelet activation acting at the level of a second messenger system common to different agonists and related to the activation of PI3-K. Platelet-released MMP-2 may contribute to platelet activation in vivo.     

电脉冲介导的Tpo基因转移对正常及实验性血小板减少小鼠的促血小板生成作用

目的应用电脉冲介导的重组人血小板生成素(thTpo)基因的体内转移,探讨其对正常及实验性血小板减少小鼠的促血小板生成作用。方法应用基因重组技术,构建真核细胞高表达质粒pcDI/Tpo,将200μgpcDI/Tpo质粒注入正常及实验性血小板减少小鼠的股四头肌内,随后给予100V、1Hz、40ms电刺激6次,用RT-PCR及Westernblot方法观察rhTpo基因在正常小鼠骨骼肌内的表达,ELISA法测定小鼠血浆Tpo水平。用细胞计数板计数小鼠外周血血小板。结果成功构建了真核细胞高表达质粒pcDI/Tpo。将pcDI/Tpo转染小鼠后,在小鼠的骨骼肌内有rhTpomRNA及蛋白的表达,血浆Tpo水平由(250±76)ng/L升高至(1185±264)ng/L。正常小鼠的外周血血小板由(259±27)×10     

乌司他丁对脓毒症大鼠脑组织基因表达的影响

目的 采用基因芯片技术检测乌司他丁(UTI)预处理脓毒症大鼠的脑组织基因表达,并分析推论其可能的作用机制.方法 45只雄性Wistar大鼠按随机数字表法等分为对照组、脓毒症组和UTI组.采用盲肠结扎穿孔术(CLP)复制脓毒症大鼠模型;对照组仅开腹、关腹,不行CLP.UTI组于制模前1 h肌肉注射(肌注)UTI 100 kU/kg;脓毒症组及对照组肌注平衡液5 ml/kg.采用RatRef-12大鼠表达谱基因芯片进行检测,用计算机软件筛选并分析比较脓毒症组和UTI组与对照组大鼠脑组织基因表达的变化,并初步分析脓毒症组和UTI组表达基因之间的差异.结果 在22 523个基因中,与对照组比较,脓毒症组大鼠脑组织差异表达基因共55个,占基因芯片总点数的0.244%;其中表达下调者47个,已知功能基因23个;表达上调者8个,已知功能基因6个.与对照组比较,UTI组大鼠脑组织差异表达基因共82个,占基因芯片总点数的0.364%;其中表达下调者66个,已知功能基因39个;表达上调者16个,已知功能基因8个.与对照组比较,脓毒症组与UTI组有同向表达的基因19个,其中下调18个,包括Adora2a、Avp、Cart、Gng7、Myh7、Oxt、Pde1b、Pdyn;Prkcd、Prkch、Rgs9、Rxrg、Six3、Slc17a6、Slco1a5、Sostdc1、Tac1、Ttr;上调1个,为S100a8.结论 脓毒症时存在脑功能障碍相关的基因表达紊乱UTI预处理可部分纠正脓毒症大鼠过度炎症反应及免疫抑制所致脑组织基因表达异常,从基因水平上对脑组织起到保护作用;同时脓毒症时机体可能存在一定的自我调节作用,一定程度上对脑组织具有保护作用.     

白血病细胞WT1基因启动子区DNA甲基化研究

目的：研究白血病细胞WT1启动子区DNA甲基化与其表达的关系。方法：采用RT-PCR技术、硫化PCR结合限制性内切酶技术检测白血病细胞系及正常人外周血单个核细胞WT1基因的表达及其启动子区DNA甲基化水平。结果：正常人外周血单个核细胞及U937细胞不表达WT1基因，而HL-60、K562和KG1细胞高表达WT1基因，HL-60细胞WT1基因无甲基化。结论：WT1基因启动子区DNA甲基化不能抑制其表达，尚存在其他调节WT1基因表达的因素。     

超声靶向微泡击破介导基因转染或药物传输的研究进展

超声靶向微泡击破(UTMD)是一种新兴的靶向给药及基因转运方法,以超声微泡造影剂作为药物或基因转送的载体,主要作用机制是声孔作用,即胞膜上形成的瞬时孔.超声辐照于靶组织或靶器官,靶部位载基因或载药微泡后靶向释放出基因和药物,提高药物和基因转染率.UTMD为现代的基因治疗提供了一种新的、安全的、非病毒性的转运手段.本文对UTMD技术的作用机制、应用进展及其影响因素进行综述.     

VE—statin／Egfl7基因沉默对恶性胶质瘤细胞U251基因表达谱的影响

目的探讨VE-statin／Egfl7基因在恶性胶质瘤中表达的分子调控机制。方法用小RNA干扰技术沉默VE-statin／Egfl7基因在人恶性胶质瘤U251细胞中的表达,然后用基因表达谱芯片研究VE-statin／Egfl7基因沉默前后该细胞基因表达谱的变化,进行生物信息学分析。并选取两条差异表达基因用实时荧光定量PCR进行验证。结果通过RNA干扰技术明显抑制了VE-statin／Egfl7基因在U251细胞中的表达。基因表达芯片检测结果发现与对照组相比,实验组下调基因有141条,包括未知功能基因7条,已知功能基因134条;上调的基因有130条,包括未知功能基因3条,已知功能基因127条。通过生物信息学分析发现这些基因主要与细胞增殖分化、凋亡及细胞外基质黏附等生物学功能密切相关,涉及的主要信号通路包括表皮生长因子受体ERBB家族信号、细胞存活信号及整合素ave3信号。结论VE-statin／Egtt7在恶性胶质瘤中的分子调控机制可能通过P13K／Akt和Ras／MAPK两条信号转导通路实现,为进一步研究VE-statin／Egfl7的功能和分子机制提供了新的线索。     

基于胃癌基因表达谱的肿瘤分化程度标志基因的鉴定

目的 通过胃癌差异基因表达谱提供的信息鉴定用于识别胃癌分化程度的分子标志物.方法 从本实验室前期所建立的胃癌Oligo基因芯片数据库中选取15份胃癌全基因组表达谱芯片数据,包括9份低分化胃癌和6份高分化胃癌标本数据,采用生物信息学分析方法BAGEL和k-TSP筛选配对的分类器,用于识别肿瘤的分化程度.随后采用ROC曲线对所筛选的特征分子标志物的分类敏感度和特异度进行判断,鉴定具有最强分类能力的分类器.选取北京肿瘤医院30份胃癌组织标本,包括22份低分化胃癌和8份高分化胃癌标本,采用实时荧光定量PCR对所鉴定的分类器进行验证.结果 利用胃癌分化差异基因表达谱数据,采用BAGEL分析方法筛选出了121个表达变化大于2倍的差异表达基因(FC＞2.0,P＜0.001),并在此基础上进一步采用k-TSP分析方法获得了3组用于区分胃癌高低分化程度的胃癌特征基因,包括MYLIP和TMPRSS3,ZNF266和TM4SF1以及SNAI2和CNFN.ROC曲线结果显示,SNAI2和CNFN组合基因对胃癌标本的分化程度进行判断具有最高的分类敏感度(100%)和特异度(100%),其AUC达到1,其他两组分类器则分别为0.981和0.963.实时荧光定量PCR结果显示,在22份低分化胃癌标本中,18份标本(82%)的SNAI2的表达水平高于CNFN;在8份高分化胃癌标本中,6份标本(75%)的SNAI2的表达水平低于CNFN.结论 SNAI2和CNFN在不同分化程度胃癌中具有特定的表达模式,并且两者的表达水平呈现负相关趋势,提示SNAI2和CNFN组合可能作为判断胃癌分化程度的分子标志物.

Abstract：

Objective To identify biomarkers associated with the differentiated phenotype based on gene expression profiling of gastric cancer. Methods Two bioinformatic methods, BAGEL and k-TSP, were used to identify featured genes associated with differentiation in gastric cancer samples based on the Oligo gene chip data, and ROC curves were used to verify the classification sensitivity and specificity of the identified genes. Finally, a total of 30 gastric cancer samples with different differentiation levels were collected for laboratory validation using real-time PCR analyses. Results A total of 121 differentially expressed genes were identified using the BAGEL algorithm, the criterion were FC ＞ 2. 0 and P ＜ 0. 001.Then, the k-TSP algorithm for feature selection based on this differential expression data were used, and 3 groups of featured genes which had potential to classify poor and well differentiation gastric cancer samples were identified, including MYLIP and TMPRSS3, ZNF266 and TM4SF1, SNAI2 and CNFN. To define the featured gene groups that had the highest classification capability, ROC curves to calculate the classification sensitivity and specificity of each gene group were used. The results showed that the combination of SNAI2and CNFN as a classifier had the highest classification sensitivity and specificity. Real-time PCR results showed that 18 of 22 poor differentiation samples were found with high expression of SNAI2 and low expression of CNFN (82%); 6 of 8 well differentiation samples were of low expression of SNAI2 and high expression of CNFN (75%). Conclusion The results indicate that SNAI2 and CNFN are constantly expressed in poor or well differentiation gastric cancer samples, and the expression pattern of these two genes is opposite. These results indicate that SNAI2 and CNFN have the potential for the identification of the differentiation level of gastric cancer.     

p73基因在膀胱尿路上皮癌中的表达及临床意义

目的研究p73基因在膀胱尿路上皮癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法应用免疫组织化学SP法检测60例膀胱尿路上皮癌中p73基因的表达,统计分析其与肿瘤临床病理特征的关系。结果膀胱癌组织中p73阳性表达率为38.3%（23/60）,明显低于癌旁组织（78.3%,47/60,P〈0.01）及正常膀胱组织（86.7%,13/15,P〈0.01）。p73蛋白的表达与膀胱尿路上皮癌组织分化程度有关（P〈0.05）,且与临床分期、浸润及转移也密切相关（P〈0.05）。结论p73基因在膀胱尿路上皮癌的发生和发展中起抑制作用,p73蛋白的表达可能是预判膀胱癌预后的重要指标之一。