天麻DNA的快速提取方法

目的建立天麻基因组DNA快速提取方法.方法CTAB 酚/氯仿法加以改良提取DNA.结果本方法提取的DNA纯度高(A260/A280》1.8),耗时短(2～3h),分子大小约为50kb,适用于随机扩增多态性DNA(RAPD)分析.结论本方法提取DNA纯度高,耗时短,成本低,提取的DNA适宜RAPD分析.     

骨肉瘤基因组DNA的提取及部分酶切分析

目的比较提取骨肉瘤基因组DNA,建立基因组DNA的最佳部分酶切条件并制备其部分酶切产物。方法采用经典的基因组DNA提取法和改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA,以限制内切酶Sau3A I部分酶切,采用玻璃珠(SilverBeads)DNA胶回收试剂盒与蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA。结果提取基因组DNA片段大于150 kb,37℃,Sau3A I 1∶4(u/μg)部分酶切骨肉瘤基因组DNA 30 min获得18 kb~23 kb基因片段的富集,制备目的片段DNA。结论经改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA具有纯度、产量高,方法简单,无蛋白和RNA污染,片段足够长,可被Sau3AI部分酶切,玻璃珠(Sil-ver Beads)DNA胶回收试剂盒和蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA纯度高,无小的DNA片段混入,可满足构建入噬菌体载体(EMBL3)基因组文库。为构建骨肉瘤的入EMBL3载体基因组文库做好了前期工作。     

人类外周血基因组DNA提取方法的比较分析

目的:对2种提取外周血基因组DNA的实验方法进行了比较,建立一种本实验室有效的外周血基因组DNA的提取方法.方法:采用常规试剂盒和本实验室设计的2种外周血液DNA提取法.结果:本实验室使用的外周血基因组DNA提取方法与试剂盒提取外周血基因组DNA的纯度比较无明显差异.结论:本实验室使用的外周血液DNA提取方法简便、有效、经济,满足于基因组的研究.     

一种快速微量外周血基因组DNA的提取方法

目的建立一种简便、快速、有效、微量外周血基因组DNA的提取方法.方法采用NaI作细胞裂解剂裂解细胞和细胞核,用氯仿:异戊醇(24:1)直接提取基因组DNA.结果该方法提取外周血基因组DNA的纯度高A260 nm/A280 nm=(1.87±0.11),提取效率每毫升外周血可得DNA(31±3.12)μg.结论该法简便、快速、有效,适应于批量临床标本的处理.     

骨肉瘤基因组DNA的提取及部分酶切分析

目的比较提取骨肉瘤基因组DNA,建立基因组DNA的最佳部分酶切条件并制备其部分酶切产物.方法采用经典的基因组DNA提取法和改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA,以限制内切酶Sau3A I部分酶切,采用玻璃珠(Silver Beads)DNA胶回收试剂盒与蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA.结果提取基因组DNA片段大于150 kb,37℃,Sau3AI 14(u/μg)部分酶切骨肉瘤基因组DNA 30 min获得18 kb ～23kb基因片段的富集,制备目的片段DNA.结论经改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA具有纯度、产量高,方法简单,无蛋白和RNA污染,片段足够长,可被Sau3AI部分酶切,玻璃珠(Silver Beads)DNA胶回收试剂盒和蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA纯度高,无小的DNA片段混入,可满足构建入噬菌体载体(EMBL3)基因组文库.为构建骨肉瘤的入EMBL3载体基因组文库做好了前期工作.     

适于Panhandle PCR模板的贵阳腐霉基因组DNA的提取方法

目的：探索适合作为锅柄聚合酶链反应（Panhandle PCR）模板的贵阳腐霉基因组DNA的提取方法。方法：采用氯化苄法、微波法、改良的SDS法提取贵阳腐霉基因组DNA,利用核酸蛋白检测仪及琼脂糖凝胶电泳法测定其纯度和浓度,并比较其作为Panhandle PCR模版的扩增效果。结果：氯化苄法、微波法、改良的SDS法均能提取到贵阳腐霉基因组DNA,氯化苄法提取的基因组DNA纯度及含量较高。而且氯化苄法提取的基因组DNA扩增的条带专一,特异性强。结论：氯化苄法提取的贵阳腐霉基因组DNA最适合作为Panhandle PCR的模板。     

血液基因组DNA提取方法的改良简

目的 探讨改良血液样品基因组DNA的提取方法,制备纯化的高分子量DNA。方法 将312份新鲜血液样品随机分为2组:A组(90份)和B组(222份)。A组采用常规基因组DNA提取方法。B组采用改良的基因组DNA提取方法,其基因组DNA提取方法改良之处:1)在血液样品中加入细胞裂解液CL后采用手工震荡,并离心2min 40s;2)震荡混匀后将样品分装成3管,然后将缓冲液GS加入第1管吹打溶解后吸取上清,并加入第2管,再吹打溶解后吸取上清加入第3管,继续吹打溶解;3)加入缓冲液GB后再58℃水浴过夜16h。结果 改良的血液样品DNA提取方法能够提高产率,提高纯度,获取更多高分子量的DNA,相对于常规基因组DNA提取方法有显著提高。结论 改良的血液基因组DNA提取方法操作简便,能有效地避免操作导致DNA链断裂,提高DNA的完整性及纯度。     

全血基因组DNA快速提取法

目的　建立一种简便、快速、有效、微量外周血基因组DNA的提取方法。方法　采用NaI作细胞裂解剂裂解细胞和细胞核 ,用氯仿∶异戊醇 ( 2 4∶1 )直接提取基因组DNA。结果　该方法提取外周血基因组DNA的纯度高 ,A2 60nm/A2 80nm=1 .83± 0 .1 3,每毫升外周血可得DNA 33± 3.5 2 μg。结论　本法简便、快速、有效 ,适用于批量临床标本的处理。     

口腔拭子在药物性耳聋基因检测中的应用

目的：探讨口腔黏膜上皮细胞基因组DNA在药物性耳聋基因A1555G及C1494T突变检测中的应用,寻求基因检测中更简单快捷并无损的样本来源。方法：采集97例来自温州特殊教育学校非综合征型耳聋学生的口腔拭子和外周血,分别提取基因组DNA,进行浓度与纯度的测定、基因扩增及产物测序,比较2种样本来源及2种方法提取的基因组DNA的浓度、纯度、扩增成功率,并将测序结果与人类线粒体DNA剑桥参考序列进行比对。结果：口腔拭子DNA的手工法提取浓度（42.5±41.7）ng/mL与试剂盒法DNA浓度（44.8±43.4）ng/mL差异无统计学意义（P〉0.05）;手工法DNA纯度（1.45±0.73）低于试剂盒法（1.87±0.87）,两组间差异有统计学意义（P〈0.05）;二者扩增成功率与外周血差异均无统计学意义（P〉0.05）;口腔拭子DNA的药物性耳聋基因扩增产物长短一致,测序结果完全相符,均显示A1555G突变阳性2例,阴性95例;C1494T突变97例均阴性。结论：无损性样本口腔拭子扩增成功率高,诊断结果可靠,可替代外周血作为药物性耳聋基因检测的DNA来源,具有一定的临床应用价值。     

Leber遗传性视神经病相关的三种原发性线粒体突变的无创检测方法建立

目的：建立1种Leber遗传性视神经病（LHON）相关的3种原发性线粒体突变11778G＞A、14484T＞C和3460G＞A的无创检测方法。方法：研究对象为在温州医科大学附属眼视光医院就诊的3例（WZ1481、WZ1478、WZ1435）基因检测确定为m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变的LHON患者。采集3例LHON患者和2例野生型健康对照的静脉血样及口腔黏膜细胞样本,然后分别用手工法和试剂盒法提取全基因组DNA,分析比较2种样本、2种方法提取的DNA的纯度及浓度有无差别。最后以携带m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变的LHON患者和野生型的口腔黏膜细胞和外周血提取的全基因组DNA作为模板,通过PCR扩增分别包含以上3种突变的DNA片段,然后进行焦磷酸测序、斑点杂交和Southern blot分析PCR产物。结果：口腔黏膜细胞和血液提取的DNA浓度的差异无统计学意义（P＞0.05）。手工法提取的口腔黏膜细胞DNA纯度低于试剂盒法提取的口腔黏膜细胞和血液DNA的纯度,差异有统计学意义（P＜0.05）。口腔黏膜细胞提取的DNA产量与血液相似。DNA测序结果显示血液样本和口腔黏膜细胞样本具有很好的一致性,对照组均检测不到突变,而突变组可以检测到相应的突变。斑点杂交和Southern blot的结果也一致,对照组均为阳性而突变组均为阴性。结论：口腔黏膜细胞DNA可用于筛查和鉴定LHON的3个主要线粒体突变。本研究建立了一种方便、无创的方法来检测LHON相关的m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变。     

毛细管电泳测定micro RNA346基因多态性的方法研究

目的建立micro RNA346基因多态性的毛细管电泳（CE）测定方法。方法采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取血清样品基因组DNA，PCR扩增micro RNA346目的基因，BciT130Ⅰ限制性内切酶酶切，产物用CE测定。对CE筛分介质质量浓度、分离电压等参数进行了优化。在优化的条件下（筛分介质质量浓度为10 g/L分离电压为12 kV)，分别测定类风湿性关节炎患者和正常人血清样品micro RNA346酶切产物，并对其进行基因分型。结果在优化的CE实验条件下（筛分介质质量浓度为10 g/L，分离电压为12 kV，25 min内可完成micro RNA346基因酶切产物检测。方法日内相对标准偏差（RSD）为0.43%～0.63%，日间RSD为1.49%～1.56%。用该法测定了96份类风湿性关节炎患者样品和43份正常人样品，结果均为micro RNA346 Ⅰ型，未发现micro RNA346 Ⅱ型。结论本研究建立的方法操作简单，具有高效、快速、样品用量少、自动化程度高等优点，适用于micro RNA类小分子RNA基因多态性的测定。     

经典酚/氯仿抽提法和纯化试剂盒法提取全血基因组DNA的比较

目的 比较经典酚/氯仿法和纯化试剂盒法抽提全血基因组DNA的差异.方法 分别对两种方法抽提的全血DNA产物进行紫外分光光度仪、琼脂糖凝胶电泳和体外聚合酶链锁反应（PCR）扩增.结果 两种方法DNA的提取效率相似,TaKaBa试剂盒法提取的纯度[光密度（OD）260nm/280nm]较常规酚/氯仿法明显提高.结论 TaKaBa试剂盒法较传统酚/氯仿提取基因组DNA法快速、简便、经济,可用于PCR模板DNA的制备.     

用改良的盐洗法与酚-氯仿法提取基因组DNA效果比较

目的:探索更为安全可靠的基因组DNA提取方法.方法:采用改良盐洗法提取人外周血白细胞基因组DNA,与传统的酚-氯仿抽提法在提取效果、DNA纯度等方面加以比较.结果:通过对15份不同静脉血标本与酚-氯仿抽提法同步对比研究显示:改良盐洗法提取模板DNA无污染、无害,所提DNA质量好、纯度高,达到酚-氯仿抽提法所获DNA的水平;操作简单、快速,方法稳定可靠,无一例失败.结论:该方法提取的DNA可用于实验以及临床上DNA分型等研究.     

随机扩增多态性DNA技术在中药红曲基原菌系统分类中的应用

目的：建立中药红曲基原菌的随机扩增多成性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析方法。方法：以ＣＴＡＢ法提取紫色红曲霉等７种红曲霉和１株土曲霉的基因组ＤＮＡ;溴化乙啶荧光强度和分光光度双重测定法确定ＤＮＡ浓度;琼脂糖凝胶电泳法检测ＰＣＲ扩增产物,ＰＨＹＬＩＰ３．５ｃ进行聚类分析。结果：从６０个随机引物中筛选出Ｓ２８２等１０个引物的扩增产物谱带多,特征好;红曲霉属种间指纹图谱差异较大,呈现出明显的ＤＮＡ扩增产物多态性。结论：ＲＡＰＤ分析技术可作为真菌系统分类的客观而有效的手段之一。     

Alu-PCR检测人肝癌细胞株PLC/PRF/5基因组中乙型肝炎病毒DNA的整合

目的 应用Alu-PCR方法检测人肝癌细胞株PLC/PRF/5 基因组中乙型肝炎病毒(HBV)DNA的整合。 方法 提取经培养扩增的人肝癌细胞株PLC/PRF/5 基因组DNA,根据Alu-PCR方法经过3轮PCR反应扩增潜在的HBV DNA和人基因组DNA整合片段。琼脂糖凝胶电泳观察PCR 扩增产物片段,切取并纯化整合阳性的电泳条带,对纯化产物进行核酸测序,得到整合片段的核苷酸序列。 结果 经琼脂糖凝胶电泳检测,用Alu-PCR方法能够从PLC/PRF/5 细胞株中扩增得到4条HBV DNA整合序列,经测序后与比对其中3条整合序列能够定位于人染色体03p21.31、05p15.33、12q13.12~q14.1。 结论 Alu-PCR可以准确测定肝细胞中HBV DNA的整合,为研究HBV DNA在肝细胞中的整合研究提供了一个简单、经济的方法。     

笃斯越桔果实总DNA提取方法的比较研究

目的探讨越桔果汁总DNA的最佳提取方法。方法分别采用SDS法、高盐低pH值法、CTAB法、异硫氰酸胍法提取越桔果汁的基因组DNA,并对其进行核酸含量测定和电泳及RAPD-PCR检测。结果SDS法、高盐低pH值法、CTAB法、异硫氰酸胍法提取越桔果汁的基因组DNA其OD260/OD280分别为1.944、1.738、1.661、1.813,其浓度分别为2.363μg/μl、0.548μg/μl、0.735μg/μl、1.455μg/μl;电泳检测显示异硫氰酸胍法提取DNA条带最清晰,扩增产物最多。结论用异硫氰酸胍法提取越桔果汁总DNA优于其它方法。     

有机酚法和Chelex-100法提取不同组织微量DNA效果比较

目的：比较有机酚法和Chelex-100法提取不同组织微量DNA的效果。方法：分别用有机酚法和chelex-100法从外周血、脐带血、绒毛、羊水、胎盘、血斑、口腔分泌物、发根毛囊中提取微量基因组DNA，进行D12S391、D5S818基因座扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析。结果：外周血、脐带血、绒毛、胎盘、口腔分泌物、发根毛囊均适于用Chelex-100法提取DNA，效果与有机酚法相似。结论：Chelex法是一种高效而快速的微量DNA提取方法，适用于产前诊断和法医鉴定微量组织的检测。     

人源蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)病毒部分基因的克隆及序列分析

目的：从我国蓝氏贾第虫（Giardia lamblia)中寻找贾第虫病毒。方法 对人源贾第鞭毛虫北京株进行了体外纯培养，将其总核酸电泳，并用DNA酶和RNA酶处理。根据已发表的蓝氏贾第虫病毒基因序列合成一对引物并进行RT－PCR，将产物回收后连接到Pmd18-T载体上进行克隆并测序，通过BLAST对Gen Bank进行同源性搜索。在贾第虫总核酸电泳图谱上观察到一个分子量约7．0kb的片段。该核酸不能被DNA酶（100μg/ml）降解。但可被RNA酶（10μg/ml）降解。经RT－PCR扩增后得到1条预计856bp的片段，所得序列与蓝氏贾第虫病毒基因同源性为98％。结论 在我国人源贾第鞭毛虫北京株中发现贾第虫病毒，该病毒属于蓝氏贾第虫病毒。     

真菌通用引物结合高分辨熔解曲线分析检测鉴定常见曲霉菌

目的探索一种能够快速检测鉴定临床常见侵袭性曲霉菌病原的新型分子生物学方法。方法以真菌核糖体RNA基因的内转录间隔区2为靶基因,在5.8S、28S rRNA基因上设计泛真菌通用引物,扩增临床常见曲霉菌。同时用新生隐球菌基因组DNA、人基因组DNA及临床常见细菌基因组DNA进行引物特异性检测。将通用真菌引物扩增产物进行高分辨熔解曲线分析。以新鲜提取的烟曲霉基因组DNA为模板按照1∶10的比例梯度稀释,进行敏感性检测。检测7个浓度梯度的烟曲霉基因组DNA。结果设计的真菌通用引物可以扩增临床常见的4种曲霉菌及新生隐球菌,但与人基因组DNA和临床常见细菌基因组DNA无扩增反应,检测限可低至1.5 pg/μl,且4种曲霉菌及新生隐球菌扩增产物的熔解曲线不同。该方法敏感性和特异性均较好。结论利用真菌通用引物的扩增产物结合高分辨熔解曲线分析可以达到检测鉴定临床常见4种曲霉菌的目的,此方法对侵袭性曲霉菌的快速检测鉴定具有重要意义。     

人非抗凝血块中基因组DNA提取不同方法的比较

目的:比较三种不同方法提取人非抗凝血块基因组DNA的效果差异。方法:分别采用酚/氯仿法,天根试剂盒,Invitrigen purelinkTM试剂盒提取冻存时间较长的非抗凝血块基因组DNA,测定浓度、OD260/280值,琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA浓度和纯度,测定PCR产物灰度值。结果:三种方法都可以提取出基因组DNA,测定DNA浓度分别为:(35.56±15.27)ng/μL,(45.13±16.54)ng/μL,(57.93±14.5)ng/μL,组间存在统计学差异(P<0.01),A260/A280值分别为:1.46±0.19,1.49±0.16,1.519±0.23,三组间比较差异无统计学意义(P>0.05);三种方法提取的基因组DNA都能通过PCR扩增出目的条带,PCR产物电泳灰度值结果分别为:75.421±3.435,149.32±6.875和229.52±19.55,组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:三种不同方法都能提取出冻存时间较长的非抗凝血块基因组DNA,但Invitrigen purelinkTM试剂盒法效果最好。