骨髓间充质干细胞Hey1基因表达水平荧光定量RT-PCR方法的建立

目的:建立骨髓间充质干细胞中Notch信号通路靶基因Hey1表达水平的荧光定量RT-PCR方法.方法:培养骨髓间充质干细胞(C2C12),提取总RNA,验证内参基因β-actin和目的基因Hey1的扩增效率,优化PCR条件,分析扩增曲线、融解曲线,凝胶电泳验证定量PCR产物.结果:内参基因β-actin和目的基因Hey1扩增效率一致(扩增曲线斜率差＜0.1),提示可以使用比较Ct法对Hey1进行相对定量分析;扩增曲线、融解曲线及凝胶电泳结果提示PCR产物特异性好.结论:本研究所建立的用于Hey1基因表达分析的定量RT-PCR检测方法,准确可靠,可用于Bmp9和Notch信号通路的研究.     

一种新的T细胞相关分子IBP表达水平定量检测方法的建立

目的 建立一种定量检测IBP表达水平的方法 ,为研究IBP在免疫细胞分化以及在免疫性疾病当中的作用奠定基础.方法 利用反转录PCR和PCR技术获得目的 基因和内参基因片段,构建重组质粒,以重组质粒为标准品,建立实时PCR标准曲线;测定外周血白细胞IBP和β-actin表达水平.以β-actin为内参照,均一化检测结果 .结果 重组质粒的阳性克隆经PCR扩增,0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定,目的 基因片段插入载体内;建立起实时PCR标准曲线.检测20例正常人全血标本,得到比较稳定的检测结果 .结论 成功建立了用实时PCR定量检测IBP mRNA表达水平方法 ,为进一步研究IBP奠定了基础.     

新型MGB探针特异性检测变形链球菌

目的:设计一种新型TaqManMGB探针,利用实时荧光定量PCR检测变形链球菌,提高PCR法检测变形链球菌的特异性,减少检测的假阳性。方法:提取6种不同链球属细菌的DNA,分别进行巢式PCR和TaqManMGB实时荧光定量PCR,比较两种PCR方法检测变形链球菌的特异性。巢式PCR第1轮扩增的引物是细菌16S rRNA基因通用引物,第2轮扩增使用变形链球菌16S rRNA基因可变区序列的特异性引物。TaqManMGB实时荧光定量PCR的引物与第2轮巢式PCR特异性引物相同,设计的MGB探针序列与变形链球菌16S rRNA基因中特异性序列相匹配,不与其他细菌的基因序列匹配。将变形链球菌标准株的DNA样本从2.5 mg/L至0.16μg/L按5倍梯度稀释,制备出实时荧光定量PCR的标准曲线。结果:变形链球菌和格氏链球菌在巢式PCR中均扩增出282 bp的DNA片段,出现假阳性结果。TaqManMGB实时荧光定量PCR能定量检出变形链球菌标准株和临床株,不检出其他链球菌,比巢式PCR特异性更好。TaqManMGB实时荧光定量PCR对变形链球菌DNA的最低检出浓度为20μg/L。结论:本研究设计出一种针对变形链球菌的TaqManMGB探针,建立利用TaqManMGB实时荧光定量PCR特异性检测口腔中变形链球菌的方法。     

FQ-PCR检测小鼠肝癌模型中Cyclin E mRNA方法的建立

目的:建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测小鼠肝癌模型中细胞周期蛋白cyclin E mRNA的方法。方法:以cyclin E和β-actin的PCR产物为阳性模板,分别将二者cDNA产物进行10倍梯度稀释,建立双标准曲线,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测cyclin E和β-actin mRNA含量,对熔解曲线进行分析确定扩增产物的特异性。结果:建立的标准曲线线性关系良好,相关系数r均为-1.00,cyclin E和β-ac-tin扩增效率分别为0.91和0.93,熔解曲线分析显示均为单峰,特异扩增产物的Tm值分别为(81.84±0.28)℃和(89.15±0.26)℃。10-4Cyclin E和β-actin cDNA标本日间变异系数(CV)和批内CV分别为1.02%、1.45%和0.90%、1.48%。结论:SYBR Green I实时荧光PCR定量检测cyclin E mRNA是一种方便快捷、经济实惠、灵敏度高、特异性好的方法,为cyclin E的进一步研究奠定方法学基础。     

实时荧光定量PCR方法检测急性髓系白血病FLT3基因mRNA的表达

[摘　要]　目的 构建检测急性髓细胞白血病FLT3基因mRNA表达的标准品重组质粒和荧光定量PCR方法,为进一步研究FLT3基因表达与急性髓细胞白血病的关系奠定基础。方法 利用引物设计软件设计出扩增FLT3基因的引物和特异性荧光探针。提取K562细胞株总RNA,经RT-PCR 扩增,产物纯化后与pUCm-T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5α,筛选得到标准品的质粒FLT3P。 建立荧光定量PCR 检测 FLT3基因技术方法,建立标准曲线并检测15例初治AML患者。结果 重组质粒进行荧光定量PCR 扩增出现强烈的荧光值增长,表明FLT3 cDNA已成功克隆。以109～105copies/μl不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR 扩增, 所获得的Ct 值与标准品浓度的对数存在良好线性关系, 标准曲线回归系数为0.9998 。AML病例 FLT3表达水平显著高于正常对照组（p=0.017）, 且不同病例的表达水平存在较大差异。结论 成功构建用于定量检测FLT3 mRNA表达得荧光定量PCR的标准品和技术方法; AML病例 FLT3表达水平显著增高。     

SYBR荧光实时定量PCR检测非小细胞肺癌组织与外周血中RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平

目的:建立荧光实时定量PCR技术,检测非小细胞肺癌组织与外周血RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平.方法:分别构建RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin质粒标准品,以SYBR荧光实时定量PCR分析,制备标准曲线,对非小细胞肺癌组织与外周血中RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin的mRNA进行检测.结果:标准曲线呈良好的线性关系.标准品的熔解曲线均呈单峰,特异性良好,说明基本无非特异性扩增.结论:所建SYBR荧光实时定量PCR方法操作简便,费用低,特异性好,准确度、灵敏度高,为后续研究构建了理想的平台.     

树鼩IL-2TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的 建立检测树鼩IL-2基因TaqMan探针实时荧光定量PCR方法.方法 以经ConA诱导培养的树鼩淋巴细胞总RNA为材料,设计特异性引物,通过RT-PCR技术克隆出树鼩IL-2基因,以构建的树鼩IL-2基因质粒为标准品,建立标准曲线,并进行灵敏度检测.结果 建立了树鼩IL-2基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,此法检测灵敏度高,线性范围可达102～109拷贝/ul.结论 成功建立了树鼩IL-2实时荧光定量PCR方法,此方法灵敏度高、特异性强,检测周期短,为探讨IL-2作用的分子作用机制奠定基础.     

ACACB基因rs2268388多态性检测的实验条件

［摘要］目的　建立一种快速、准确、特异的定量检测ACACB基因rs2268388多态性的方法．方法　针对ACACB基因序列设计引物和Taqman探针,探索实时荧光定量PCR技术检测ACACB基因rs2268388多态性的最佳条件,设立不同浓度,并检测其灵敏度和特异性．结果　 PCR反应预变性时间为10 min,退火、延伸时间为1 min时扩增产物效果理想． Taqman实时荧光定量PCR探针及引物浓度 0.5 μL （ 0.2 μM）,TaqMan Genotyping Master Mix 5 μL ,dH2O 2.5 μL总体系为10 μL时扩增产物效果理想并节约了实验费用,检测特异性良好．结论　优化Taqman探针法的实验条件能够灵敏、特异、稳定地对ACACB基因rs2268388多态性进行定量检测,并有效节约了实验成本.     

实时荧光定量分析SK-N-SH细胞中β-actin mRNA的半衰期

目的:探讨和分析SK-N-SH细胞中β-actin mRNA的半衰期.方法:建立包含β-actin基因片断的pMD-T载体的梯度稀释曲线,应用VIC标记的Taqman-MGB探针进行检测,用Opticon2.02软件分析结果.以不同浓度和不同时间的放线菌素D阻断SK-N-SH细胞转录,提取总RNA并予荧光定量RT-PCR检测β-actin mRNA.结果:SK-N-SH细胞中β-actin mRNA的半衰期为4 h.与未处理组相比,4 h组β-actin的拷贝数差异有显著性(P＜0.05),12 h和24 h组β-actin拷贝数差异有极显著性(P＜0.01).不同浓度之间放线菌素D对β-actin拷贝数的影响差异不大(P＞0.05).结论:应用实时荧光定量RT-PCR,通过比较mRNA与总RNA的拷贝数,建立了一种准确方便地检测mRNA衰减的方法.同时β-actin不适合做放线菌素D处理实验中的内参照.     

NIDD基因TaqMan探针的制备及其在实时荧光定量PCR方法中的应用

目的：制备NIDD基因TaqMan探针建立检测NIDD基因荧光定量PCR（FQ-PCR）,以进一步研究NIDD的表达情况。方法：采用RT-PCR法,从出生后一天的SD大鼠脑组织mRNA中扩增NIDD基因的部分编码序列区（CDS）片段,克隆入pGEM-T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定及序列测定。采用TaqMan探针,以重组质粒为模板绘制标准曲线。结果：RT—PCR法扩增出一特异产物与预期长度112bp相符,DNA序列测序的结果与C,eneBank提供的已知序列（AB098078）比较,所克隆的NIDD基因片段与其中的112bp完全相同,与NIDD基因100％同源。以重组质粒为模板绘制标准曲线,相关系数r大于0．99,反应效率显示为1,各点变异系数小于10％。结论：采用RT．PCR和T载体技术成功制备出可应用于FQ-PCR的NIDD基因TaqMan探针。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

尿微量白蛋白检测在继发性肾脏疾病中的临床意义

目的探讨尿微量白蛋白（m-Alb）检测在继发性肾脏疾病中的临床意义。方法采用Beckman Immage全自动特种蛋白分析仪对糖尿病组、高血压组、心脏病组患者进行了m-Alb测定,同时与健康组结果作对比。结果m-Alb检测糖尿病组为3.7±5.26mg/dl,高血压组为7.5±8.18mg/dl,心脏病组为7.8±3.76mg/dl,健康组为0.66±0.48mg/dl,各试验组m-Alb增高百分率为糖尿病组48.9%,高血压组37.5%,心脏病组26.9%。结论尿蛋白阴性的糖尿病、高血压、心脏病患者进行m-Alb检测,可以监测病程的进展。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。