Vascular endothelial growth factor gene transfection to enhance the repair of avascular necrosis of the femoral head of rabbit

Avascularnecrosisofthefemoralheadisadebilitatingdiseasethatusuallyleadstodestructionofthehipjointandincreasingmusculoskeletalmorbidityinyoungandmiddleagedpatients Totaljointreplacementiscommonlyusedtotreatdisablingsecondaryosteoarthrosis Althoughthemostrecentimprovementsintotalhipreplacementmaydecreasefailure,thepatientsareusuallyyoungandcurrenthipprostheseswon’tfunctionwellfortheremaininglifeexpectancyofthesepatients Thus,it’snecessarytodelayoreliminatetheneedforhipreplacementbytreatingthis…     

脱蛋白骨联合VEGF基因转染治疗股骨头缺血坏死

目的探索一种新的方法治疗股骨头早期缺血性坏死（avascular necrosis of the femoral head,AVNFH）。方法69只AVNFH造模成功后的新西兰大白兔随机分成3组。第1组,将脱蛋白骨（deproteinized bone,DPB）复合pcDNA3．1／VEGF165质粒植入坏死的股骨头内,第2组植入DPB,第3组仅在股骨头内钻一隧道。术后3d,1、2、4、8和16周获取标本。RT—PCR、Western blot和免疫组化技术分别检测VEGF165 mRNA、蛋白的表达及安全性。X线大体观察成骨情况,组织形态学分析血管发生和股骨头修复。结果第1组VEGF165 mRNA和蛋白表达术后1周达到高峰,时间持续超过3周,第1组动物术后远膈脏器未检测到VEGF165的表达。血管形成术后2,4周增加,骨形成术后2,4和8周增加,与另两组相比差异有显著性（P〈0．01）。结论VEGF165基因转染可促进局部血管的早期形成,DPB-VEGF复合物可增加骨形成,VEGF基因治疗兔AVNFH有效、安全,脱蛋白骨联合VEGF165基因治疗为骨坏死的修复提供了理论基础。     

Ad-huVEGF121基因转染对兔坏死股骨头血流的影响

目的探讨一种治疗股骨头缺血坏死的新方法.方法重组腺病毒Ad-hVEGF121注射入坏死的股骨头,应用RT-PCR和免疫组织化学技术检测VEGF121的表达,观察股骨头内新生血管数量,用SPECY技术观察坏死股骨头的动脉灌注情况.结果转染后的股骨头内VEGF121表达增高,新生血管数量增多,SPECT观察发现坏死股骨头血流量明显增加.结论转染VEGF1:1基因可以增加坏死股骨头新生血管数量和血流量.     

Experimental Study of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Therapy for Avascular Necrosis of the Femoral Head

Avascularnecrosisofthefemoralheadisanin creasingcauseofmusculoskeletalmorbidityinyoungandmiddleagedpersons It’sadebilitatingdiseasethatusuallyleadstodestructionofthehipjoint To taljointreplacementiscommonlyusedtotreatdis ablingsecondaryosteoarthrosis Althoughthemostrecentimprovementsintotalhipreplacementmayde creasethefailure ,thepatientsareusuallyyoungandthecurrenthipprothesiswouldn’tfunctionwellfortheremaininglifeexpectancyforthesepatients Forthisreason ,it’snecessarytodelayoreliminatethe…     

VEGF基因转染结合脱蛋白骨修复股骨头坏死的实验研究

目的:构建pcDNA3.1/VEGF165质粒及联合脱蛋白骨基因治疗早期股骨头缺血性坏死.方法:将含人VEGF165全长cDNA序列的克隆载体pUC18/VEGF165与pcDNA3.1( )载体构建成重组真核表达质粒pcDNA3.1/VEGF165;69只AVNFH造模成功后的新西兰大白兔随机分成3组.第一组,将脱蛋白骨复合pcDNA3.1/VEGF165质粒植入坏死的股骨头内;第二组植入DPB;第三组仅在股骨头内钻一隧道.股骨头标本术后3天,1,2,4,8和16周获取.RT-PCR检测VEGF165mRNA的表达,Western blot检测VEGF165蛋白的表达,组织形态学分析血管发生和股骨头修复.结果:成功构建pcDNA3.1/VEGF165;第一组VEGF165 mRNA和蛋白表达术后1周达到高峰,时间持续超过3周.血管形成术后2,4周增加,骨形成术后2,4和8周增加,与另两组相比差异呈显著性(P＜0.01).结论:VEGF165基因转染可促进局部血管的早期形成,DPB-VEGF复合物可增加骨形成.脱蛋白骨联合VEGF165基因治疗为骨坏死的修复提供了理论基础.     

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells transfected with rAAV2-bFGF on early angiogenesis of calvarial defects in rats

The purpose of this study was to evaluate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) transfected with the basic fibroblast growth factor (bFGF)-expressing recombinant adeno-associated virus vector (rAAV2-bFGF), on early angiogenesis of calvarial defects in rats. The MSCs were cultured and transfected with rAAV2-bFGF after differential adherence isolation. The transfection efficiency was detected by RT-PCR and Western blotting. The transfected MSCs were compounded with poly-DL-lactide/hydroxyapa...     

HISTOMORPHOMETRIC STUDY OF SUBCHONDRAL BONE OF NECROTIC FEMORAL HEAD IN RABBITS INDUCED BY METHYLPREDNISOLONE COMBINED WITH LOW-DOSE LIPOPOLYSACCHARIDE

Objective To investigate the histomorphometric features of the necrotic femoral head of rabbits induced by methylprednisolone combined with lipopolysaccharide. Methods Thirty-two male adult New Zealand white rabbits were used. Among them, 16 were injected with lipopolysaccharide and methylprednisolone (osteonecrosis group), and another 16 were sham-injected with saline (control group). Magnetic resonance (MR) imaging was taken for femoral heads of the rabbits in both groups at the end of 2, 4 and 6 weeks after the injection. All the rabbits were then killed 6 weeks later. The femoral heads of the rabbits were collected and processed for histological and histomorphometric analysis. Results Femoral head necrosis occurred in 14 rabbits of the osteonecrosis group which were confirmed by histological evaluation and MR imaging. Osteonecrotic femoral heads, compared to controls, were characterized by lower values of bone volume/tissue volume (P<0.01), tabecular thichness (P<0.01), osteoid surface/bone surface (P<0.05), mineralizing apposition rate (P<0.05), and bone formation rate/bone surface (P<0.05). However, tabecular separation and eroded surface/bone surface were higher in osteonecrotic femoral heads than in controls (P<0.01). Trabecular number and osteoclast surface/bone surface did not differ significantly. Conclusion The results demonstrated that osteoporosis was apparent in osteonecrotic femoral heads induced by methylprednisolone and lipopolysaccharide, due mainly to trabecular thinning rather than reduction of trabecular number. This might be due to reduced bone formation combined with increased bone resorption.     

骨髓基质干细胞复合同种骨移植治疗创伤性股骨头坏死实验研究

目的探讨骨艇基质干细胞复合同种骨移植在治疗创伤性股骨头坏死中的成骨作用。方法6月龄SD大鼠36只,随机分为模型组、髓芯减压组及复合骨组。每组12只。取4周龄SD大鼠骨髓基质干细胞体外分离培养,取生长状态良好的第三代细胞复合同种骨粉;采用圆韧带离断方法制备大鼠创伤性股骨头坏死动物模型;于术后1、2、4、6周分别处死动物;光镜下观察三组间病理形态学改变;骨形态计量学参数测量及计算新骨生成量,得出骨小梁相对体积（BV／TV）、骨小梁厚度（Tb．Th）、骨小梁数量（Tb．N）、骨小梁分离度（Tb．Sp）。结果成功的复制出大鼠股骨头坏死模型,呈现出典型股骨头坏死不同时期病理改变;术后6周,骨形态计量学参数检测结果：复合骨组新骨生成量均多于模型组及髓芯减压组,其参数BV／TV、Tb．N、Tb．Th、Tb．Sp与其他二组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论BMSCs复合同种骨支架可作为“活骨”用于ONFH模型治疗并在其修复中可提高诱导成骨能力及股骨头坏死的骨修复能力,其作用优于单纯髓芯减压。     

腺相关病毒介导bFGF基因转染促进人骨髓基质细胞成骨实验研究

目的:观察腺相关病毒介导人碱性成纤维细胞因子(bFGF)基因转染对人骨髓基质细胞(hMSCs)成骨能力的影响。方法:从健康志愿者全骨髓中分离培养人骨髓基质细胞,体外扩增纯化后随机分为4组。①腺相关病毒介导人碱性成纤维细胞因子(AAV-bFGF)组:培养液中加入人碱性成纤维细胞因子基因重组腺相关病毒1×1010OPU/ml,孵育24h后换普通培养液继续培养;②β半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒(AAV-LacZ)组:用半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒替换bFGF,其余处理与AAV-bFGF组相同;③阳性对照组:培养液中添加地塞米松(1nmol/L)、抗坏血酸(10mmol/L)和β-甘油磷酸钠(50mg/L);④空白对照组:不给予特殊处理。各组细胞处理后2wk,免疫组化观察bFGF表达,Von Kossa染色检测人骨髓基质细胞中骨胶原结节形成,全自动生化分析仪检测培养上清碱性磷酸酶(ALP)活性。结果:经多次换液传代,人骨髓基质细胞呈均一梭形形态。处理后AAV-bFGF组与阳性对照组细胞形态逐渐趋于扁平,突起减少。AAV-LacZ组和空白对照组形态无明显变化。免疫组化染色见bFGF主要在胞浆内表达,AAV-bFGF组bFGF表达明显强于其他3组。von Kossa染色AAV-bFGF组与阳性对照组可见大量红色骨胶原结节形成,显著多于AAV-LacZ组和空白对照组。培养上清液ALP活性检测AAV-bFGF组与阳性对照组显著高于AAV-LacZ组和空白对照组。结论:基因重组腺相关病毒人碱性成纤维细胞因子转染对人骨髓基质细胞成骨能力具有促进作用。     

他莫昔芬对去势大鼠松质骨及皮质骨骨密度的影响

目的：选择性雌激素受体调节剂对去势大鼠松质骨,皮质骨骨密度的影响,方法：将21只SD大鼠随机分为3组,每组7只,A组为对照组,B组为去势组,C组为去势＋他莫昔芬组,在去势后5wk给药,术后16wk处死各组大鼠,进行离体骨密度（bone mineral demsity,BMD)测量及组织形态学测量,结果：（1）与对照组相比,去势组去势后16wk股骨头,股骨颈,股骨干,肱骨头,肱骨干,腰椎BND显降低（P＜0．01）,骨小梁体积,骨小梁碍度,椎体皮质骨厚度,结连结密度,结密度亦明显降低（P＜0．05）而游离端密度和结连游离瑞密度增高（P＜0．01）,（2）他莫昔芬治疗后11wk,各部位BMD增加（P＜0．01）,但没有恢复到正常水平（P＜0．05）,腰椎骨小梁连接参数恢复到对照组水平（P＞0．05）,结论：（1）去势后16wk大鼠松质骨,皮质骨骨量均明显下降,腰椎骨小梁三维结构破坏,骨小梁连结程度降低。（2）他莫昔芬治疗后,松质骨,皮质骨骨量均明显增加,但没有恢复到去势前水平,（3）他莫昔芬能增加腰椎椎体皮质骨厚度,增加腰椎骨小染厚度,增加皮质骨,松质骨骨量,还可提高腰椎微构筑的质量,使骨小染连程度增加。     

骨形态发生蛋白3基因转染成纤维细胞后细胞形态及生物学变化

目的 通过基因转染方法，用骨形态发生蛋白3（BMP3）基因转染成纤维细胞（NIH－3T3细胞），观察转染不同时期被转染细胞的形态学改变及细胞内碱性磷酸酶含量的变化，初步探讨骨组织工程种子细胞来源的另一途径。方法 定向克地将BMP3基因构建于PcDNA3表达载体，脂质体介导法转染NIH－3T3细胞，G418筛选获得稳定转化体，观察不同时期被转染细胞的形态学变化，钙钴法染色转染细胞时相的碱性磷酸酶并作图像分析。结果 转染细胞培养筛选6周提取的总RNA用Dot blot可以检出有明显的BMP3 mRNA表达。转染细胞第1周细胞形态由长梭形变为杆状，转染后2周细胞由长梭形变为多角形，转染后4周细胞变为多边形，类似成骨细胞，钙钴法碱性磷酸酶染色示转染组细胞胞浆内有大量染色黑色的碱性磷酸酶颗粒，及图像分析及转染细胞内碱性磷酸酶明显高于同期对照组，两组间有显著性差异（P＜0．01）。结论 通过向NIH－3T3细胞内转染BMP3基因，可以使NIH－3T3细胞形态向成骨细胞形态发生转化，被转染细胞内碱性碱性磷酸酶水平明显增高，已具有成骨细胞某些特性。     

pcDNA3-EGEP基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的探讨外源性pcDNA3-EGFP基因转染修饰兔骨髓间充质干细胞的可行性.方法用增荧光绿色蛋白(enhanced greenfluorescent protein,EGFP)cDNA作为报告基因,采用重组真核表达载体系统(pcDNA3-EGFP)以脂质体法转染原代骨髓间充质干细胞,观察转染结果、表达情况及对靶细胞活力的影响.结果经荧光显微镜下观察证实成功地对骨髓间充质干细胞实现了基因转染,持续表达时间超过8周;没有发现明显的细胞毒作用及对细胞活力的显著影响.结论采用真核转染技术可以介导外源基因转染骨髓间充质干细胞,为今后采用基因增强组织工程方法治疗肌肉、骨骼系统疾病提供了实验基础.     

组织工程骨对犬股骨头缺损坏死模型再血管化的作用

目的 观察吸附有骨形态发生蛋白（BMP）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的异体脱抗原松质骨（AACB）植入股骨头坏死（FHN）病灶清除区后的病理变化过程，评价bFGF对FHN的再血管化作用。方法 建立液氮冷冻诱导性犬FHN缺损坏死模型，以该种材料充填骨腔。术后行股骨头组织学大体观察、组织切片免疫组化血管染色并进行血管计数和血管面积图像分析。结果 组织学大体观察，3周时大量新生组织长入移植物内；6周时大量新生骨小梁长入；12周时骨小梁已布满充填区。血管计数，术后3周移植孔隙内大量血管增生；6周、12周时血管数量进一步增加。血管面积，术后3周血管截面积占视野的18，27％；6周、12周时血管截面积进一步加大。结论 AACB是生长因子的良好吸附栽体。适宜新生血管长入。吸附有bFGF及BMP的AACB具有较强的再血管化能力，能有效地提高骨坏死病理条件下股骨头的骨修复能力。这一疗法有望成为FHN治疗的一种手段。     

用infiltrator导管向兔髂动脉壁内导入calponin基因的效果

目的 探讨calponin基因对血管再狭窄的防治作用；评价用infiltrator系统进行基因转染的实用价值。方法 以pCAGGS质粒为基因载体，以脂质体为介导，用infiltrator浸壁球囊导管向兔髂动脉壁内导入人重组calponin基因。结果 实验组（n=6)基因转染全部成功。4wk后转基因组血管内膜增生较轻，而对照组（n=6）血管内膜明显增生，管腔显变窄。未观察到目的基因及转染系统相关的不良反应。结论 infiltrator导管是活体局部转基因的合适工具；用该导管转染calponin基因可能成为防治血管再狭窄的有效方法。     

腺病毒载体介导的bFGF基因体外转染大鼠平滑肌细胞的实验研究

目的观察携带bFGF基因的重组腺病毒体外转染平滑肌细胞的效率及转染后目的基因的表达。方法应用磷酸钙共沉淀法分别构建携带bFGF基因和大肠杆菌LacZ报道基因的重组腺病毒载体Ad．bFGF和Ad．LacZ,并以Ad．bFGF（组Ⅰ）、Ad．LacZ（组Ⅱ）、PBS（组Ⅲ,对照组）转染体外培养的大鼠平滑肌细胞（SMCs）。X—gal染色检测腺病毒载体的转染效率,噻唑蓝（MTT）检测各组SMCs的增殖情况,酶联免疫吸附（ELISA）检测各组培养液中bFGF蛋白的浓度。结果当MOI值为100时,X-gal核蓝染细胞比率达95％以上;组ⅠSMCs的增殖水平显著高于组Ⅱ和组Ⅲ（P〈0．01）;ELISA方法检测,在转染后第1天组Ⅰ培养波中即有bFGF蛋白的分泌表达,第3天达峰值后分泌量逐渐下降,第8天仍能检测到少量分泌,而组Ⅱ和组Ⅲ培养液中均未检测到bFGF蛋白。结论成功地将所构建的Ad. bFGF转染体外培养的SMCs,并在培养液中检测到目的基因的蛋白表达。     

pCD-rbFGF重组质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

为了构建碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)真核表达质粒,并探讨应用bFGF基因治疗骨科各种疾患的可能性,将鼠碱性成纤维细胞生长因子cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3中,构建了重组质粒pCD-rbFGF.通过Liofectin介导将pCD-rbFGF转染兔成骨细胞,经免疫组化检测证实兔成骨细胞获得了bFGF的瞬时表达.提示该bFGF真核表达质粒有效,可用于进一步基因治疗研究.     

重组腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染大鼠间充质干细胞的实验研究

目的 体外研究重组腺病毒载体介导绿色荧光蛋白基因转染大鼠间充质于细胞(MSCs)的方法.方法 用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离纯化大鼠MSCs并进行鉴定,重组绿色荧光蛋白的腺病毒载体Ad-GFP转染,荧光显微镜检测其转染效率,CCK-8法检测转染细胞的增殖能力.结果 Ad-GFP对大鼠MSCs的感染率高达90.0%,感染1月后仍有稳定表达;转染细胞的增殖能力与未转染细胞相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 重组腺病毒载体Ad-GFP可高效感染MSCs,基因转染后细胞的增殖能力不受影响,可作为一种高效的大鼠MSCs的标记方法.     

促血小板生成素基因转染小鼠骨髓基质细胞体外表达的实验研究

目的探讨促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)基因修饰的小鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)体外表达TPO的变化特点。方法以脂质体介导法将TPO cDNA真核表达质粒转染BMSCs,RT-PCR方法检测TPO mRNA的表达,免疫组化法及Western blot测定TPO蛋白的表达。结果转染TPO基因的BMSCs其TPO mRNA及TPO蛋白表达量明显高于空载体组(P<0.01)及未转染组(P<0.01)。结论阳离子脂质体能有效介导TPO cDNA真核表达质粒转染BMSCs,且转染后BMSCs中TPO mRNA及TPO蛋白的表达显著上调。     

VEGF165基因转染兔骨髓间充质干细胞治疗兔激素性股骨头坏死的实验研究

目的以hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞移植治疗兔激素性股骨头坏死模型,通过影像学观察、病理学及免疫组织化学检查等方法评价疗效。方法使用马血清与醋酸泼尼松龙制备兔激素性股骨头缺血性坏死动物模型后分为4组,分别进行以下治疗：A组（不作任何处理）;B组（髓心减压＋自体骨移植）;C组（髓心减压＋骨髓间充质干细胞＋自体骨移植）;D组（髓心减压＋Ad-VEGF165转染骨髓间充质干细胞＋白体骨移植）。术后3周处死行病理学、免疫组织化学检查及Western Blot检测股骨头内VEGF的表达,比较各组间的差异。结果D组在软骨下血管、VEGF阳性面积百分比、股骨头内VEGF的相对浓度均高于其他各组;在VEGF平均灰度值、空骨陷窝率低于其他各组,且各组间差异有统计学意义。结论转染了Ad—VEGF165的骨髓间充质干细胞在宿主股骨头局部可以表达VEGF蛋白,且较单纯的骨髓间充质干细胞移植表达的强度更高,对激素性股骨头坏死进行早期治疗具有确切疗效。