肝复康药物血清对肝星状细胞核因子-kB及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响

目的:通过观察中药肝复康中剂量浓度含药血清对肝星状细胞T6(hepatic stellate cell-T6,HSC-T6)细胞株中核因子-κB (NF-κB)、Ⅰ型胶原(Type Ⅰ Collagen,Col Ⅰ)及Ⅲ型胶原(Type Ⅲ Collagen,ColⅢ)基因表达的影响,探讨其抗纤维化的作用及分子机制.方法:常规方法制备肝复康中剂量浓度含药血清,并用肝复康含药血清干预,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-Blot方法观察分析NF-κB、ColⅠ和Col Ⅲ表达的变化并探讨其相关性.结果:经乙醛刺激后的HSC -T6细胞株NF-κB、Col Ⅰ和ColⅢ表达均上调,肝复康中剂量浓度含药血清处理后可明显下调上述基因的表达.结论:中药肝复康抗纤维化的机制可能与其抑制NF-κB及Col Ⅰ、Col Ⅲ的表达有关.     

核因子-κB与肝纤维化分子调控

核因子-κB（NF-κB）是一种广泛存在于体内细胞的核转录因子,NF-κB可因一些细胞因子、氧化剂、蛋白激酶、脂多糖等的刺激而被激活,调节细胞因子、趋化因子、生长因子、粘附分子、免疫受体基因和转录因子等多种物质的表达。因此,在细胞分化、免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、肿瘤生长及血液性疾病等的病理生理过程中发挥重要作用。在肝脏炎症、纤维化及肝细胞再生、凋亡等病理生理过程中都伴有NF-κB的活化,NF-κB参与调控肝细胞的凋亡和增殖,并调节局部各种介质释放引起的炎症反应,同时促发KC产生各种炎性因子,扩大肝脏炎症,最终使肝星状细胞活化,产生大量胶原纤维,形成肝纤维化。     

肝复康对肝纤维化大鼠肝组织NF-κB、MMP-2和TIMP-2表达的影响

目的研究中药肝复康对肝纤维化大鼠肝脏NF-κB、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和金属蛋白酶组织抑制因子2（TIMP-2）基因表达的影响。方法随机将SD大鼠分为正常对照组、模型组、小剂量、中剂量和大剂量治疗组,制备CCl4肝纤维化模型,自第9周起,给予中药肝复康治疗至第20周。采用Western-Blot法检测NF-κB表达;采用RT-PCR法观察NF-κB、MMP-2和TIMP-2 mRNA水平。结果模型组大鼠肝组织NF-κB、MMP-2和TIMP-2表达增加,肝复康可明显抑制上述因子的表达（P〈0.01）,且三者mRNA水平在各组间呈显著正相关。结论肝复康治疗肝纤维化可能与其抑制NF-κB、MMP-2和TIMP-2的表达有关。     

白细胞介素-10抑制肝星状细胞核因子-κB活化的研究

肝星状细胞(HSC)在肝纤维化方面起重要作用，阻止HSC活性过强是治疗肝纤维化重要环节之一。核因子-κB(NF-κB)的活化能产生细胞间粘附分子(ICAM)-1、白细胞介素(IL)-6等，加重肝组织炎症和损伤。IL-10能抑制HSC产生Ⅰ型胶原和增加基质金属蛋白酶13(MMP-13)的表达，但这种作用的机制仍不清楚。我们旨在探讨IL-10是否通过HSC内NF-κB的作用产生各种效应。     

中药复方861抑制肝星状细胞NF-κB活性的体外研究

目的 研究中药方861对肝星状细胞NF－κB活性的影响。方法 将5mg/ml的复方861加入体外培养的大鼠肝星状细胞系作用48h,NF－κB活性的检测采用凝胶电泳移动抑制法,细胞培养液中细胞因子的检测采用ELISA法,细胞凋亡采用流式细胞仪和TUNEL法检测。复方861作用命名体外培养的肝星状细胞NF－κB结合活性比未加药的空白对照组显著减弱,细胞培养液中的IL－6和sICAM水平减低（P＜0.05）,星状细胞凋亡增加（P＜0.01）。结论 复方861显著抑制体外培养的肝星状细胞NF－κB活性可能为治疗肝纤维化中的重要机理之一。     

N-乙酰半胱氨酸对肝星状细胞核因子κB的影响

目的　阐明N乙酰半胱氨酸(NAC)对肝星状细胞(HSC)核因子κB(NF-κB)结合活性和环氧合酶 2(COX-2)表达的影响机制。方法　体外培养大鼠 HSC-T6 细胞株,MTT法检测 NAC对HSC增殖的抑制作用。分别予NAC(1 mmol/L)处理 1 h;NAC和肿瘤坏死因子(TNF)α联合干预(先予 NAC处理1 h,再予TNFα干预1 h);TNFα100 ng/ml处理1 h。凝胶电泳移动抑制实验检测NF κB的结合活性。免疫蛋白质印迹检测相应的胞质内NF-κB抑制蛋白(IκBα)表达。免疫组化观察 HSC-T6NF-κB表达的核转移。激光共聚焦检测NAC对 HSC-T6 中 COX-2 表达的影响。结果　NAC对 HSC具有明显的抑制作用。TNFα可诱导 NF-κB结合活性,而 NAC可显著抑制 TNFα诱导的 NF-κB结合活性。TNFα处理后 IκBα表达减弱,NAC处理后 IκBα表达增强。TNFα刺激 1 h后,NF κB表达从细胞质转移至细胞核内。NAC预处理后再予TNFα刺激,NF κB表达主要位于细胞质,很少发生核转移。HSC T6经TNFα处理后细胞内COX 2表达明显高于NAC和TNFα联合处理组以及正常对照组(P<0.05);NAC和TNFα联合处理组与正常对照组差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论　NAC可抑制HSC增殖,抑制HSC-NF κB结合活性和COX-2表达。     

白细胞介素-10对实验性肝纤维化大鼠肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响

目的:探讨外源性IL-10对实验性肝纤维化大鼠肝星状细胞Col-Ⅰ和Col-Ⅲ mRNA表达的影响.方法:60只清洁级SD雄性大鼠,随机分为生理盐水对照组(N组,8只)、CCl4组(C组,28只)和IL-10干预组(I组,24只)3组,于造模第7周和第11周分别随机选取一批大鼠,分离肝星状细胞并提取总RNA,以半定量RT-PCR方法检测各组Col-Ⅰ和Col-Ⅲ mRNA表达的水平.结果:随着肝纤维化的进展,C组Col-Ⅰ和Col-Ⅲ mRNA的表达增加并呈增强趋势(与N组比较,P＜0.01;与第7周比较,Col-ⅠP＜0.01;Col-Ⅲ P＜0.05).造模第7周,Ⅰ组Col-Ⅲ mRNA的表达量低于C组(P＜0.01);造模第11周,两种胶原Ⅰ组的表达量均进一步下降(与C组比较,P＜0.01;与第7周比较,Col-ⅠP＜0.05;Col-ⅢP＜0.01),与正常组差异无显著性意义(P＞0.05).结论:随着肝纤维化进展,肝星状细胞内Col-Ⅰ和Col-Ⅲ mRNA的表达增加,外源性IL-10能显著降低两者的表达.     

内毒素对肝星状细胞醛固酮分泌及核因子-κBP65 mRNA表达的影响

目的 探讨内毒素对大鼠肝星状细胞(HSC)醛固酮的分泌及核因子-κB P65(NF-κBP65)mRNA表达的影响.方法 传代培养大鼠HSC-T6,不同浓度内毒素处理细胞后分组.放射免疫法检测HSC分泌醛固酮的情况,半定量RT-PCR方法检测HSC表达NF-κB P65 mRNA的水平.应用方差分析、t检验和Pearson直线相关分析法进行统计学分析.结果 浓度为0.01、0.1、1.0和10.0 mg/L内毒素组醛固酮的分泌分别为(4.95±0.35)、(5.52±0.32)、(6.04±0.60)和(5.16±0.46)μg/L,显著高于对照组的(3.65±0.51)μg/L(t=2.9745,5.8725,6.8465,3.2065;均P＜0.05).浓度为0.01、0.1、1.0和10.0 mg/L内毒素组NF-κB P65 mRNA的表达分别为0.825±0.06、1.07±0.07、1.23±0.06和0.96±0.05,也明显高于对照组的0.43±0.04(t=5.4776,6.8084,7.9382,7.5136;均P＜0.01).10.0 mg/L内毒素组醛固酮的分泌和NF-κB P65 mRNA的表达均较1.0 mg/L内毒素组有明显降低(t=4.3865,3.7246;均P＜0.05).HSC中醛固酮的分泌与NF-κB P65 mRNA的表达存在正相关(r=0.886,P＜0.01).结论 一定浓度范围的内毒素可以上调大鼠HSC醛固酮的分泌和NF-κB P65 mRNA的表达,两者存在正相关和一定的剂量效应关系,这可能是引起肝纤维化的重要因素之一.     

核转录因子在肝星状细胞激活中的作用

肝纤维化的形成是多种类型细胞、氧化压力、细胞因子和生长因子等一系列复杂作用的结果[1]。库普弗细胞和肝星状细胞(HSC)的激活是肝纤维化发生过程中两个重要的步骤[2]。HSC可台成以I型为主的多种胶原,形成细胞外基质(ECM),破坏肝脏的固有结构,是目前研究的热点。     

核因子-κB抑制剂与肝纤维化关系

核因子-κB(NF-κB)是Sen和Baltimore等(1986)首先发现的一种能够与B细胞免疫球蛋白κ轻链基因的增强子-κB序列特异结合的核蛋白因子,与许多靶基因的转录启动有关,在细胞和生物体生长、分泌、细胞系定向等过程中起非常重要的作用.     

霉酚酸对内皮细胞核因子-κB及其抑制因子IκBα的影响

目的研究霉酚酸(mycophenolic acid,MPA)对内皮细胞核因子-κB(NF-κB)活力及其抑制因子IκBα的影响.方法利用凝胶迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,     

NF-κB在鼠肝纤维化组织中的表达及其与α-SMA、Ⅲ型胶原的相关性

目的:研究核转录因子B(Nuclear factor kappaB,N F-B)在鼠肝纤维化组织中的表达及其与-平滑肌肌动蛋白(-smooth muscle actin,-SMA)、Ⅲ型胶原相关性.方法:32只♂清洁级SD大鼠随机分为正常对照组8只和模型组24只,用CCl4皮下注射法制备肝纤维化模型组,免疫组化和RT-PCR方法联合检测NF-B、-SMA、Ⅲ型胶原蛋白及基因在肝纤维化组织中的动态表达,并对3者表达作相关性分析.结果:正常对照组肝组织中NF-B、-SMA及Ⅲ型胶原的蛋白及基因均有微量表达;CCl4注射后2、4和6 wk肝组织NF-B、-SMA及Ⅲ型胶原的蛋白及基因表达呈明显递增趋势(P<0.05),2 wk后3者表达呈显著正相关(P<0.05).结论:NF-B表达随着肝纤维化程度的加重而增强,在肝纤维化的发生和发展中起重要作用.     

拆方益肝康不同药物血清对肝星状细胞胶原代谢及TGF-β1的影响

目的:探讨益肝康抗肝纤维化作用机制、配伍意义,并采用对比血清药理学方法探讨更为科学的中药研究方法.方法:分别制备益肝康及其拆方-丹参小复方正常大鼠(A组,A1组:正常大鼠血清对照组;A2组:正常大鼠丹参小复方血清组;A3组:正常大鼠益肝康血清组)与肝纤维化大鼠(B组,B1组:肝纤维化大鼠血清对照组:B2组:肝纤维化大鼠丹参小复方血清组:B3组:肝纤维化大鼠益肝康血清组)药物血清,温育体外培养的HSC,3H-脯氨酸掺入法检测胶原合成,Western blot技术检测TGF-β1蛋白表达,RT-PCR技术检测TGF-β1 mRNA表达.结果:益肝康及丹参小复方正常大鼠与肝纤维化大鼠药物血清均可抑制HSC胶原合成(100mL/L时A组:2275.00±114.30 cpm,2401.87±108.50 cpm vs 2963.62±128.01 cpm;B组:2205.3l±108.97 clom,2462.70±177.02 epm vs 3179.12±223.34 cpm;200 mL时A组:2372.96±123.3 cpm Vs 2515.37±98.25 cpm vs 3209.38±110.75 cpm;B组:2394.29±1 50.50 cpm vs 2611.25±126.05 cpm vs 3490.46±183.16 cpm,P<0.05或0.01).100 mL时降低TGF-β1基因及蛋白表达(均P<0.01).2组在胶原合成、TGF-β1基因及蛋白表达益肝康组作用优于丹参小复方(均P<0.01),而益肝康组与丹参小复方组比较则B组血清作用优于A组(益肝康组:TGF-β1基因:0.356±0.032 vs 0.568±0.028;TGF-β1蛋白:0.458±0.009 vs 0.639±0.102;丹参小复方组:0.601±0.047 vs 0.810±0.051:0.612±0.126vs 0.860±0.138.P<0.05或LP<0.01).结论:益肝康及丹参小复方均可抑制HSC胶原合成,其主要机制之一是抑制TGF-β1基因和蛋白表达,益肝康更具配伍意义,肝纤维化大鼠药物血清药效优于正常大鼠血清药效.     

醛固酮对肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原合成及组织金属蛋白酶抑制因子-1 mRNA表达的作用

肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)可能在肝纤维化形成中发挥重要作用，利用醛固酮受体拮抗剂、血管紧张素Ⅱ1型(AT1)受体拮抗剂和血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)等药物阻断RAAS可以显著抑制实验性大鼠肝纤维化的形成。现在体外现察了醛固酮对肝星状细胞株HSC-T6 Ⅰ，Ⅲ型胺原合成和组织基质金属蛋白酶抑制因于-1(TIMP-1)mRNA表达的作用。     

肝复康对大鼠肝组织血小板衍生生长因子表达及对胶原合成的影响

目的探讨中药肝复康对大鼠肝组织血小板衍生生长因子(PDGF)表达的影响及其对胶原合成的调节作用。方法制备四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠模型,应用肝复康干预;测定各组大鼠血清白蛋白、球蛋白、谷丙转氨酶和谷草转氨酶的含量;采用免疫组织化学法检测肝组织PDGF表达;采用RT-PCR法测定肝组织及HSC-T6细胞Ⅰ型胶原mRNA水平的变化。结果治疗组与模型组相比,血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶和球蛋白水平均降低,白蛋白及白/球比例则升高(P<0.01);模型组肝组织PDGF的表达上调,而肝复康治疗组表达则下调(P<0.01);模型组肝组织及HSC-T6细胞Ⅰ型胶原mRNA水平较正常对照组明显上调(P<0.01),而肝复康治疗组则明显下调(P<0.01)。结论肝复康通过降低PDGF的表达,抑制Ⅰ型胶原的合成,对肝纤维化具有一定的防治作用。     

核因子-κ B p65反义寡核苷酸对大鼠肝星状细胞转化生长因子β1及细胞间黏附分子1表达的影响

目的 探讨核因子-κB p65反义寡核苷酸(NF-κB 065 ASODN)对大鼠肝星状细胞HSC炎症因子转化生长因子β 1(TGF β 1)及细胞间黏附分子1(ICAM-1)表达的影响. 方法Ⅳ型胶原酶消化密度梯度离心法分离培养大鼠HSC;人工合成NF-κB p65 ASODN并行全程硫代磷酸化修饰;观察脂质体介导的不同浓度的NF-κB p65 ASODN(0.001、0.010、0.100、1.000μmol/L)对肿瘤坏死因子(TNF)α刺激HSC产生TGF β1及ICAM-1 mRNA和蛋白质表达的影响,蛋白凝胶电脉迁移率变动分析法检测NF-κB p65 ASODN对TNF α刺激HSCNF-κB的活性影响.结果 TNF α刺激HSC后,NF-κB活性和TGF β1、ICAM-1的表达明显增强;应用NF-κB p65 ASODN(0.001～1.000 μmol/L)作用后,NF-κB活性明显减弱,且呈剂量依赖性,灰度值分别为16 070±223,15 715±199,14 999±224,14 447±228,各组比较,P值均<0.05.同时TGF β1、ICAM-1的mRNA及蛋白质表达明显减少,亦呈剂量依赖性,P值均<0.05.结论 NF-κB p65 ASODN可特异性降低HSC的NF-κB的活性,明显抑制TGF β1、ICAM-1的表达,为NF-κB p65 ASODN治疗肝纤维化提供了理论依据.     

蕲艾提取液药物血清对大鼠肝星状细胞凋亡的影响

目的：研究蕲艾提取液药物血清对大鼠肝星状细胞（HSC）凋亡的影响。方法：传代培养的HSC—T6与蕲艾提取液药物血清共同培养24小时后,采用Annexin V／PI对双染结合流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：蕲艾提取液药物血清组早期细胞凋亡率显著高于空白对照组及生理盐水血清组（P〈0．01）,并且随着血清浓度的增加,HSC—T6早期细胞凋亡率逐渐增高,呈剂量依赖关系。结论：蕲艾提取液药物血清促进HSC凋亡,这可能是蕲艾提取液药物血清抗肝纤维化作用机制之一。     

葛根素对大鼠肝星状细胞生长及NF-κB p65和TGF-β1表达的影响

目的探讨葛根素对大鼠肝星状细胞生长及核转录因子κB亚基(NF-κB)p65和转化生长因子(TGF)-β1表达的影响。方法将培养的大鼠肝星状HSC-T6细胞随机分为溶剂组和葛根素组,葛根素组包括0.1、1.0和10.0μmol/L 3个不同浓度组,溶剂组加入二甲基亚砜(DMSO)。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测各组细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞的周期分布,酶联免疫吸附(ELISA)检测细胞中TGF-β1含量,Western印迹检测细胞NF-κB p65蛋白表达。结果葛根素能够呈浓度-时间效应关系抑制HSC-T6细胞增殖,诱导细胞阻滞于G0/G1期。TGF-β1含量和NF-κB p65蛋白的表达水平均随葛根素浓度的增加而降低。结论葛根素能够抑制HSC-T6细胞生长,其作用机制可能与抑制炎症相关因子TGF-β1和NF-κB信号通路有关。