端粒酶活性的抑制对顺铂诱导HL—60细胞凋亡的影响

采用端粒酶聚合酶链反应-酶联免疫吸附测定(PCR ELISA)的方法,检测人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因反义寡脱氧核苷酸(ASODN)处理HL-60细胞前后端粒酶活性的改变,并进一步通过姬姆萨染色及流式细胞术方法,分析HL-60细胞的端粒酶活性受到抑制后顺铂对HL60细胞凋亡的影响.结果显示hTERT基因ASODN作用于HL60细胞后,端粒酶活性表现逐渐下降;hTERT ASODN与顺铂联合可诱导HL-60细胞出现一系列特征性的凋亡细胞的形态学变化;hTERT基因ASODN作用于HL-60细胞24小时再加入顺铂,用流式细胞术测定凋亡细胞的百分率明显高于正义寡核苷酸(S)DN)联合顺铂作用组和单用顺铂作用组(P＜0.01).然而,hTERT基因的ASODN下调HL-60细胞的端粒酶活性以后,再用DNR和Ara-c处理不能加速HL-60细胞的凋亡.以上的结果表明了端粒酶活性的下调可选择性促进顺铂诱导HL-60细胞凋亡.     

脂质体转染细胞周期素A反义脱氧寡核苷酸对HL-60细胞增殖及凋亡的调控作用

目的探讨脂质体转染细胞周期素A(cyclin A)反义脱氧寡核苷酸(ASON)对HL-60细胞增殖及凋亡的影响.方法采用脂质体转染技术将cyclin A ASON与HL-60细胞共同培养,用MTT法绘制细胞生长曲线,用电镜、细胞原位凋亡检测(POD)等方法观察细胞凋亡,用流式细胞术(FACS)及RT-PCR法检测cyclin A、bcl-2表达,并通过裸鼠成瘤实验验证cyclin A在白血病发生中的作用.结果脂质体转染cyclin A ASON组和cyclin A ASON组的HL-60细胞生物抑制率分别为68.9%和24.8%(P<0.01).脂质体转染cyclin A ASON组cyclin A及bcl-2表达水平(1.1%和21.9%)较对照组(38.8%和65.0%)明显减低(P值均<0.01),并能检测出DNA断裂,观察到凋亡细胞.裸鼠实验中发现脂质体转染cyclin A ASON组与对照组相比,其成瘤率低,成瘤时间延长,同一时间成瘤的瘤体体积明显缩小.结论脂质体转染cyclin A ASON能在体外及动物体内明显抑制白血病细胞的生长,且有诱导细胞凋亡的作用,可能会成为基因治疗的一个新靶点.     

重组TRAIL抑制7402肝癌细胞生长的实验研究

目的　重组TRAIL对BALB/c裸鼠肝癌细胞皮下移植模型的抑瘤作用。方法　建立裸鼠 740 2肝癌细胞皮下移植瘤模型 ,纯化后的质粒DNA与PEI混合后经肌肉注射进行基因转染 ,体内验证重组蛋白的抑瘤活性 ,采用原位缺如末端标记 (TUNEL)法 ,进行肿瘤组织凋亡检测。结果　肿瘤体积测定显示TRAIL对肝癌生长有明显抑制作用 ,凋亡检测表明实验组镜下有蓝紫色凋亡细胞。结论　荷瘤小鼠经肌肉注射TRAIL质粒DNA后 ,能引起肿瘤细胞的凋亡 ,有效抑制 740 2肝癌细胞在裸鼠体内的生长。     

细胞周期素G1反义硫代脱氧寡核苷酸抑制HL-60细胞在裸鼠体内生长的实验研究

目的：探讨细胞周期素G1(cyclin G1)反义硫代脱氧寡核苷酸对HL-60细胞在裸鼠体内生长的抑制作用。方法：将裸鼠随机分成对照组、正义寡核苷酸(SON)组、反义寡核苷酸(ASON)组，其中SON组和ASON组接种转染的HL-60细胞(HL-60／S和HL-60／AS)前接受3Gy的^60Co照射；将各组HL-60细胞接种于裸鼠皮下连续观察裸鼠的出瘤时间、瘤体大小，计算抑瘤率；病理切片用苏木精．伊红染色，电镜观察移植瘤组织的结构和细胞形态变化；用流式细胞仪(FCM)和RT-PCR分别检测cyclin G1蛋白和mRNA水平的表达；电镜和FCM检测细胞凋亡。结果:①cyclin G1 ASON组与SON组和对照组比较，对HL-60细胞在裸鼠体内生长有明显抑制作用，抑瘤率为69．4％。成瘤率、瘤重、瘤体积明显小于SON组和对照组。②镜下见cyclin G1 ASON组的HL-60细胞部分细胞形态发生改变，核分裂象少见，细胞的异型性较小，并且有凋亡细胞出现。结论:cychn G1 ASON能明显抑制HL-60细胞在裸鼠体内的生长，并且促使部分细胞发生凋亡。     

生存素反义寡核苷酸诱导HL-60细胞凋亡的作用探讨

目的:探讨特异性生存素(survivin)反义寡核苷酸(ASODN)对急性早幼粒细胞系HL-60细胞增殖、凋亡的影响。方法:人工合成survivin硫代ASODN,通过脂质体转染HL-60细胞后,采用MTT法检测细胞增殖抑制作用,倒置显微镜观察细胞形态学变化,原位末端标记(Tunel)法检测细胞凋亡指数(AI),RT-PCR半定量测定细胞中survivinmRNA的表达。结果:(1)survivinASODN各浓度组对HL-60细胞的增殖均有抑制作用,且呈时间-剂量依赖性。(2)survivinASODN处理组HL-60细胞的凋亡率与空白对照组、正义对照组和空转染组相比,差异有显著性(P<0.01)。(3)survivinASODN处理组HL-60细胞的survivinmRNA表达水平明显下调。结论:survivinASODN能明显抑制HL-60细胞中survivinmRNA的表达,诱导细胞凋亡。     

三氧化二砷对HL-60细胞和人白血病裸鼠移植瘤模型的作用

目的:探讨三氧化二砷(As2O3)对HL-60细胞增殖和凋亡的影响及其对HL-60细胞皮下移植瘤裸鼠的抗瘤作用和药物毒性。方法:不同浓度的As2O3处理HL-60细胞24h,采用MTT比色法检测细胞增殖活性,Hochest33342染色、DNA凝胶电泳、流式细胞仪检测细胞凋亡。建立皮下移植瘤裸鼠模型,随机分入对照组和As2O3组,比较两组的抑瘤作用和裸鼠一般状态的变化。结果:As2O3可有效抑制HL-60细胞增殖并诱导其凋亡,其中在5～50!mol/L浓度范围内表现出明显的剂量依赖性抑制效应。同时可显著抑制HL-60细胞皮下移植瘤的生长,并延长荷瘤裸鼠的生存时间,对裸鼠一般状况和体重无不良影响。结论:As2O3在体外和体内均可显著抑制HL-60细胞的增殖并诱导其凋亡,且无明显毒副作用。     

重组人肿瘤坏死因子-α体内外对HL-60细胞作用的研究

为了研究重组人肿瘤坏死因子-α（recombinant human tumor necrosis factor-alpha,rhTNF-α）在体外及体内对人髓系白血病细胞株HL-60细胞的作用,应用MTT法和集落形成试验测定HL-60细胞的增殖抑制,采用AO/EB荧光染色法、流式细胞术和TdT酶介导的缺口末端标记（TUNEL）法检测凋亡细胞;利用HL-60细胞裸鼠异种移植瘤模型观察给药后瘤体重量、组织病理的改变,并采用透射电镜以及TUNEL法检测瘤组织细胞的凋亡.结果表明：rhTNF-α对HL-60细胞的增殖具有明显的抑制作用,呈时间和浓度依赖性;AO/EB染色后可见rhTNF-α处理组HL-60细胞核内染色质浓缩聚集或成碎片,呈现凋亡表象;流式细胞术显示随着rhTNF-α浓度的增加,细胞凋亡阳性率逐渐增高;TUNEL法检测显示,3 200 U/ml rhTNF-α作用于HL-60细胞48小时凋亡阳性率可达37.5%.在体内,rhTNF-α可抑制HL-60细胞裸鼠异种移植瘤生长,抑制率最高可达60.33%;病理检查发现,rhTNF-α处理组的瘤组织有程度不等的出血坏死区域;透射电镜及TUNEL法检测表明,处理组的瘤组织可见有较多凋亡细胞.结论：rhTNF-α在体内、外均可抑制HL-60细胞增殖,并诱导其凋亡.     

超声微泡介导血管内皮生长因子反义寡核苷酸抑制裸鼠膀胱肿瘤

目的 探讨利用超声辐照微泡造影剂介导血管内皮生长因子(VEGF)-反义寡核苷酸(ASODN)对人膀胱癌裸鼠移植瘤的抑制效应. 方法 建立人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型后,将24只成瘤裸鼠随机分为4组:UM+ASODN组每只裸鼠尾静脉注射微泡造影剂与VEGF-ASODN混合物,并对移植瘤体用超声波进行辐照;脂质体+ASODN组每只裸鼠尾静脉注射VEGF-ASODN与脂质体混合物;UM组每只裸鼠尾静脉注射微泡造影剂并以同样的条件进行体外超声辐照;单纯对照组每只裸鼠尾静脉注射生理盐水,各组处理每隔2 d进行一次,共计5次.观察裸鼠移植瘤生长情况,免疫组化SP法测Ki67、CD34、VEGF的表达,计算微血管密度、细胞增殖指数,TUNEL法测细胞凋亡指数. 结果 UM+ASODN组裸鼠皮下肿瘤生长速度较对照组明显减慢,肿瘤组织VEGF的表达及微血管密度较对照组降低(P＜0.05);与对照组相比,UM+ASODN组肿瘤细胞的凋亡增加(P＜0.01),而细胞增殖减少(P＜0.05). 结论 超声微泡介导的VEGF-ASODN转染能有效抑制膀胱癌裸鼠皮下移植瘤.     

核干细胞因子基因沉默的HL-60细胞在裸鼠体内致瘤性变化

目的探讨核干细胞因子(NS)基因沉默的HL-60细胞在裸鼠体内致瘤性变化。方法体外合成两条短发夹状RNA(NS-shRNA),选择其中沉默NS基因作用强的一条,转染HL-60细胞后接种于裸鼠体内,另设阴性对照组和空白对照组。定期观察裸鼠成瘤情况,并取各组裸鼠的肿瘤组织进行病理切片及HE染色,免疫细胞化学染色法测定NS蛋白。结果 NS-shRNA转染HL-60细胞后接种于裸鼠体内长出肿瘤的时间长于对照组(18～19dvs.14～15d),瘤体肿块明显小于两对照组,肿瘤终体积小于两对照组[(1282.6±434.1)mm3vs.(2533.3±683.1)mm3,(2632.5±621.8)mm3],均存在统计学差异(P<0.05);阴性对照组、空白对照组两组间比较无统计学差异(P>0.05)。转染组结缔组织及血管比阴性对照、空白对照两组少,肿瘤组织中细胞排列松散,留有很多间隙;HL-60细胞大小不均一更明显,核碎裂和小核细胞增多,核染色质致密程度不均一,瘤巨细胞减少。结论 NS基因沉默的HL-60细胞的致瘤能力减弱,可能与NS基因沉默后HL-60细胞的生物学性状改变有关。     

黄芩苷对高致瘤HL-60细胞裸鼠移植瘤模型的体内抑瘤作用和机制探讨

本研究旨在探讨黄芩苷对高致瘤人白血病HL-60细胞裸鼠异种移植瘤的体内抑瘤作用及其作用机制。制备高致瘤HL-60细胞裸鼠异种移植瘤模型,将荷瘤裸鼠随机分为6组:阴性对照组(注射5%NaHCO3),黄芩苷25、50和100 mg/kg剂量组,联合用药组(黄芩苷50 mg/kg+VP16 2 mg/kg)和VP16 4 mg/kg阳性对照组,每组10只裸鼠。采用腹腔注射方式给药,14 d后每组处死5只裸鼠,对剥取的瘤块称重计算抑瘤率;通过电子显微镜观察瘤组织超微结构,病理组织学观察裸鼠各主要脏器结构改变,瘤块组织蛋白检测信号转导通路指标。观察裸鼠生存时间。结果表明,黄芩苷可抑制裸鼠HL-60细胞皮下移植瘤的生长,呈剂量依赖性。瘤组织病理组织学和透射电子显微镜检查结果显示,黄芩苷组和联合用药组的肿瘤坏死和细胞凋亡现象较阴性对照组多见。黄芩苷可能通过抑制Akt活性,下调p-Akt、mTOR和p-mTOR的表达来抑制裸鼠异种移植瘤的增长。联合用药组裸鼠中位生存时间明显长于阴性对照组(P<0.05)。结论:黄芩苷可抑制高致瘤HL-60细胞裸鼠异种移植瘤的生长,诱导瘤组织中HL-60细胞的凋亡,其机制之一可能与抑制Akt活性并下调PI3K/Akt/mTOR信号通路有关;黄芩苷与VP16联用可明显提高荷瘤裸鼠的中位生存期,具有协同抗高致瘤HL-60细胞裸鼠异种移植瘤的作用。     

hTERT反义寡核苷酸对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用

为了研究hTERT基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用,并探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT基因表达的关系,应用反义寡核苷酸封闭HL-60细胞hTERT基因的表达,RT-PCR方法检测该基因表达抑制情况,倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测细胞增殖状态,应用TRAP-ELISA、TRAP-PAGE方法检测HL-60细胞端粒酶活性。结果发现反义硫代寡核苷酸作用于HL-60细胞72小时后,hTERT基因表达明显受抑,细胞生长受抑,增殖能力减弱,其抑制作用具有序列特异性及浓度、时间依赖性。端粒酶活性检测显示反义寡核苷酸10、20和30μmol/L作用组OD450-690值分别为1.504±0.47、1.223±0.39,0.944±0.16,与未作用组(2.648±0.42)比较,差异有显著性(P<0.05);正义寡核苷酸20μmol/L作用组(OD450-690值为2.376±0·65)与未作用组比较,差异无显著性(P>0.05)。TRAP-PAGE检测表明hTERTASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少,以30μmol/L作用组条带最少。结论hTERT基因反义寡核苷酸能够通过封闭hTERT基因的表达而抑制HL-60细胞增殖,下调端粒酶活性。     

c-myc反义寡核苷酸对HL-60细胞端粒酶活性影响及诱导凋亡作用

为了研究c-myc基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞端粒酶活性的影响及其诱导凋亡作用,探讨HL-60细胞端粒酶活性与c-myc基因表达的关系,应用反义寡核苷酸封闭HL-60细胞c-myc基因的表达,RT-PCR方法检测该基因表达抑制情况,采用流式细胞术进行细胞凋亡检测及细胞周期分析,琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA断裂情况,应用TRAP-ELISA法测定HL-60细胞端粒酶的活性。结果表明:反义硫代寡核苷酸作用于HL-60细胞72小时后,c-myc基因表达明显受抑;S期细胞百分数由55.6%降至30%,并出现早期凋亡峰(凋亡细胞比例占25.2%);琼脂糖凝胶电泳显示DNA凋亡梯形带;端粒酶活性检测发现反义寡核苷酸3,4,5μmol/L作用组OD450-690分别为1.952±0.14,1.805±0.40,1.616±0.41,与未作用组(OD450-690为2.648±0.42)比较,差异有显著性(P<0.05);反义寡核苷酸1和2μmol/L作用组及正义寡核苷酸5μmol/L作用组OD450-690分别为2.324±0.36,2.162±0.38,2.466±0.29,与未作用组比较,差异无显著性(P>0.05)。结论:c-myc基因反义寡核苷酸能够通过封闭c-myc基因的表达而诱导HL-60细胞凋亡,阻止细胞由G1期进入S期,并具有下调端粒酶活性作用。     

柔红霉素、阿糖胞苷作用于NB4细胞的体外实验研究

目的探讨柔红霉素（DNR）联合阿糖胞苷（Ara-C）和单用DNR对急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞株NB4与另一急性髓系白血病（M2）细胞株HL-60生长抑制率、凋亡率的比较。方法用MTT法和流式细胞术分别检测NB4与HL-60细胞的生长抑制率和细胞凋亡率；采用瑞特染色法观察细胞形态。结果两组药物（DNR单药组和双药组）对NB4细胞的生长抑制率[单药组为（35．73±6.82）％，双药组为（36.75±3．82）％]、凋亡率[单药组为（22.55±3．62）％，双药组为（21.24±5．82）％]差异均无统计学意义（P〉0．05）；而对HL-60细胞的抑制率[单药组为（62．31±1.80）％，双药组为（67．17±2.07）％]、凋亡率[单药组为（41.51±0.89）％，双药组为（48.05±0．92）％]的差异均有统计学意义（P值分别〈0.01和〈0．05）；形态学检测显示，各组细胞形态学上均出现凋亡特征性改变。结论从细胞水平说明，DNR联合Ara—C与单用DNR对APL的疗效差异无统计学意义，且后者的临床不良反应明显轻于前者，因此支持单用DNR的治疗方案。     

转染反义VEGF cDNA抑制K562细胞裸鼠体内生长和肿瘤内血管生成

目的　探讨转染反义血管内皮细胞生长因子 (VEGF)cDNA对慢性髓系白血病 (CML)急变细胞株K5 6 2裸鼠体内生长的影响。方法　利用转染反义 (AS)、正义 (S)VEGF1 2 1 cDNA及空载体 (V ,pcDNA3质粒 )的K5 6 2细胞株 ,观察转染细胞在裸鼠体内成瘤及生长情况 ;免疫组化法比较其裸鼠移植瘤微血管密度 (MVD) ;MTT法观察其对骨髓内皮细胞体外增殖的影响。结果　转染反义VEGF1 2 1 cDNA的K5 6 2 AS细胞组的瘤块体积小、生长慢于K5 6 2 V组 [(2 0 7.5± 192 .9)mm3 vs (4 45 .0± 15 0 .9)mm3 ,P <0 0 5 ],而K5 6 2 S组瘤块体积大于K5 6 2 V组 [(1174.6± 5 0 8.7)mm3 vs (4 45 .0± 15 0 .9)mm3 ,P <0 .0 1]。K5 6 2 AS组裸鼠体内肿瘤MVD低于K5 6 2 V组 [(11.0± 7.6 ) 0 .72mm2 vs (18.9± 7.0 ) 0 .72mm2 ,P <0 0 5 ],而K5 6 2 S组则高于K5 6 2 V组 [(5 0 .8± 11.7) 0 .72mm2 vs (18.9± 7.0 ) 0 .72mm2 ,P <0 .0 1]。K5 6 2 AS细胞的培养上清刺激骨髓内皮细胞增殖能力弱于K5 6 2 V ,而K5 6 2 S细胞的结果相反。结论　转染反义VEGF1 2 1 cDNA抑制K5 6 2细胞裸鼠体内肿瘤生长 ,降低裸鼠瘤块内MVD ,对骨髓内皮细胞的刺激增殖作用减弱     

Rac1在HL-60细胞中的表达及其对细胞周期和凋亡的影响

本研究旨在观察Rac1在急性白血病细胞系HL-60中mRNA的表达水平及其对细胞周期和凋亡的影响。采用半定量RT-PCR方法检测HL-60细胞及正常人外周血单个核细胞(PBMNC)中Rac1mRNA表达水平;用脂质体FuGENE6法将Rac1特异性反义寡核苷酸(ASODN)转入HL-60细胞,应用MTT试验检测细胞存活率;采用流式细胞术(FCM)检测细胞周期变化、Wright-Giemsa、吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)及AnnexinⅤ-FITC/PI染色检测凋亡细胞。结果表明:Rac1在HL-60细胞系中相对含量(Rac1/GAPDH)为0.84±0.13,在正常PBMNC中相对含量为0.26±0.1(P<0.01),Rac1在HL-60细胞中的表达明显高于PBMNC。与正义链(SODN)组相比,经2.0g/L Rac1特异性ASODN作用48小时后,HL-60细胞存活率降低[(73.7±5.0)%vs(93.2±3.0)%,P<0.01],G1期细胞百分数升高[(52.1±6.8)%vs(31.6±4.7)%,(P<0.05)],AnnexinⅤ阳性率升高[(19.2±2.1)%vs(4.1±1.7)%,(P<0.01)],凋亡小体明显增加。结论:白血病细胞系HL-60中高表达的Rac1可能促进白血病细胞HL-60的过度增殖并抑制其凋亡。     

聚酰胺-胺型树枝状高聚合物介导Survivin反义寡核苷酸抑制人肝癌裸鼠移植瘤生长的作用

背景：采用反义寡核苷酸等治疗方法可以抑制凋亡抑制因子Survivin的表达,从而诱导肿瘤细胞凋亡。目前使用Survivin治疗恶性肿瘤仍存在基因载体转染效率低下、不能长期稳定表达、易被酶降解等难题。目的：观察聚酰胺-胺型树枝状高聚合物（polyamidoamine,PAMAM）脂质体介导Survivin-反义寡核苷酸对人肝癌裸鼠移植瘤的抑制作用。方法：以人肝癌细胞SMMC-7721裸鼠皮下注射建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,将PAMAM脂质体和PAMAM分别与Survivin-反义寡核苷酸混合得到载反义基因转染复合物。测定复合物的zeta电位及包封率。将两种载基因复合物注射道裸鼠移植瘤体内,观察两组移植瘤大小,检测移植瘤组织中survivin基因的表达。结果与结论：PAMAM脂质体-survivin-反义寡核苷酸复合物的zeta电位高于PAMAM-survivin-反义寡核苷酸复合物（P〈0.05）,基因包封率两组比较差异无显著性意义（P〉0.05）。PAMAM脂质体-survivin-反义寡核苷酸复合物治疗组裸鼠移植瘤质量及survivin蛋白表达低于PAMAM-survivin-反义寡核苷酸复合物组（P〈0.05）。提示PAMAM脂质体能将Survivin-反义寡核苷酸高效递送到人肝癌移植瘤细胞,降低survivin蛋白的表达,诱导移植瘤细胞凋亡。