小发夹RNA体外抑制乙型肝炎病毒X蛋白表达的实验研究

目的构建靶向乙型肝炎病毒X基因（HBX）的shRNA表达载体pSilencer3．1-shHBX,观察其体外抑制HBX在HepG2细胞中表达的作用,为应用RNA干扰技术进一步研究HBX基因的功能奠定基础。方法设计并构建靶向HBx的shRNA表达载体pSilencer3．1-shHBX,脂质体转染法将HBX表达载体pcDNA3．1-HBx与pSilencer3．1-shHBX共转染人肝癌HepG2细胞,培养72h后以RT-PCR检测HBX基因表达情况,以Western blot检测HBX蛋白的表达量。结果经酶切和测序鉴定,构建的重组质粒pSilencer3．1-shHBX与设计一致。该质粒使HBX基因mRNA表达量降低47．1％,使HBx蛋白表达量降低58．9％,而阴性对照质粒无此作用。结论成功构建靶向HBXshRNA表达载体pSilencer3．1-shHBX,该质粒可体外抑制HBX在HepG2细胞中的表达。     

RNA干扰靶向白血病融合基因的研究

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是新近发展起来的一种静止基因表达的有效方法,是由双链RNA分子介导的特异性靶基因转录后基因沉默过程.1998年由Fire等[1]在对线虫的研究中首先提出,2001年Elbashir等[2]报道RNAi同样存在于哺乳动物细胞,这一突破性的进展使RNAi技术在哺乳动物细胞中的探索与应用逐渐成为研究热点.     

5种多房棘球绦虫续绦期幼虫的制备RNA方法比较及长片段DNART-PCR扩增方法研究

目的探讨从多房棘球绦虫续绦期幼虫制备RNA的最佳方法,研究逆转录PCR扩增DNA长片段目的基因的方法。方法应用改良的琼脂糖核酸电泳方法和RT-PCR技术比较观察了5种商品化RNA/mRNA提取试剂/试剂盒用于提取多房棘球绦虫续绦期幼虫RNA的效果;用琼脂糖凝胶电泳方法观察比较了不同的DNA聚合酶用于RT-PCR扩增长片段EMⅡ/3(1.72kb)和EM10(1.76kb)的效果。结果总RNA提取试剂盒(RNeasyTotalRNAKit)提取的多房棘球绦虫续绦期幼虫RNA电泳显示出清晰的28S、18SrRNA条带和弥散于0.8kb至20kb之间未降解的mRNA,是唯一能逆转录扩增出单一目的条带的核酸提取物。TaqDNA聚合酶与高保真DNA聚合酶Pfu的混合制剂TaqPlus应用于RT-PCR可扩增出大量1720bp和1760bp单一目的基因。结论总RNA提取试剂盒(RNeasyTotalRNAKit)对多房棘球绦虫续绦期幼虫RNA的提取效果最好;TaqPlus适合用于RT-PCR扩增长片段目的基因。     

caspase-8靶向小发夹RNA抑制肝细胞凋亡的研究

目的研究针对caspase-8 mRNA的小发夹RNA(shRNA)真核表达载体对肝Hepa1-6细胞凋亡的干扰作用。方法TNF-α诱导Hepa1-6细胞凋亡,脂质体法将shRNA表达载体转染入Hepa1-6细胞中,24h后应用荧光实时定量PCR和Western blot法分别在mRNA和蛋白水平测定其caspase-8表达差异,流式细胞仪观察细胞凋亡的变化。结果TNF-α作用后Hepa1-6细胞caspase-8 mRNA由(0.050±0.006)升高至(0.286±0.063)(P<0.01),而shRNA表达载体Pgenesil-casp8使其下降至(0.098±0.037)(P<0.01)。转染Pgenesil-casp8重组质粒后caspase-8蛋白表达与mRNA荧光实时定量PCR结果吻合。TNF-α诱导Hepa1-6细胞凋亡率由(4.70±0.89)%升高至(17.40±2.21)%(P<0.01),Pgenesil-casp8作用后下降至(1.20±0.32)%(P<0.05)。结论针对caspase-8 mRNA的shRNA真核表达载体可有效抑制肝细胞Hepa1-6凋亡。     

Polo样激酶1小片段干扰RNA对肝癌细胞株HepG2的影响

目的: 联合RNA干扰技术探讨Polo样激酶1(PLK1)在肝癌的发生发展中的作用及对临床治疗的指导作用.方法: 化学合成针对P L K1的小片段干扰RNA(PLK1-s iRNA), 转染至肝癌细胞株HepG2中, 利用实时定量PCR、台盼蓝活性细胞计数和流式细胞术对PLK1的基因表达、细胞增殖、细胞周期和凋亡的检测.结果: 转染PLK1-siRNA后, 肝癌细胞中PLK1mRNA表达明显下降(P<0.01), 表达量相当于空白组的49.7%±3.6%;细胞增殖活性从转染24 h后明显下降;细胞分裂周期发生变化, S期比例下降, 阻滞在G2/M期的细胞比例上升, 于48、72 h阻滞在G2/M期的细胞比例和细胞凋亡率与空白组相比均有显著增加(均P<0.05).结论: PLK1在肝癌的发生发展中起着重要作用, 其siRNA能特异性抑制肝癌细胞中PLK1基因的表达, 抑制细胞增殖, 促进细胞凋亡, 针对PLK1基因的RNA干扰有望用于肿瘤的基因治疗.     

针对HBV—P基因的RNA干扰抑制乙型肝炎病毒的研究

目的构建针对乙型肝炎病毒P基因编码区、能在体内转录产生发夹状小干扰RNA（siRNA）的表达载体psiHBV／p,观察RNA干扰对HBsAg、HBeAg及乙型肝炎病毒DNA复制的抑制作用。方法针对HBV—P基因区特异序列,构建siRNA的表达载体psiHBV／p。采用脂质体介导方法将其与1．3倍HBV真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞。分别于转染后24小时、48小时、72小时用ELISA法对HepG2细胞培养上清液进行HBsAg、HBeAg的检测;于转染后72小时通过FQ-PCR法分析RNA干扰作用对HBVDNA的抑制效果。结果成功构建了针对HBV—P基因区的siRNA的真核表达重组体psiHBV／p,并发现它能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌,转染后第二天抑制率达高峰,分别为84％、65％。FQ—PCR结果也证实了转染72小时后,随psiHBV／p比例的升高,其对HBV DNA的抑制作用也随之增加。结论成功构建的psiHBV／p,它能在体内持续转录产生针对P基因转录体的发夹状siRNA;在细胞水平上,体内转录产生的、针对乙型肝炎病毒P基因区特异序列的siRNA对共转染的重组载体pHBV1．3有显著和特异的抑制作用。     

靶向S区和C区基因的M1GS RNA核酶共同抑制HBV的表达

目的:研究靶向HBVS区和C区基因的M1GSRNA核酶共同作用对HBV基因表达的影响.方法:选择HBVayw亚型S区基因294nt和C区基因2333nt为切割位点,以含有编码M1RNA的DNA序列的质粒pTK117为模板,通过PCR扩增得到M1GSRNA核酶的DNA模板,并将其克隆至真核表达载体pEGFP-C1得到重组质粒pEGFP-GSS和pEGFP-GSC.将2个重组质粒共转染HepG2.2.15细胞,转染后ELISA法测细胞培养液中的HBsAg和HBeAg,RT-PCR检测HBVmRNA.结果:成功构建了分别靶向HBVS区基因和C区基因的真核表达载体.共转染HepG2.2.15细胞后,HBsAg和HBeAg的表达分别被抑制了33.2%和39.1%,HBVCmRNA和SmRNA分别被抑制了32.5%和29.7%,而HepG2.2.15细胞的增殖无明显变化.结论:靶向HBVS区和C区基因的M1GSRNA核酶共同作用可特异性抑制HBVS区和C区基因的表达.     

云南省间日疟原虫SSUrRNA基因片段的体外扩增、克隆及序列分析

根据已知间日疟原虫、其它相关原虫及人小亚单位核糖体核糖核酸(SSUrRNA)基因序列,借助计算机程序分析,设计一对寡聚核苷酸引物。采用聚合酶链式反应(PCR)技术,从云南省两例间日疟患者血样DNA抽提物中,均扩增出长约641个碱基对(bp)的SSUrRNA基因特定片段;双脱氧链末端终止法测序结果表明,两份样本扩增片段DNA序列完全相同,但与背景序列比较,在第269位出现碱基置换由G变为A,而在第630位则缺失一碱基C,从而导致该两处限制性内切酶位点的改变。     

套式PCR扩增特定SSUrDNA片段诊断恶性疟的研究

设计2对针对恶性疟原虫（P．f.）小亚单位核糖体核糖核酸基因（SSUrDNA）的特异引物，采用双温度点套式聚合酶链式反应（PCR）技术，从用煮沸法快速萃取的样本DNA中，扩增P．f.SSUrDNA片段，进行恶性疟原虫的检测。结果表明，该系统扩增样本DNA片段大小恒定，经限制性酶切进一步分析，证实均为P．f.SSUrDNA目的片段，其检测原虫的灵敏度为0．8×10-6，较常规镜检敏感，并具有鉴别红内期早期阶段疟原虫种类和确认有无混合感染的潜力。因而认为该系统是灵敏、准确、简易、快速的疟疾诊断新方法，值得推广使用。     

PCR法检测16S rRNA基因在败血症诊断中的价值

目的评价外周血细菌16S rRNA基因检测诊断败血症的敏感性及特异性。方法利用通用引物对6种常见细菌16S rRNA基因进行扩增,通过阳性菌株及阴性对照检测引物的特异性;观察不同退火温度及不同细菌浓度下PCR检测效果;检测败血症患者及正常人血液标本中的16S rRNA基因表达,并与血培养结果进行比较,评价其诊断意义。结果6种阳性菌株均出现特异阳性条带,阴性质控未出现阳性条带;不同退火温度对PCR结果无明显影响,以55、58℃最佳;PCR方法的最低细菌检测浓度为1．5×10^3cfu／ml;观察组血培养阳性率为38．3％（23／60）,血液16S rRNA基因阳性表达率为86．6％（52／60）,P〈0．01。结论PCR法检测16S rRNA基因用于败血症诊断特异性及敏感性强,但应注意规范操作、避免污染。     

PCR扩增日本血吸虫Sj26、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因的诊断作用

目的 探讨PCR扩增日本血吸虫Sj26、Sj32和Sj14-3-3抗原编码基因的诊断价值.方法 从40例慢性日本血吸虫病患者血清中提取13本血吸虫DNA,用PCR扩增Si26、Sj32和sjl4-3-3抗原编码基因.1.2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,同时以21例华支睾吸虫病、13例卫氏并殖吸虫病患者血清和43例健康人血清作对照.结果 从慢性日本血吸虫病患者血清中可扩增出长度为399 bp的Sil4-3_3抗原编码基因片段,但未扩增出长度为676 bp的Si26和1270 bp的Sj32抗原编码基因片段.对照组均呈阴性反应.结论 PCR扩增Sjl4-3-3抗原编码基因可用于慢性日本血吸虫病的基因诊断.

Abstract：

Objective To investigate the diagnostic value of coding gene of Sj26, Sj32 and Sj14-3-3 amplified by PCR for chronic Schistosomiasis japonica. Methods The DNA was extracted from sera of 40 patients with chronic Schistosomiasis japonica, the coding gene of Sj26, Sj32 and Sj14-3-3 was amplified by PCR and identified by 1.2% agarose gel electrophoresis. DNA from the sera of 21 patients with Clonorchiasis sinensis, 13 patients with Parogonimiasis westermani and 43 healthy donors was taken as control. Results A total of 399 bp coding gene of Sj14-3-3 was amplified successfully from sera of the patients with chronic Schistosomiasis japonica,but Sj26(676 bp) and Sj32( 1270 bp) coding gene were not obtained. Control groups were all negative. Conclusions Sj14-3-3 coding gene amplified by PCR can be used for genetic diagnosis of chronic schistosomiasis.     

Inhibition of hepatitis B virus surface antigen expression by small hairpin RNA in vitro

AIM: To explore the anti-hepatitis B virus effect of RNA interference (RNAi) using small hairpin RNA (shRNA) expression vector. METHODS: Hepatitis B virus surface antigen green fluorescent protein (HBs-GFP) fusion vector and shRNA expression vectors were constructed and cotransfected transiently into HepG2 cells. mRNAs extracted from HepG2 cells were detected by real-time PCR. Fluorescence of HBs-GFP protein was detected by fluorescence-activated cell sorting (FACS). The effective shRNA expression vector was transfected into HepG2.2.15 cells. HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cells were analyzed by radioimmunoassay (RIA) method. RESULTS: FACS revealed that shRNA targeting at HBsAg reduced the GFP signal by 56% compared to the control. Real-time PCR showed that HBs-GFP mRNA extracted from HepG2 cells cotransfected with pAVU6+27 and HBs-GFP expression plasmids decreased by 90% compared to the empty vector control. The expressions of HBsAg and HBeAg were also inhibited by 43% and 64%, respectively. CONCLUSION: RNAi using shRNA expression vector can inhibit the expression of HBsAg, providing a fresh approach to screening the efficient small interfering RNAs (siRNAs).     

短发夹状双链RNA抑制丙型肝炎病毒IRES介导的基因表达

目的研究载体表达的短发夹状双链RNA（shRNA）对丙型肝炎病毒（HCV）IRES介导的基因表达的特异性抑制作用。方法构建HCV IRES调控的绿色荧光蛋白表达载体（pIRES—GFP）和虫荧光索酶表达载体（p5′ UTR—Luc），以及针对HCV IRES的shRNA表达载体（pshRNA-HCV）。共转染HepG2细胞，于转染后24、48、72h观察绿色荧光的强弱，用Western blot检测绿色荧光蛋白的表达，半定量逆转录聚合酶链反应法检测GFP的mRNA水平。双荧光索酶系统检测虫荧光索酶活性。结果pshRNA-HCV作用组绿色荧光强度明显弱于未干扰组，GFP蛋白表达量及虫荧光素酶活性降低60％～70％，半定量逆转录聚合酶链反应显示pshRNA-HCV导致了GFP基因mRNA水平的降低。结论针对HCV IRES的shRNA能够显著和特异地抑制该区域调控的蛋白表达水平及mRNA水平，该研究结果为利用RNA干扰技术治疗HCV感染进行了初步探索。     

RNA干扰技术及其在胃癌基因治疗中的应用进展

RNA干扰(RNAi)是指生物体内由双链RNA(dsRNA)介导同源mRNA的特异性降解,从而导致基因沉默的现象。目前,随着RNA干扰分子机制研究的不断深入,RNAi技术已广泛用于各种肿瘤的研究,尤其在胃癌治疗中的研究取得了重要进展,具有潜在、广阔的应用前景。     

应用干扰RNA体外抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒N基因的表达

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒N蛋白的融合表达载体pEGFP-C1-N以及针对SARS冠状病毒N基因的小发卡型shRNA表达载体pshRNAN，观察shRNA对SARS冠状病毒N基因复制和表达的影响。方法将构建成功的pEGFP-C1-N与psh RNA-N共转染293细胞，于转染后24、48、72h观察GFP表达的强弱，采用Western Blot分别检测GFP与N蛋白的表达，逆转录PCR检测N基因的mRNA。结果pshRNA—N作用组绿色荧光强度明显弱于未干扰组，Western Blot和逆转录PCR结果也证实pshRNA—N对N基因和N蛋白的表达有明显抑制作用，而无关序列的shRNA无此作用。结论针对SARS冠状病毒N基因的shRNA具有显著和特异的抑制N蛋白表达的作用。     

RNA干扰在肺癌基因治疗中的应用进展

RNA干扰是近几年在基因表达调控领域的重大发现,是一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段.目前在全球.肺癌发病率呈逐年上升趋势,近10余年来已成为癌症死亡原因之首.肺癌的治疗方法中,靶向基因治疗成为研究热点.RNA干扰作为基因治疗的强大工具,可通过有效沉默原癌基因、细胞凋亡相关基因、细胞周期相关基因、生长因子以及耐药基因等,达到抑制肺癌细胞生长、诱导肺癌细胞凋亡、增强其对化疗或放疗的敏感性的目的 .RNA干扰已经广泛应用于肺癌的基因治疗,发挥其明显的抗癌作用.     

RNA干扰在胃癌基因治疗研究中的应用

RNA干扰(RNAi)能够特异而有效地阻断靶基因的表达,目前已广泛应用于生物体基因表达、调控与功能等的研究中。在胃癌方面,针对幽门螺杆菌感染与胃癌发病、胃癌化疗多药耐药、胃癌相关基因及治疗等都有许多积极的研究探索。本文在简述RNAi的基础上,综述其在胃癌基因治疗方面的研究和应用新进展。     

RNA干扰技术在胰腺癌基因治疗中的应用

RNA干扰(RNAi)是双链RNA(dsRNA)介导的、由特异性引起的转录后基因沉默现象. RNA干扰技术作为基因沉默的有效手段,在肿瘤治疗方面显示出良好的前景.现就RNA干扰的机制、双链RNA的设计、小干扰RNA(siRNA)的制备方法和RNA干扰技术在胰腺癌治疗研究中的应用进展作一综述.     

RNAi及其在肝癌治疗中的作用

RNA干扰(RNAi)是指生物体内利用双链RNA诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,导致转录后基因沉默的现象.近年来,RNA干扰技术在医学研究中的广泛应用取得显著的基因沉默效果,RNAi以其高特异性、高效性等显著优势将成为研究基因功能的新手段.此文综述该技术的发现、定义、机制、特征等及其在肝癌治疗中的应用.