应用PCR技术快速鉴定结核分枝杆菌复合群菌种

目的 建立快速鉴定结核分枝杆菌复合群菌种的方法.方法 将7对结核分枝杆菌复合群各菌种特异性引物(Mtbc1-7)进行聚合酶链反应(PCR)扩增,通过对扩增产物的不同系带型进行分析,对已知标准株和96株临床分离株进行菌种鉴定.结果 用3株结核分枝杆菌复合群(MTBC)标准株,9株非分枝杆菌标准株以及27株非结核分枝杆菌的分枝杆菌(MOTT)对7对结核分枝杆菌复合群各菌种特异性引物进行特异性鉴定,结果证明引物Mtbc1能鉴定出分枝杆菌和非分枝杆菌;引物Mtbc2能鉴定出MOTT和MTBC;引物Mtbc3能鉴定出田鼠分枝杆菌;引物Mtbc4能从MTBC中识别出牛分枝杆菌和卡介苗;引物Mtbc5能鉴定出非洲分枝杆菌Ⅱ型和结核分枝杆菌;引物Mtbc6和引物Mtbc4结合能鉴定出卡介苗;引物Mtbc7和引物Mtbc5联合能鉴定出canettii分枝杆菌.96株临床分离株经7对引物扩增,扩增结果显示MOTT 20株,牛分枝杆菌1株,卡介苗1株,canettii分枝杆菌3株,田鼠分枝杆菌3株,非洲分枝杆菌Ⅰ型3株,caprae分枝杆菌1株,结核分枝杆菌或非洲分枝杆菌Ⅱ型64株.结论 应用PCR技术鉴定结核分枝杆菌复合群菌种结果准确可靠,且具有简便和快速等优点,有较大的分子流行病学应用价值.     

PCR方法鉴定结核分枝杆菌临床分离株

目的:用3对引物PCR扩增的方法对结核分枝杆菌临床分离株进行菌种鉴定.方法:将3对特征性的结核分枝杆菌标记基因:MPT40基因、α抗原基因和IS6100插入序列,分别放入PCR体系中,在各自的退火温度下进行PCR扩增,通过对扩增产物的不同带型进行分析,对结核分枝杆菌临床分离株进行菌种鉴定.结果:用3对引物PCR扩增的方法可将各种类型的结核分枝杆菌以及结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌鉴别开.结论:3对引物PCR扩增的方法是一种有效的结核分枝杆菌菌种鉴定的方法,可用于结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌以及各种类型的结核分枝杆菌的区分.     

基因芯片快速鉴定分枝杆菌菌种方法的建立

目的：利用基因芯片技术,建立一种能快速、准确鉴定分枝杆菌菌种的方法,并验证其临床应用价值。方法根据23种分枝杆菌基因序列设计特异性探针并制作基因芯片,通过PCR‐反向点杂交鉴定23种分枝杆菌标准菌株、9种非分枝杆菌和103株分枝杆菌临床分离株的菌种。结果应用基因芯片技术检测23种分枝杆菌标准菌株和9种非分枝杆菌菌株,特异性为100％。103株临床分离株经鉴定87株为结核杆菌复合群（MTC）;16株为非结核分枝杆菌（NTM）,其中脓肿分枝杆菌5株、胞内分枝杆菌3株、鸟分枝杆菌3株、偶发分枝杆菌2株,以及堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、戈登分枝杆菌各1株。103株临床分离株鉴定结果与测序法完全一致,该方法最低检出限为103copy／mL。结论采用基因芯片技术能快速鉴定分枝杆菌菌种,并区分MTC和NTM,具有简便快速及准确性、特异性、灵敏度高的优点。     

PCR反向膜杂交技术检测临床标本中结核分枝杆菌

目的 探讨结核分枝杆菌（TB）PCR反向膜杂交技术的临床应用价值。方法 采用该技术对本院300例确诊结核的或高度怀疑为结核分枝杆菌感染的病人标本、60例非结核住院病人标本进行检测,同时用培养镜检法、常规PCR法作对照试验。结果 PCR反向膜杂交法检出TB菌176例、阳性率（58．7％）,比培养镜检法47例（15．7％）、常规PCR法156例（52．0％）检出率高,而对60例证实无结核分枝杆菌的标本、几种方法检测均为阴性。结论 该技术能快速、敏感和高度特异地检测临床标本中的TB菌。     

反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌3种耐药相关基因

目的:观察膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌(MTB)对异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)耐药性的效果.方法:用ropB、katG、inhA、rpsL基因的寡核苷酸探针与结核分枝杆菌PCR产物进行反向斑点杂交,并将结果与绝对浓度法药敏试验结果进行比较.结果:INH、RFP和SM的耐药基因检测灵敏度分...     

PCR-反向斑点杂交法检测HBV YMDD模序混合感染

目的为HBV感染临床个体化治疗、指导临床用药寻找一种能更好地检测HBV YMDD模序混合感染的方法。方法28份已知乙肝病人血清,其中10份为HBV YMDD模序感染,5份为HBV YIDD模序感染,5份为HBV YVDD模序感染,2份为HBV YMDD和YIDD模序混合感染,2份为HBV YMDD和YVDD模序混合感染,2份为HBV YIDD和YVDD模序混合感染,2份为HBV YMDD、YIDD和YVDD模序混合感染,都用PCR产物直接测序和PCR-流过式反向斑点杂交(Flowthrough-RDB)方法检测。结果HBV YMDD模序单一感染标本用两种方法检测准确性都达到100%,对混合感染标本PCR-流过式反向斑点杂交方法检测准确性也可达100%,然而用PCR产物直接测序方法只能检测其中一种或两种型别。结论PCR-流过式反向斑点杂交方法是一种敏感、特异和快速的检测HBV YMDD野生型及其突变型模序单一感染和混合感染的有效方法,比PCR产物直接测序更优越,更有利于实现临床个体化治疗和指导临床用药。     

应用聚合酶链反应斑点杂交法检测结核杆菌

实验室诊断结核杆菌主要依靠涂片法和分离培养法。我院虽然采用集菌涂片法,但检出率仍然不高,而分离培养所需时间又太长,近年来应用ＰＣＲ技术直接测定结核杆菌的ＤＮＡ［１～３］,不失为一种理想的方法。我们通过应用ＰＣＲ斑点杂交法对１３７份样本进行了检测,并同时用集菌涂片和分离培养法进行比较,以了解ＰＣＲ斑点杂交法的诊断价值。１．材料:１３７份痰液标本由我院肺科和杭州市结核病防治所提供。其中８３份来自肺结核患者(根据病史、临床表现、胸部Ｘ线检查诊断为肺结核),５４份来自非结核病患者。结核杆菌引物及探针均由上海复星实…     

重庆市流行非结核分枝杆菌菌种鉴定及感染人群特征

目的 了解重庆地区非结核分枝杆菌（NTM）流行的优势菌种和NTM感染人群的特征。方法 回顾分析2016年7月—2017年12月在重庆市公共卫生医疗救治中心就诊,并经分枝杆菌菌种PCR-反向点杂交法鉴定为NTM和NTM混合感染的患者资料。结果 95例NTM感染病例,单一NTM感染共 80例,其中快生长分枝杆菌（RGM）2种,脓肿分枝杆菌31例（38.75%）,偶发/猪分枝杆菌14例（17.50%）;慢生长分枝杆菌（SGM）5种,胞内分枝杆菌25例（31.25%）,鸟分枝杆菌5例（6.25%）,戈登分枝杆菌3例（3.75%）,堪萨斯分枝杆菌2例（2.50%）;分枝杆菌混合感染共15例,其中TB和NTM 混合感染11例, NTM混合感染4例。单一NTM感染病例中,男性多于女性,胞内分枝杆菌感染者男性比例最高。而NTM混合感染者中,性别比例均接近1∶1。单一NTM感染者主要集中于20~<30岁和40~<60岁之间,而TB和NTM混合感染者在30~<50岁之间最多。脓肿分枝杆菌感染者主要在20~59岁之间,胞内分枝杆菌感染者主要分布于40~<79岁之间,偶发/猪分枝杆菌的患者集中于60岁以下。结论 重庆市NTM的主要流行优势种类以脓肿分枝杆菌和胞内分枝杆菌为主,感染者男性多于女性,以20~<30岁和40~<60岁之间最多,对于不同种类的NTM,感染者的年龄分布和性别比例有所不同。     

斑点杂交法检测SEN病毒感染

目的:探讨斑点杂交法检测SEN病毒(SENV)感染的应用价值.方法:应用地高辛标记、制备SENV部分基因探针并用斑点杂交技术检测SENV DNA,与聚合酶链反应(PCR)检测结果相比较. 结果: 在191份血清中,采用斑点杂交法检出6份阳性,检出率为3.1%. PCR方法检测出11份阳性,阳性率5.8%. 结论: 制备的地高辛探针具有SENV特异性,以地高辛标记的SENV探针可用于检测SENV感染.     

传统培养法和PCR法在分枝杆菌菌种鉴定中的对比研究

目的:对结核分枝杆菌复合群菌种鉴定的传统方法与PCR法进行对比研究,为临床应用提供科学依据。方法:将临床确诊结核病患者的317份痰标本做罗氏培养,分别用传统培养法和PCR法进行鉴别菌种,随机抽出一部分进行测序(金标准),用金标进一步鉴定两种结果的可靠性。结果:传统培养法敏感度、特异度、符合率分别为55.68%、58.33%、54.00%,而PCR法检测的敏感度、特异度、符合率分别为98.86%、50.00%、93.00%,明显优于传统培养法,两者检测的总符合率为53.00%,检测结果间差异有显著性(x~2=918.64,P=0.00)。结论:传统培养法检测分支杆菌菌种的结果不符合临床检验要求,且所需时间长,而PCR法方便、快速,可以较准确地确定分支杆菌菌种。     

用点杂交法检测人促红细胞生成素(hEPO)的整合

目的为制作生产人促红细胞生成素的转基因鸡，把人促红细胞生成素（hEPO）基因以质粒介导用脂质体法导入鸡胚内，然后检测人促红细胞生成素基因的整合。方法以PCR方法进行筛选后，再用点杂交法进行鉴定。即把人促红细胞生成素基因PCR扩增阳性产物用地高辛标记，作为探针和鸡整个基因组进行点杂交。结果点杂交阳性结果有4个。结论得到了整合人促红细胞生成素基因的鸡胎。     

PCR结合反向斑点杂交在侵袭性肺曲霉病早期诊断中的价值

目的评价和比较血清半乳甘露聚糖(GM)浓度测定和PCR结合反向斑点杂交实验在侵袭性肺曲霉病(IPA)早期诊断中的临床价值。方法用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中GM的浓度;PCR结合反向斑点杂交法检测各组小鼠血清、肺泡灌洗液、肺组织中的曲霉菌DNA。结果 ELISA法测定GM浓度中,实验组血清、BALF的GM实验敏感性、特异性与对照组间差异有统计学意义(P0.05);反向斑点杂交检测血清、肺泡灌洗液、肺组织中曲霉菌DNA含量,实验组阳性率明显高于对照组(P0.05)。用血清标本的反向斑点杂交实验与GM实验、组织病理阳性率进行比较,组织病理的阳性率最高,其次是反向斑点杂交。三种方法的差别均有统计学意义(P0.05)。结论 GM-ELI-SA检测是一项较灵敏、快速的诊断方法,反向斑点杂交实验在IPA早期诊断上的作用优于GM实验。     

反向点杂交法监测β-地中海贫血异基因造血干细胞移植后植入状态

目的初步评价反向点杂交技术在β-地中海贫血异基因造血干细胞移植后植入状态监测中的应用价值。方法用反向点杂交技术检测异基因造血干细胞移植后的β-地中海贫血基因状态,分析植入情况和嵌合状态,并与多重荧光标记短串联重复序列扩增技术的检测结果进行比较。结果与多重荧光标记STR-PCR技术相比,反向点杂交技术的检测灵敏度较高,可以检测到受者比例仅为1.56%的微嵌合状态。结论反向点杂交技术灵敏、快速、价廉,适用于β-地中海贫血异基因造血干细胞移植后植入状态的长期动态监测。     

聚合酶链反应-反向线点杂交技术鉴定分枝杆菌的多中心评价

目的 评价以16S-23S rDNA间隔序列作为靶基因的聚合酶链反应-反向线点杂交(PCR-RLB)技术用于鉴定分枝杆菌.方法 在5个中心同时进行试验.采用PCR-RLB技术检测60株属于50个种的分枝杆菌标准株;10株非分枝杆菌标准株.以胶体金法结合测序法或是气相色谱(gas chromatography,GC)法作为对比,检测鉴定383株分枝杆菌临床分离株.结果 所有的分枝杆菌标准株和临床分离株PCR扩增产物均可与分枝杆菌属探针杂交, 而种特异性探针仅与相应的种杂交,非分枝杆菌PCR扩增产物均不与分枝杆菌属及种探针杂交.与胶体金法或是GC法结合测序法相比,PCR-RLB法准确率100%,成功地将380株分枝杆菌鉴定到种(另外3株仅鉴定到分枝杆菌层未鉴定到种),包括11株其他方法不能准确鉴定的混合感染.结论 以16S-23S rDNA间隔序列作为靶基因的PCR-RLB技术,鉴定分枝杆菌敏感性和特异性高,快速、实用,具有很好的临床应用前景.     

DIFA检测非放射性斑点印迹技术的探讨

为提高分子生物学的实验效率和节省昂贵的试剂，将核酸分子或蛋白质分子预先结合于硝酸纤维素膜（ＮＣＭ）上，应用自制的ＤＩＦＡ装置检测非放射性斑点印迹。结果表明：此技术可快速检测生物活性试剂的效价及工作浓度；选择研究样本及试验条件；鉴定探针灵敏度等。     

膜反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇基因型

目的应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌对乙胺丁醇（EMB）耐药性。方法设计与合成用于检测结核分枝杆菌耐EMB基因embB的寡核苷酸探针，点于硝酸纤维素膜上，与结核分枝杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应（PCR）产物进行反向斑点杂交，并与PCR-直接测序（PCR—DS）结果比较。结果27株结核分枝杆菌临床分离株中，14株敏感株膜反向斑点杂交结果与标准株完全相同；13株耐乙胺丁醇临床分离株检测到embB基因突变。均为306位密码子ATG→GTG、ATG→CTG、ATG→ATA、ATG→ATT和ATG→ATC突变．该突变与直接测序结果完全一致。结论膜反向斑点杂交技术可能成为检测部分结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因型简便、快速的方法。     

常见曲霉菌的反向斑点杂交技术的研究

目的 建立常见曲霉菌的反向斑点杂交诊断技术.方法 针对曲霉菌内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)保守基因设计引物和杂交探针,对探针标记、固定在尼龙膜,形成一种杂交膜与PCR产物进行斑点杂交,显色.结果 真菌通用引物扩增常见曲霉菌ITS2基因DNA片段,大小为350bp左右.构建了常见曲霉菌的反向斑点杂交膜,与其PCR产物反应特异性好,灵敏度高.结论 利用PCR技术和反向斑点杂交技术鉴定常见的曲霉菌,方法特异性好、灵敏度高,符合临床需要,能为侵袭性真菌感染提供新的选择.     

5种常见念珠菌反向斑点杂交技术的研究

目的建立白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌的反向斑点杂交诊断技术。方法针对念珠菌ERG11保守基因设计引物和杂交探针,对探针进行标记然后固定在尼龙膜形成一种杂交膜,将PCR产物点样在杂交膜进行斑点杂交,显色。结果通过通用引物扩增五种常见念珠菌DNA片段,大小为350bp。构建了5种念珠菌的反向斑点杂交膜,与其PCR产物反应特异性好,灵敏度高。结论本研究建立的反向斑点杂交技术可快速、准确地鉴定临床常见念珠菌,有望在临床微生物诊断中广泛应用。     

东莞地区妇女人乳头状瘤病毒感染情况的分析

目的分析东莞地区人乳头状瘤病毒（HPV）感染率、各年龄段感染概况以及亚型分布情况。方法采用反向点杂交方法检测HPV亚型,将对象分为≤20岁、21～30岁、31～40岁、41～50岁、≥51岁5个年龄段,分别统计阳性率,分析阳性率与年龄段的关系,以及19个亚型的分布情况。结果共收集1193例样本中,检出HPV阳性296例,阳性检出率为24.8%,对上述5个年龄组亚型统计发现排在前5位的亚型分别为16、52、58、11、51,而且各年龄组亚型分布情况差异具有统计学意义。结论人类感染HPV具有年龄差异,开展HPV分型检测,对临床治疗与诊断具有重要的指导作用。