融合表达Ag85B-ESAT6的结核分枝杆菌真核表达载体的构建及其免疫原性

目的: 构建融合表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)分泌蛋白Ag85B-ESAT6真核表达载体,研究该重组载体在体外的表达和在小鼠体内诱生体液免疫应答的能力. 方法: 设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物,采用PCR的方法从MTB毒株H37Rv-DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段,将片段分别与pGEM-T-easy载体连接后测序. 将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3,挑选出阳性克隆,分别命名为AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF,将重组质粒电转CHO细胞,RT-PCR检测融合蛋白mRNA的表达,间接免疫荧光测定CHO细胞内融合蛋白的表达;用重组质粒免疫BALB/c小鼠,ELISA测定特异性抗体的滴度. 结果: PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与GenBank报道的一致. RT-PCR可检测融合基因转录出mRNA,转染重组质粒的CHO细胞内有较强的免疫荧光,AZ-pcDNA3-EF质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶ 1000,EZ-pcDNA3-AF质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶ 1500. 结论: Ag85B和ESAT6融合基因真核表达载体构建成功,有望为结核病的预防提供有效的基因疫苗.     

共刺激分子B7-1与汉坦病毒核蛋白基因共表达载体的构建及免疫调节作用

目的:探讨共刺激分子B7-1(CD80)对汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫调节作用.方法:构建双启动子共表达B7-1基因和汉坦病毒核蛋白基因的真核表达载体pcDNA 3.1-B7-S,酶切鉴定后直接肌注免疫BALB/c小鼠,同时设对照组pcDNA 3.1 空质粒接种组、pcDNA 3.1-S接种组.ELISA法检测血清特异性抗体,MTT法检测T细胞增殖反应.结果:pcDNA 3.1-B7-S接种组鼠在抗体的产生水平及淋巴细胞增殖指数上均较pcDNA 3.1-S接种组明显增高.结论:接种B7-1基因和汉坦病毒核蛋白基因的共表达质粒优于注射单目的抗原基因表达质粒,为探索增强基因疫苗的免疫作用提供了新的途径.     

小鼠CD160胞外段真核表达载体的构建和表达

目的 构建小鼠CD160胞外段的真核表达载体,并稳定转染CHO细胞进行真核表达.方法 从C57BL/6小鼠脾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增CD160胞外段,然后将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1和pEGFP-N1两种质粒中,构建重组质粒psCD160和pEGFP-sCD160.重组质粒经双酶切鉴定及测序正确后,用脂质体转染CHO细胞,并用RT-PCR和Western blot检测CD160胞外段的表达,流式细胞术检测重组psCD160与其配体的结合能力.结果 获得长度约为520 bp的小鼠CD160胞外段基因,经测序证实其序列正确.用脂质体将含有CD160胞外段基因的重组质粒载体转染CHO细胞后.RT-PCR和Western blot分析证实转染的CHO细胞可表达重组的psCD160基因,并且表达的可溶性CD160可与其配体结合.结论 成功构建小鼠CD160胞外段基因的真核表达载体,并转染CHO细胞后表达出相应蛋白,为进一步研究CD160胞外段的功能效应奠定实验基础.     

细胞因子IL-18基因对Ag85A DNA疫苗诱导产生抗体水平的影响

目的 :研究表达含白介素 (IL) 18基因的质粒 ,对结核分枝杆菌 (MTB)H37Rv Ag85A基因疫苗诱导免疫应答的影响。方法 :从正常人外周血单核细胞 (PMBCs)中提取RNA ,用RT PCR扩增IL 18cDNA ,并克隆入载体pGEM Teasy中。测序证实后 ,亚克隆真核表达载体pcDNA3.1的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。将分别表达人IL 18基因的真核表达质粒pcIL18与MTBpcAg85A基因疫苗联合肌注免疫BALB c小鼠 ,共免疫 3次 ,每次间隔 2周。每次免疫后 2周采血 ,分离血清 ,用ELISA检测小鼠血清抗Ag85A抗体的滴度。结果 :用RT PCR成功地从人PMBCs的RNA中扩增IL 18cDNA ,测序结果正确。用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定证实 ,目的基因已插入载体pcDNA3.1中 ,阳性克隆命名为pcIL18。联合应用pcIL18,三次免疫后血清抗Ag85A抗体的滴度明显较单独应用pcAg85A增高。结论 :pcIL18与pcAg85A基因疫苗联合免疫 ,可显著增强Ag85A抗原的特异性体液免疫应答。pcIL18+pcAg85A基因联合免疫是否具有增强Ag85A抗原特异性细胞免疫的作用有待进一步研究     

多聚组氨酸标签的Attacin抗菌肽基因克隆及其在CHO细胞中稳定表达

目的 克隆家蝇幼虫抗菌肽Attacin-His_6融合基因,构建真核表达载体并转染CHO细胞表达,为深入研究其生物学活性创造条件.方法 以pUCm-T/Attacin载体为模板,用含6×His标签序列的下游引物克隆Attacin-His_6融合基因,并将其构建于pcDNA3.1( )中,pcDNA3.1/Attacin-His_6重组质粒转染CHO细胞,Zeocin G418筛选阳性细胞株,RT-PCR检测重组质粒在CHO细胞的转录情况.结果 成功扩增出Attacin-His_6融合基因,构建了pcDNA3.1/Attacin-His_6重组质粒并转染入CHO细胞中,RT-PCR从阳性克隆的CHO细胞中扩增出预期大小的目的 片段,从转录水平证实CHO-Attacin-His_6重组细胞株表达了Attacin-His_6基因.结论 抗菌肽Attacin基因哺乳动物型工程细胞表达系统的建立,为进一步制备其肽类抗生素奠定了基础.     

转录因子Ets-1表达载体的构建及调控小鼠成釉细胞MMP-20的表达

目的 构建转录因子Ets-1的pcDNA3.1/myc-HisA真核表达载体,转染小鼠成釉细胞,检测Ets-1调控小鼠成釉细胞MMP-20的表达,为研究Ets-1在牙釉质发育过程中的重要作用奠定基础.方法 以从小鼠成釉细胞中提取的总RNA逆转录所得cDNA为模板,用RT-PCR法扩增得出含有kpn Ⅰ和BamH Ⅰ的Els-1目的 基因连接到pcDNA3.1/myc-HisA真核表达载体上.将重组质粒瞬时转染到小鼠成釉细胞中观察,并通过实时定量RT-PCR的方法检测MMP-20 mRNA的相对表达量.结果 ①经过PCR引物扩增得到一约1399bp的基因片段,重组质粒pcDNA3.1/myc-HisA-Ets-1双酶切进行初步鉴定后,与GenBank登录基因对比显示生物公司测序结果完全正确.②重组质粒pcDNA3.1/myc-HisA-Ets-1转染小鼠成釉细胞后(以转染空载体pcDNA3.1/myc-HisA作为对照),实时定量RT-PCR检测MMP-20 mRNA的相对表达量上升明显.结论 成功构建了Ets-1的真核表达载体,初步研究证明小鼠成釉细胞核中Ets-1可以上调MMP-20基因表达水平.     

嗜肺军团菌pilE基因体外表达及其免疫原性研究

目的 构建嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛pilE基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-pilE,研究其真核细胞中的表达及其免疫原性.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌pilE基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1.-pilE.经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-pilE转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western-blot分别鉴定pcDNA3.1-pilE的瞬时和稳定表达产物.将pcDNA3.1-pilE作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ产生水平、CTL杀伤活性等指标,评价疫苗的免疫原性.结果 扩增出了429 bp的PilE基因,在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,在相对分子质量15000处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-pilE在细胞内表达PilE蛋白.pcDNA3.1-pilE免疫组的免疫原性均高于对照组pcDNA3.1( )组(P＜0.01).结论 成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中得到了表达,免疫小鼠后诱导了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答.     

肺炎链球菌CbpA基因疫苗的构建及免疫学特性

目的：构建含有肺炎链球菌（SPN）毒力因子CbpA抗原编码基因的重组质粒pcDNA3.1/CbpA,测定其诱导特异性免疫应答的能力并评价其保护效果.方法：PCR扩增SPN CbpA编码基因,将该编码基因克隆到pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建pcDNA3.1/CbpA重组质粒,经测序鉴定后转染COS-7细胞,WesternBlot鉴定目的蛋白的表达,重组质粒免疫BALB/c小鼠,TIGR4型SPN攻击后,监测其生存时间.结果：CbpA能在COS-7细胞中表达;pcDNA3.1/CbpA重组质粒主动免疫BALB/C小鼠后,体内产生特异性IgG抗体,并诱导小鼠对SPN感染产生有效的保护.结论：成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1/CbpA,可为SPN基因疫苗的研制提供依据.     

人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。     

HO-1基因真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1的构建及表达

目的:构建人HO-1真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1并检测其表达。方法:利用分子生物学技术,将hHO-1基因与质粒pcDNA3.1连接,构成重组质粒并用RT-PCR及Western blotting方法检测重组载体在Eca-9706细胞中的表达情况,最终确定重组载体是否构建成功。结果:用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,RT-PCR检测,Western blotting检测证明hHO-1成功克隆入表达载体pcDNA3.1中。结论:本部分实验成功构建了能够在细胞内大量表达HO-1基因产物的真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1,为进一步实验奠定基础。     

结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗并对其在体外进行表达。方法：用PCR技术从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增cfp10基因,以Hindm和EcoR Ⅰ双酶切后克隆人含esat6基因的pGEM-7zf( )载体中,将测序正确的esat6-cfp10融合基因按照BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点亚克隆人真核表达载体pcDNA3．1( ),重组质粒酶切鉴定正确后以脂质体转染CHO细胞,分别以RT—PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达．结果：PCR获得的cfp10基因序列与献报道一致,大小约为350bp．重组真核表达质粒酶切后可获得约630bp的融合esat6-cfp10基因片段．RT—PCR可获得大小约为350bp的诉CFP10基因,间接免疫荧光检测后表达有Esat6-Cfp10蛋白的阳性细胞着染．结论：成功克隆结核分枝杆菌CFP10基因,构建了融合有esat6-cfp10基因的真核表达质粒并对其在体外进行了表达。     

结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达载体.方法:PCR扩增Rv2389基因,测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染CHO细胞后, 分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果:构建了重组质粒pCDNA- Rv2389, RT-PCR结果证明Rv2389可在CHO细胞中转录,间接免疫荧光检测证明,表达有Rv2389蛋白的细胞着染.结论:成功构建了结核分枝杆菌Rv2389基因的真核表达载体pCDNA-Rv2389,Rv2389基因可以在CHO细胞中表达.     

丙型肝炎病毒核心区截短型基因真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的：建立截短的丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的真核表达载体，并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中瞬时表达：方法：应用多聚酶链反应（PCR），以HCV-H株全长cDNA序列为模板，扩增获得C区羧基端部分缺失的基因片段，克隆人真核表达载体pcDNA3．1（-），并通过脂质体转染至CHO细胞。结果：构建了真核表达载体pcDNA3．1-Ct，成功转染CHO细胞，间接免疫荧光和RT-PCR证实pcDNA3．1-Ct在CHO细胞中表达截短型的C蛋白。结论：成功构建羧基端部分缺失的HCVC区基因的真核表达载体，瞬时转染CHO细胞，为进一步基因免疫和构建多表位卡介苗（BCG）活载体疫苗奠定基础。     

汉坦病毒S基因0.7 kb片段真核载体的构建、表达及基因免疫

目的 在本室前期工作的基础上,进一步进行汉坦病毒S基因0．7kb片段的真核表达及基因免疫的研究。方法 构建汉坦病毒76－118株S基因5'端700bp片段的真核表达载体pcDNA3.1-S0.7,脂质体转染COS－7细胞,免疫荧光检测表达结果;用该质粒免疫BALB／c小鼠,并用免疫荧光法及ELISA法检测免疫的体液免疫应答效果。结果 免疫荧光检测结果表明,目的基因在COS－7细胞中获得瞬时表达;用pcDNA3.1-S0.7基因免疫小鼠可引起抗汉坦病毒核蛋白（NP）特异性的抗体应答。结论 汉坦病毒S基因0．7kb片段可刺激机体产生特异的抗汉坦病毒体液免疫应答。为进一步进行细胞免疫反应的检测及基因疫苗的研究提供实验基础。     

小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1的构建及表达

目的:通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1,并检测其在CHO细胞中的表达。方法:通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体包裹转染CHO细胞,Western blot检测FGFR1目的蛋白的表达。结果:经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论:成功构建的pcDNA3.1(+)-FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。     

结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体．方法：采用gene SOE-ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3行PCR扩增融合，经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3．1( )中构建真核表达质粒pCDAg85B-A，酶切、DNA测序鉴定，用脂质体法将pCDAg85B-A转染COS-7细胞，采用RT-PCR，ELISA方法检测其表达．结果：Ag85B-Ag85A融合基因定向克隆人pcDNA3．1( )，双向测序表明碱基无突变，Ag85B-Ag85A融合基因在真核细胞中能表达．结论：成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体，为结核病基因疫苗的研究奠定基础．     

结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒的构建及其表达

目的：构建结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒，并在真核细胞中表达。方法：从H37Rv基因组中扩增出MPT64基因，经限制性内切酶消化后，定向插入pcDNA3.1( ）中，用脂质体法将pcDNA-MPT64转染COS-7细胞。采用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：扩增出的MPT64基因正确插入pcDNA3.1中，DNA序列测定无突变产生。重组质粒在COS-7细胞中表达MPT64。结论：成功地构建了pcDNA-MPT64质粒，其真核表达的蛋白具有良好的抗原性，为进一步研究MPT64在抗结核菌感染中的预防作用奠定了基础。     

细胞因子GM-CSF和结核杆菌Ag85A融合表达载体的构建与鉴定

目的：构建并鉴定细胞因子GM—CSF和结核杆菌Ag85A融合表达质粒，为研究新型抗结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。方法：用PCR方法从pc-mGM—CSF质粒中扩增出GM—CSF，构建于pcDNA3．1质粒上，成为pcDNA3．1-GM-CSF。从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出结核杆菌Ag85A基因序列并插入到质粒pcDNA3．1-GM-CSF上，将基因GM-CST的3’端与基因Ag85A的5’端直接连接构建融合表达质粒pcGM85A。结果：经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确。结论：细胞因子GM-CSF和结核杆菌Ag85A融合表达载体构建成功，为研制新型结核病基因疫苗奠定了基础。     

结核分枝杆菌热休克蛋白65与汉坦病毒G2糖蛋白融合基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65（HSP65）和汉坦病毒G2糖蛋白重组融合基因为基础的真核表达载体。为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定基础。方法 采用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv株基因中．扩增出HSP65的编码基因，从T-H8205G2质粒扩增出G2糖蛋白的编码基因．经相应限制性核酸内切酶消化后．插入真核表达载体pcDNA3．1／His，并将此重组质粒通过脂质体介导转染NIH3T3细胞．用SDS-PAGE、免疫组织化学及免疫荧光方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果 获得正向插入的pcDNA3.1/ His-HSP65-G2重组表达质粒，表达产物的相对分子量为105kD．与理论预期大小一致．并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体和HSP65单抗起特异反应。表明构建的pcDNA3．1／His-HSP65-G2能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性。结论 编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功。