两株耐酸耐胆盐人肠源菌株的鉴定及系统发育分析

目的对两株来源于健康人肠道的耐酸耐胆盐菌株R92-2和R111进行鉴定和系统发育分析,以筛选优良的宿主菌株为最终构建能高效表达和分泌β-半乳糖苷酶的工程菌奠定基础。方法表型特征分析后,利用16SrDNA两端的保守序列作为PCR引物,扩增两株菌的16S rDNA序列并测序,测序结果于GenBank中Blastn并构建系统发育树。结果表型特征分析初步鉴定两株菌为乳酸菌。R92-2的16S rDNA序列与Weissella cibaria的16SrDNA序列同源性为100%;R111的16S rDNA序列与Enterococcus faecium的16S rDNA序列同源性为100%。结论R92-2为Weissella cibaria;R111为Enterococcus faecium。两株菌有望用于构建能高效表达和分泌β-半乳糖苷酶的工程菌。     

10株青海湖盐单胞属菌株种间分子多样性分析

目的 对青海湖盐单胞属菌株进行种间分子多样性分析.方法 利用PCR扩增青海湖10株盐单胞菌16S rDNA序列和16S - 23S间隔序列,通过测序、Blast对比以及RFLP方法分析10株青海湖盐单胞菌的序列差异;并结合SDS-PAGE技术方法研究其全菌体蛋白的种间差异.结果 通过测定16S rDNA序列同源性、分析16S-23S rDNA ISR多态性和比较全菌体蛋白SDS -PAGE谱带,确定了10株青海湖盐单胞菌在种间具有相对的一致性.结论 初步验证了分子表型特性的多相研究对种单元初分类具有重要意义.     

不同地理种群栖稻假单胞菌株的16SrRNA基因序列分析

目的 分析栖稻假单胞菌不同地理种群株16SrRNA基因序列,构建系统发育树.方法 将1株栖稻假单胞菌海南临床分离株的16S rRNA基因进行PCR扩增并测序,并与从GenBank中挑选出的其他29株不同来源的栖稻假单胞菌的16S rRNA基因序列进行对比分析,并绘制系统发育树.结果 系统发育分析表明大部分菌株可根据地理区域的不同分为3个簇,序列分析显示某些可变区可能存在区分不同区域菌株的关键序列.结论 栖稻假单胞菌基因型及表现型具有多样性;大部分栖稻假单胞菌可根据16SrRNA基因序列鉴别不同地理种群株.     

16S rDNA序列分析在临床不常见细菌鉴定中的初步应用

目的建立细菌16S rDNA序列分析技术并探讨其在临床不常见细菌鉴定中的应用价值。方法收集经全自动微生物分析系统鉴定其可靠率在99%及以上的常见细菌10株和常规方法难以鉴定或少见菌17株,通过PCR扩增16S rDNA v3-v4区基因片段并进行序列测定,序列与16SpathDB 2.0数据库上已知细菌的16S rDNA序列进行比对分析确定细菌种属。当v3-v4序列片段不能明确鉴定细菌时,结合16S rDNA长片段测序及管家基因dnaJ和rpoB的序列做进一步分析。结果经16S rDNA v3-v4区序列分析,10株(100%)临床常见菌都能鉴定到种水平,其可靠性大于98.0%。17株不常见菌株中,10株(58.8%)细菌只与1种菌相似性大于98.0%,成功鉴定到单个种水平;6株(35.3%)细菌与不止1种菌的相似比大于98.0%;1株菌与已知菌相似性在96.0%~98.0%之间只能鉴定到属(棒状杆菌)。进一步结合16S rDNA长片段及管家基因dnaJ和rpoB的序列分析,所有菌株均可鉴定到单个种水平。结论结合16S rDNA和管家基因序列分析,可用于临床常见及不常见细菌的分子鉴定。     

两株蜚蠊肠道内生放线菌抗真菌活性初步研究和分类鉴定

目的检测蜚蠊肠道内生放线菌WA2-4和WA2-5的抗真菌活性,并对菌株进行初步分类学鉴定。方法采用牛津杯法测定菌株WA2-4和WA2-5发酵液对白色念珠菌和红色毛癣菌等真菌生长的影响,扫描电子显微镜观察菌株发酵液对受试真菌形态的影响,利用16S rDNA测序、Blast比对和构建系统发育树等方法,结合菌株形态学特征对菌株WA2-4和WA2-5进行初步分类学鉴定。结果菌株WA2-4和WA2-5发酵液对白色念珠菌和红色毛癣菌的生长均有抑制作用;扫描电子显微镜结果显示菌株WA2-4和WA2-5发酵液破坏了白色念珠菌的细胞膜结构,使红色毛癣菌的菌丝断裂成碎片;初步分类学鉴定结果显示,菌株WA2-4和WA2-5分别为链霉菌属和戈登氏菌属,与其各自亲缘菌株的16S rDNA序列同源相似性分别为93.5%和92.3%,均低于98.2%,因此推断该两株菌株很有可能是新菌种。结论蜚蠊肠道WA2-4和WA2-5放线菌具有抗真菌活性。     

新疆传统发酵驼乳中分离出的一株乳酸菌的分子生物学鉴定

目的：对新疆阿勒泰牧区哈萨克传统发酵驼乳中分离出的一株乳酸菌进行分子生物学鉴定。方法采用 DNA 提取、PCR 扩增、16S rDNA 产物测序和数据分析对该菌株进行系统发育分析鉴定。结果16S rD-NA 产物测序结果通过 Eztaxon 数据库比对,保守基因 rpoA、pheS 的扩增产物通过 NCBI 数据库比对,发酵驼乳中乳酸菌菌株的序列和已报道的乳酸菌菌株16S rDNA、rpoA、pheS 的序列分别用 MEGA 5．2软件进行系统发育分析表明：此菌株（10号）的16S rDNA 序列与 Lactobacillus pentosus （JCM 1558T ）、Lactobacillus plantarum subsp． Argentoratensis （DKO 22T ）、Lactobacillus paraplantarum （DSM 10667T ）和 Lactobacillus plantarum subsp． Plantarum （ATCC 14917T ）的相似率分别为100％、99．87％、99．8％和99．74％。结论10号乳酸菌菌种经分子生物学鉴定为 Lactobacillus pentosus （JCM 1558T ）。     

16S rDNA测序鉴定β溶血性G群链球菌

目的 对一起群聚性儿童肾小球肾炎暴发事件中分离到的26株β溶血性G群链球菌进行16S rDNA测序鉴定,探讨该方法在病原学鉴定方面的意义.方法 分别采用API20 Strep生化鉴定系统、部分和全序列测定16S rDNA鉴定26株β溶血性G群链球菌;使用Mega V3.1软件,采用Neighbour-joining 方法和boot-strap test对部分菌株的全序列进行树状图分析.结果 API20 Strep生化鉴定率低,未能鉴定出目的菌;采用16S rDNA测序,结果均为咽峡炎链球菌(S.anginosus),鉴定率大于97%.其中4株G群的全序列树状图分析显示,G群链球菌均与咽峡炎链球菌聚类在同一簇.结论 16S rDNA序列鉴定能提供详细明确的核苷酸信息,能区分G群链球菌不同的种,显示其在菌株鉴定方面的独特优势.     

一株具有抗稻瘟霉活性的海洋细菌32-11-2-2的筛选和分离鉴定

目的:从中国东海微生物样品中分离筛选活性细菌菌株,并对活性菌株32-11-2-2进行鉴定.方法:采用无限稀释和平板划线法分离微生物样品,利用稻瘟霉模型进行活性筛选;并对其中的活性菌株32-11-2-2的形态、培养特征以及生理生化特征进行研究,使用16S rDNA序列分析的方法对菌株32-11-2-2进行了分类鉴定.结果:分离得到421株细菌,包括活性菌株54株,其中活性菌株32-11-2-2是一株弱嗜盐菌,具有陆地芽孢杆菌的形态特点,能产生胞外淀粉酶、过氧化氢酶,液化明胶、石蕊牛奶反应阳性,16S rDNA序列分析该菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)同源性达到98%以上.结论:活性菌株32-11-2-2是一株适应了海洋环境的枯草芽孢杆菌.     

白首乌内生细菌分离鉴定及系统发育树分析

目的:对中药白首乌根部的内生细菌进行分离、纯化、鉴定及比对,最终确定其种属并构建系统发育树。方法:运用涂布法和平板划线法从中药白首乌的块根中分离、纯化内生细菌,对分离得到的纯菌株进行形态学观察、生理生化鉴定,并结合菌株的16S r RNA基因序列鉴定其种属,再将测序结果与Gen Bank中的已知序列进行BLAST比对,查找相似性最高的菌种进行同源性分析,最终通过软件MEGA 7.0构建系统发育树确定菌株的系统分类学地位。结果:首次从中药白首乌的根部分离得到12株内生细菌,其中9株属于芽孢杆菌属(Bacillus),相似性为99%~100%;2株属于假单胞菌属(Pseudomonas),相似性为100%;1株属于沙雷氏菌属(Serratia),相似性为99%,确定优势菌属为芽孢菌属。结论:白首乌根中存在多株内生细菌,其很可能是白首乌内生菌资源的重要组成部分,本研究为白首乌内生菌的资源开发奠定了基础。     

分析16S rRNA基因部分序列鉴定一株乳酸菌

目的 利用聚类分析16S rRNA基因部分序列的方法对乳酸菌进行鉴定.方法 在表型鉴定的基础上,应用已发表的16S rRNA基因序列设计引物,扩增L.sp.L5菌株16S rRNA基因,并进行测序,将结果与同属及非同属的乳酸菌进行同源性比较.结果 L.sp.L5菌株与同属的乳酸乳球菌同源性为85.5%以上,尤其与乳酸乳球菌叶蝉亚种NCDO 2181T同源性为99.5%,与不同属的肉明串珠菌、漫游球菌、嗜盐四联球菌同源性分别为77.5%、82.8%、79.0%.结论 菌株L.sp.L5为乳酸乳球菌.     

北京地区实验动物中嗜肺巴斯德杆菌的表型分析

目的对北京地区实验动物中的嗜肺巴斯德杆菌分离株进行表型分析,提高检测的准确性。方法通过生化鉴定和16S rDNA测序,对306株嗜肺巴斯德杆菌可疑菌株进行鉴定。结合分离株在血琼脂平皿上的菌落特征和生化特性,组成53个特征数据谱,进行表型特征的聚类分析。结果 306株分离株中,BD自动细菌鉴定系统和16S rDNA测序鉴定出嗜肺巴斯德杆菌的阳性率分别为164/306和227/306。227株嗜肺巴斯德杆菌真阳性的表型特征共有140种,Heyl型106种,Jawetz型23种。结论北京地区实验动物中嗜肺巴斯德杆菌主要为Heyl型感染,Jawetz型较少,表型特征多样,分布广泛。     

华南地区肉芽肿性小叶性乳腺炎患者的细菌鉴定与分析

目的：以细菌16S rDNA 序列为分子标记,对12例来自华南地区肉芽肿性小叶性乳腺炎（ GLM）患者的脓液标本进行细菌培养和分子鉴定,从而探讨该地区肉GLM与潜在致病细菌之间的关系。方法将收集到的12例脓液标本接种于血琼脂平板,对在平板上生长的细菌进行革兰染色并进行初步的鉴定。进一步通过DNA提取试剂盒提取细菌总DNA并利用通用引物对其16S rDNA序列进行PCR 扩增,然后测定其核酸序列,在Gen－Bank中通过BLAST比对查找其同源序列并进行分子鉴定,最后利用MEGA 6．0软件构建所鉴定细菌的分子系统发育树。结果12例脓液标本经血琼脂平板培养后2例呈阳性,细菌检出率为16．7％,革兰染色结果表明细菌为革兰阳性杆菌。序列分析结果显示两个标本的16S rDNA序列与GenBank中已有的棒状杆菌属16S rDNA序列达到99％的相似度,并且在系统发育树中与Corynebacterium kroppenstedtii DNF00591（ KJ082041）和Corynebacterium kroppenstedtii CIBU 090024（JF299190）聚类成为一枝。结论基于收集到华南地区12例GLM标本,通过16S rD－NA基因测序分析和系统发育树构建的分子生物学方法,能够对GLM的细菌进行鉴定与分析。数据分析结果表明由kroppenstedtii棒状杆菌为致病菌导致华南地区GLM的概率约为16．7％。     

变形链球菌耐氟菌株的筛选及分子鉴定

目的：探讨变形链球菌(S.mutans)获得耐氟性的培养条件及其鉴定方法,为鉴定变形链球菌耐氟菌株提供理论依据。方法：在微需氧条件(95%N2,5%CO2)下,以梯度氟化钠(NaF)浓度对变形链球菌UA159进行培养,获得耐氟菌株。从表现型和基因型上鉴定所培养菌株。观察菌株的表型特征;采用生理生化鉴定和PCR法对该菌株16S rDNA进行克隆鉴定。结果：微需氧（95%N2,5%CO2）条件下培养出耐氟变形链球菌株。形态学观察、生理生化鉴定和16S rDNA鉴定,该菌株具有耐氟稳定性,与变形链球菌UA159的16S rDNA序列同源性是100%,确定该菌株为变形链球菌耐氟菌株。结论：变形链球菌耐氟菌株培养条件是微需氧（95%N2,5%CO2）和脑心浸液(BHI)培养基中培养48 h。经NaF诱导的变形链球菌UA159鉴定为变形链球菌UA159的突变株变形链球菌UA159-FR。
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具有高效降解地塞米松能力的伯克霍尔德菌CQ001株的分离及功能基因组学分析

目的 研究细菌对地塞米松类甾体激素的降解作用及其分子机制,为构建清除水环境医源性地塞米松类药物污染的工程菌奠定基础.方法 采用富集培养法从医院废水中分离降解地塞米松的细菌,采用固相萃取-高效液相色谱(HPLC)法检测细菌对地塞米松的降解效能,通过16S rDNA序列测定进行鉴定.用Illumina Hiseq4000结合第三代测序技术对降解菌的全基因组测序,并进行序列组装、注释和分析,对降解地塞米松相关基因进行RT-qPCR验证.结果 分离到1株对地塞米松有较高降解作用的细菌,经鉴定属于伯克霍尔德菌属(Burkholderia),命名为Burkholderia sp.CQ001.该菌对地塞米松磷酸钠及地塞米松的降解率分别为84.8％和77.11％.全基因组测序表明Burkholderia sp.CQ001包含2条染色体和4个巨型质粒,与代谢相关基因大部分集中在2号染色体上,共3 260 157 bp.生物信息学分析表明,该菌含有甾体代谢通路中许多重要酶类的编码基因,其中与地塞米松降解相关的有ABC转运子,3-甾酮-9 α-脱氢酶等,这些基因在以地塞米松磷酸钠为碳源的培养条件下表达量不同程度地高于以蔗糖为碳源的培养条件.结论 Burkholderia sp.CQ001是一株具有强大的代谢功能和代谢途径丰富的细菌,具有降解地塞米松类甾体激素的性能,该菌株为后续研究甾体激素的降解机制和构建清除水环境医源性地塞米松类药物污染的工程菌提供了菌种.     

国内首例播散性毛孢子菌病病原菌阿萨希丝孢酵母菌的DNA序列分析

目的 鉴定播散性毛孢子菌病病原丝孢酵母菌AS2.2174,并探讨将DNA序列分析且于病原酵母菌快速鉴定的可行性。方法 丝孢酵母菌株取自1例播散性毛孢子菌病患者的皮肤病损处,用简易微量DNA提取方法从病原酵母菌株中提取细胞总DNA,用PCR方法扩增26S rDNA D1/D2区域,纯后用热循环测序法对扩增产物进行直接测序。结果 测定了菌株AS2.2174的26S rDNA D1／D2区域的604个碱基序列,并将该序列登录于GenBank（登录号：AF337949）。通过与丝孢酵母属所有种模式菌株D1／D2序列的比较分析表明,AS2.2174与阿萨希丝孢酵母（Trichosporon asahii）的序列完全相同,而与在表型特征上与Trichosporon asahii难以区分的另外3个丝孢酵母菌种或变种分别相差3－8个碱基。结论 确定菌株AS2.2174属于Trichosporon asahii,并显示DNA序列分析在病原酵母菌鉴定方面具有常规方法难以达到的快速和准确。     

长沙人间布鲁菌分离株omp25基因扩增和系统进化分析

目的了解长沙地区人间布鲁菌omp25基因的序列特征并阐明其系统进化关系,为布鲁菌病防控以及omp25基因克隆与表达研究提供参考。方法根据Gen Bank公布的羊种布鲁菌16M的omp25基因序列设计1对PCR引物,采用PCR法从长沙地区布鲁菌分离株基因组中扩增omp25基因,产物用凝胶电泳进行分析后进行双向核苷酸序列测定,测序结果用DNAstar 7.1进行分析,将测序结果提交Gen Bank,并利用Mega 7软件构建布鲁菌长沙分离株系统进化树。结果 41株布鲁菌成功扩增出omp25基因片段,片段长度约640 bp,通过测序后Blast同源性分析,证实41株菌株均为羊种布鲁菌,长沙分离株与10株羊种布鲁菌序列100%相同,进化树显示长沙分离的布鲁菌和国内外羊种布鲁菌位于同一进化分支上,同广西的LA1105参考株亲缘关系最近。结论长沙地区人间布鲁菌分离株omp25基因序列与参考菌株序列同源性高,且与羊种布鲁菌在同一分支,表明omp25基因序列是一个保守序列。该研究结果可为布鲁菌的分子生物学鉴定和诊断试剂的研制提供参考。     

云贵地区淡水湖中类蛭弧菌多样性分析

目的：对贵州阿哈湖、百花湖及云南滇池不同深度湖水中分离的类蛭弧菌进行分类鉴定,了解云贵地区淡水中类蛭弧菌多样性.方法：培养云贵地区3个湖泊中分离的类蛭弧菌,进行16S rRNA基因测序分析,用MEGA 6.0软件以邻接法构建3个湖泊中类蛭弧菌16S rRNA序列的系统发育树,并以最大似然法（PHYLIP3.1软件）加以验证.结果：从阿哈湖、百花湖及滇池不同深度湖水中分离的类蛭弧菌覆盖率C值为75％,根据类蛭弧菌16S rRNA构建发育树,本研究所得的类蛭弧菌分属3个簇群,γ-Proteobacteria （8.3％）、δ-Proteobacteria（50.0％）及Sphingobacteria（41.7％）;在百花湖中分离得到1株路德维希肠杆菌,分离自贵州阿哈湖的6株菌株与噬菌弧菌属的Bacteriovorax sp.EPA同源性较高,分离于滇池的5株菌株的序列为不可培养细菌序列.结论：云贵地区阿哈湖、百花湖及滇池不同深度湖水中的类蛭弧菌具有较高多样性,推测在云南滇池区域存在着尚未开发的新型类蛭弧菌资源.     

应用系统发育分析方法鉴别近缘病原菌

目的:以gyrB基因序列为基础,采用系统发育分析方法构建进化树,对种系关系密切的病原菌进行区分鉴别。方法:测序获得本地区19株大肠埃希菌、13株志贺菌、2株豚鼠气单胞菌、2株嗜水气单胞菌、1株维隆气单胞菌的gyrB基因序列,并将其同公共数据库已有序列合并,构建进化树。分析各序列在树中的聚类关系,以此对菌株进行种水平分类鉴别,并同BLA ST查询结果相比较。结果:除鲍氏和痢疾志贺菌外,对检测的所有序列,在进化树上与之最邻近的5条序列均为该种菌株。而对一部分菌株,其BLA ST查询结果中含有其它菌种的或分类关系不明确的序列。结论:以系统发育方法对种系发生关系密切的病原菌序列进行鉴别,具有较好的分辨力和准确度。     

中国东海亚硫酸杆菌属微生物的鉴定及生物学活性分析

目的:对44株中国东海来源的亚硫酸杆菌进行16S rDNA的序列测定和生物学活性的初步分析.方法:用PCR方法对细菌的16S rDNA序列进行扩增,并在GenBank上进行相似性搜索.将全部亚硫酸杆菌的16S rDNA序列运用Clustal X1.8软件进行多序列比对并用MEGA4.1绘制进化树.利用稻瘟霉菌(Pyricularia oryzae) P-2b、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 和大肠埃希菌 (Escherichia coli) 作为指示菌检测菌株发酵液的抗菌活性.以HL-60、HepG2细胞作为细胞毒活性指示细胞株检测菌株发酵液的细胞毒活性.采用ABTS和DPPH抗氧化模型检测菌株发酵液的自由基清除能力.结果:经与GenBank数据库比对,44株菌均与亚硫酸杆菌属有很高的相似性(97%～100%).所有菌株发酵液对指示菌未显示出抗菌活性.菌株发酵液有不同程度的细胞毒活性和清除自由基的能力.19株菌的发酵液对HepG2细胞有抑制作用,抑制率为6.8%～42.8%,18株菌的发酵液对HL-60细胞有抑制活性,抑制率为6.9%～43.6%.12株菌的发酵液对ABTS自由基有清除能力,清除率为4.49%～23.08%,8株菌发酵液对DPPH自由基有清除能力,清除率为1.23%～30.76%.结论:44株中国东海来源的亚硫酸杆菌表现出显著的细胞毒活性及抗氧化活性,具有潜在的药用价值.     

湛江南药场引种檀香rDNAITS序列系统发育分析

目的研究广东湛江南药场引种檀香与檀香科内植物rDNA ITS序列系统发育的关系。方法采用改良CTAB法提取檀香总DNA,分别对样品rDNA ITS区进行PCR扩增和测序,通过rDNA ITS序列进行分类鉴定及系统发育分析。结果 11个样品rDNA ITS序列间的遗传距离为0.000%-0.144%,邻接法和最大简约法构建的系统发育树显示国内引种自印度和印度尼西亚的檀香与印度檀香聚为一亚支（支持率为84%和95%）。结论基于rDNA ITS序列的测序分析和构建系统发育树的分子生物学方法,可为檀香药材的种类鉴定提供科学依据。