超顺磁性氧化铁标记间充质干细胞心肌移植的磁共振成像研究

目的探讨应用磁共振（MR）进行干细胞活体心肌内成像的可行性。方法从猪骨髓抽取、分离、培养间充质干细胞（MSC）,用含超顺磁性氧化铁纳米颗粒（铁羧葡胺）的DMEM培养液孵育24h,并用二脒基苯基吲哚（DAPI）和PKH。进行荧光标记。然后将MSC经心外膜直接注入猪急性梗死心肌内,每头猪注射3点。根据每注射点细胞数量以及细胞是否铁标记,12头猪随机分成4组：2×10^6标记细胞组（n=3）、1×10^6标记细胞组（n=3）、5×10^5标记细胞组（n=3）和1×10^6未标记细胞组（n=3）。细胞移植后20—24h行猪心脏1．5TMR成像,1h后处死并根据MR成像图像切取心肌组织行普鲁士蓝染色和免疫荧光检查。结果（1）体外标记：普鲁士蓝染色见标记MSC内大量蓝色颗粒,标记率为100％,电镜证实含铁囊泡位于胞质内。（2）MR成像：注射铁标记细胞的三组（9头猪）进行活体心脏快速小角度翻转梯度回波（T2·WI—Flash 2d）序列成像,发现移植部位均呈明显的低信号,而且注射点信号缺失区的面积大小与回波时间和移植细胞数量有关;而快速自旋回波（T2WI—FSE）序列成像仅隐约可见低信号区甚至难以辨认,但显示梗死病灶和猪心脏结构比T2·WI-Flash 2d序列清晰。未标记细胞组（3头猪）的9个注射点心肌壁均未显示MR低信号区。（3）组织学检查：MR成像低信号区心肌病理学检查见普鲁士蓝染色、DAPI和PKH26三重阳性细胞存在。结论应用磁共振对超顺磁性氧化铁标记的干细胞进行活体心肌内成像是可行的。     

超顺磁性氧化铁活体动态示踪小型猪骨髓间充质干细胞的转归

目的探讨磁共振(MRI)下活体动态示踪小型猪骨髓间充质干细胞(MSCs)经冠脉移植治疗心肌梗死的可行性及移植后8周MSCs的转归。方法采用密度梯度离心法获取小型猪自体骨髓MSCs,用携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体转染MSCs,并用超顺磁性氧化铁(SPIO)体外标记MSCs-GFP。采用经皮球囊封堵法制备急性心肌梗死(AMI)模型,随机分为2组,MSCs移植组(n=8),经冠脉移植双标记的MSCs到小型猪心肌梗死区域,对照组(n=5),移植等量生理盐水,移植后24 h、3周、8周在MRI下进行活体动态示踪。8周后离体组织学观察大体形态学改变及移植细胞存留情况。结果普鲁士蓝染色显示25μg Fe/mL SPIO与0.8μl/mL阳离子脂质体联合对MSCs的标记率达95%～100%,标记后细胞活力和增值能力较前改变无统计学差异(P>0.05),对GFP的表达无影响,双标记细胞仍具备成骨、成脂及成心肌分化能力,心肌细胞表面标记物α-MHC和actinin表达阳性。双标记MSCs经冠脉移植后24 h,3周,8周MRI成像均可见梗死区域的室间隔有明显区别于周边组织的低信号,信号强度(SI)改变分别为52.98%±10.74%,21.53%±5.40%,6.23%±2.01%(P<0.05),对照组无可见低信号区域。组织学检查示MSCs移植组心梗瘢痕面积明显缩小(P<0.05),HE染色见心梗区域心内膜下出现再生心肌,普鲁士蓝染色可见有蓝色颗粒聚集,荧光显微镜下同一切片GFP表达阳性,CD68(单核巨噬细胞表面标记物)表达阴性。每高倍镜视野下心梗边缘区和梗死区的蓝色颗粒数分别为36.2±3.8和9.7±2.1(P<0.05)。对照组普鲁士蓝染色阴性。结论 GFP/SPIO双标记MSCs是安全的,且不改变干细胞的生物学特性。经冠脉移植双标记MSCs可在MRI成像下表现出理想的信号强度,示踪时间长达8周,MSCs移植可减小心梗瘢痕面积,促进心肌再生,8周后SPIO主要定居于心梗边缘区,仍存在于MSCs中,SPIO活体动态示踪小型猪骨髓MSCs?     

Resovist标记大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死的磁共振成像监测

目的探讨MRI监测Resovist体外标记大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗脑梗死后在脑内的分布及迁移。方法 16只大鼠随机分为对照组8只和移植组8只。BMSCs传至P3代后,Resovist体外标记BMSCs。采用改良Longa法制作大鼠脑梗死模型,移植组缺血对侧顸叶脑皮质移植Resovist标记的BMSCs,对照组不移植。2组大鼠均于移植后1 d和1、2、4周行MRI动态观察。移植后4周行脑组织HE染色及普鲁氏蓝染色。结果移植组大鼠移植后1 d和1、2、4周MRI序列上,均可显示缺血对侧半球移植的Resovist标记BMSCs所致的低信号,移植后2周可见沿胼胝体腹侧走行的线状低信号影,移植后4周细胞所致的彗星状改变更为明显,彗星尾向缺血侧延伸。脑组织普鲁氏蓝染色显示,移植组大鼠胼胝体内迁移的蓝染细胞呈条带状排列。结论临床应用型MRI可获得满意图像质量及实验数据,不仅可显示移植位点BMSCs所致的低信号,还可明确显示BMSCs经由胼胝体的迁移。     

磁标记大鼠间充质干细胞肝脏移植的磁共振成像活体示踪

目的探讨1.5 T MRI活体示踪磁标记干细胞经门静脉肝脏移植的可行性。方法大鼠间充质干细胞以菲立磁和DAPI标记后,经门静脉注入大鼠肝脏,分别于移植前及移植后1 h、3 d、7 d和14 d行MRI扫描,并与组织荧光显像和铁染色对照。结果移植后1 h、3 d、7 d及14 d肝脏信噪比分别为1.10±0.26、8.18±1.55、11.08±1.30、14.15±1.02,7 d以内肝脏信噪比与移植前比较均有明显降低(P<0.05)。各时相肝组织铁染色与荧光显像的空间分布一致。结论1.5 T MRI活体示踪经门静脉移植的磁标记干细胞是可行的,MRI示踪时间可持续7 d。     

菲立磁标记猪骨髓间充质干细胞自体肝内移植的MR成像

目的:探索标记细胞肝内移植后磁共振威像技术.方法:获取猪自体骨髓间充质干细胞,分离、培养.应用菲立磁(Feridex)标记细胞,普鲁士蓝染色鉴定,标记细胞组n=6)和未标记细胞组(n=4)行经门静脉行肝内移植,分别于移植前,移植后6h、3 d、7d行磁共振T1WI,T2WI,T2*WI序列成像,同时行组织切片普鲁士蓝染色结果:普鲁士蓝染色表明MSCs的标记率达接近100%,磁标记MSCs肝内移植后行磁共振T2*WI序列呈明显低信号改变,并持续至细胞移植后7 d,组织切片普鲁士蓝染色显示7 d后肝内仍有移植的磁标记细胞存在于肝实质及肝血窦中.结论:利用Feridex可以在体外成功标记猪骨髓间充质干细胞,肝脏移植后行磁共振可以对标记细胞进行活体成像.     

磁共振评价磁探针标记的骨髓单个核及骨髓间充质干细胞移植治疗猪急性心肌梗死的疗效

目的 骨髓单个核细胞(BM-MNC)及骨髓间质干细胞(MSC)经磁探针标记后,应用磁共振成像(MRI)观察磁探针标记的BM-MNC(MR-MNC)及MSC(MR-MSC)治疗猪急性心肌梗死(AMI)的疗效.方法 24头小型家猪经皮冠状动脉介入法成功制备AMI模型19头,随机分为MR-MSC组(n=7)、MR-MNC组(n=6)和AMI对照组(n=6),分别经冠状动脉途径植入MR-MSC、MR-MNC(细胞总数1×107)和含菲立磁标记物的磷酸盐缓冲液,MRI爪踪移植细胞并观察8周后不同细胞类型移植对梗死心肌面积及心功能的影响,最后行组织学检查鉴定移植细胞及其功能.结果 MRI示MR-MSC组、MR-MNC组均见呈低信号的标记细胞归巢至呈高信号的梗死心肌区周边或梗死心肌内.与移植前相比,8周后MRI测定梗死心肌而积在标记细胞移植组均明显缩小(MR-MSC组8.5%±0.5%比24.7%±3.1%,P＜0.05;MR-MNC组12.3%±1.5%比26.1%±1.5%,P＜0.05);左室射血分数(LVEF)均有明显提高(MR-MSC组56.9%±1.3%比40.7%±2.0%,P＜0.05;MR-MNC组52.8%±1.4%比41.9%±3.3%,P＜0.05),但MR-MSC组LVEF改善程度优于MR-MNC组(16.2%±1.2%比10.9%±3.0%,P＜0.05).普鲁士蓝染色证实标记细胞分布与MRI所见低信号区分布基本一致.Western blot分析显示心肌再生指标肌球蛋白重链表达在MR-MSC组(100.3±5.5)及MR-MNC组(95.5±4.2)均高于AMI对照组(75.7±5.7);心肌特异性肌钙蛋白T在MR-MSC组(124.0±5.8)及MR-MNC组(118.4±4.4)均高于AMI组(93.3±3.9);心肌重构指标基质金属蛋白酶2(MMP2)/MMP抑制剂1(TIMP1)在MR-MSC组(0.6±0.1)及MR-MNC组(0.6±0.1)低于AMI对照组(4.2±0.2).结论 MR-MSC及MR-MNC可在体分化成表达心肌特异性蛋白的心肌样细胞,延缓心室重构,缩小梗死心肌面积,改善整体心窒收缩功能,且MR-MSC对心功能改善程度优于MR-MNC.     

磁共振成像R2*map示踪超顺磁性氧化铁标记的内皮祖细胞

目的 探讨R2*map在超顺磁性氧化铁(SPIO)标记内皮祖细胞(EPCs)定量检测中的价值.方法 分离和培养Balb/c小鼠后肢骨髓来源的EPCs,培养7 d,用细胞膜红色荧光探针标记的乙酰低密度脂蛋白和异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素-1双阳性染色法,以及异硫氰酸荧光素标记干细胞抗原1和藻红素标记的血管内皮细胞生长因子受体2的方法上流式细胞仪进行鉴定.用50 μg/ml SPIO及6 μl/ml lipofectamine 2000与EPCs共孵育进行标记后透射电子显微镜观察;制成不同细胞浓度(0～2.0×106/ml)标记及未标记SPIO的细胞琼脂糖模型,进行3.0T磁共振扫描,包括T2*map和T2map扫描,得到R2*map和R2map图像.结果 培养7d后细胞呈现内皮祖细胞特征.SPIO标记的EPCs细胞结构与未标记细胞相比较,无明显改变.R2*和R2值与标记SPIO的细胞浓度呈线性相关(r值分别为0.955,0.922,P值均<0.05);R2*效应明显高于R2效应(t=23.23,P<0.05).结论 磁共振成像R2*map扫描可准确定量示踪SPIO标记的EPCs.     

增强型绿色荧光蛋白转染豚鼠间充质干细胞的研究

目的探讨增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为种子细胞标记物的可行性。方法构建EGFP逆转录病毒载体,转染豚鼠骨髓间充质干细胞（MSC）,用阳离子脂质体介导法将病毒质粒导入HEK293包装细胞内。经G418筛选出阳性细胞克隆,取阳性克隆的病毒上清感染豚鼠骨MSC。筛选出稳定表达EGFP的MSC克隆,并向神经元方向诱导。检测神经元样细胞的特异性标志神经丝蛋白（NF）的表达。结果EGFP的逆转录病毒载体成功构建。病毒上清转染豚鼠MSC后,EGFP能稳定表达1个月以上,并且MSC细胞诱导后能表达NF。结论EGFP逆转录病毒载体易于构建成功并能在靶细胞中长期稳定表达,不影响细胞的分化特性,可以用作细胞标记。     

外周血内皮祖细胞磁探针标记及体外磁共振成像的实验研究

目的应用纳米磁探针三氧化二铁（Fe2O3）-多聚赖氨酸（PLL）复合物体外标记兔外周血内皮祖细胞（EPCs）,磁共振（MR）对标记细胞成像。方法合成Fe2O3-PLL复合物。分离兔外周血单个核细胞,贴壁法筛选出EPCs,传代培养,Fe2O3-PLL标记祖细胞,普鲁士蓝染色、电子显微镜显示细胞内铁,四氮噻唑蓝（MTT）比色试验评价不同浓度Fe2O3-PLL标记EPCs后对细胞生长状况的影响,流式细胞分析检测标记、未标记细胞的细胞周期、细胞凋亡,应用MR的不同序列进行细胞群成像。结果普鲁士蓝染色、电镜观察均可见铁颗粒位于细胞质内,标记率接近100％,MTT比色试验示10μg／ml至200μg／ml7个铁浓度组,Fe2O3-PLL标记后细胞的光吸收值与未标记者比较,差异无统计学意义,流式细胞分析结果显示Fe2O3-PLL标记后细胞周期、细胞凋亡与未标记细胞间差异无统计学意义。磁共振成像（MRI）显示标记Fe2O3-PLL的细胞群较未标记者信号降低,以T2^＋加权像（FWI）信号强度变化率最大;标记后7d的信号强度变化率均较标记1d者下降。结论Fe2O3-PLL可以有效标记兔外周血EPCs,其对细胞的活力、增殖等生物学特性无明显影响。临床应用型1．5TMR可在体外进行标记细胞群成像,间接反映于细胞的数量和分裂增殖状态。     

经心内膜心肌内移植猪自体骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的实验方法

目的:探讨经皮经心内膜心肌注射移植猪自体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的治疗心肌梗死(MI)实验方法的可行性和安全性。方法: 选5只雌性健康小型猪通过股动脉入路采用冠脉球囊封堵冠状动脉左前降支60 min建立MI模型。以超声确定MI后两周,采用心肌注射器经心内膜向心肌内注入1×108个小型猪自体红色荧光染料Dil标记的BMSCs,并观察心电图(ECG)的变化。移植BMSCs 8周后,取心肌组织行病理切片,选取含有移植细胞的切片行免疫荧光染色。结果: 4只小型猪成功地建立MI模型（1只因术中室颤死亡）并完成经心内膜的细胞移植,注射过程可出现一过性室性早搏以及短阵室速。通过心肌免疫荧光染色证实,移植的BMSCs已在宿主心肌内存活。结论: 使用心肌注射器经心内膜心肌移植自体BMSCs创伤小,方法可行,具有临床应用的前景。     

骨髓间充质干细胞的培养及低氧条件对其影响

目的 骨髓间充质干细胞(BMMSC)的体外培养和低氧对于BMMSC增殖作用的影响.方法 成年雄性SD大鼠断颈处死后于75％酒精中浸泡5 min.用全骨髓贴壁法培养细胞,选取生长状态良好的第3代细胞进行鉴定.以单克隆抗体CD45、CD90行流式细胞术鉴定大鼠BMMSC.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定第3代BMMSC以及低氧处理的第3代BMMSC的增殖情况.结果 用全骨髓贴壁法分离并培养SD大鼠BMMSC;流式细胞仪检测显示:第3代BMMSC表面特异性标志CD90表达率为96.0％,而非BMMSC表面标志CD45仅为2.5％.MTT结果显示低氧条件下的BMMSC比常氧条件下增殖速率高,并且光镜下观察到细胞状态均一,折光性更好.结论 用全骨髓贴壁法可以在体外分离、培养出纯度较高的SD大鼠来源BMMSC,低氧环境可以刺激BMMSC的增殖.     

人骨髓间充质干细胞体外分化为肝细胞样细胞

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养及特异性诱导为肝细胞样细胞的能力。方法 骨髓标本来源于健康志愿者的胸骨,年龄2～35岁,采用淋巴细胞分离液(密度1.077)分离人MSCs,并分别采用HGF、FGF4、HGF FGF4以及无生长因子四种处理因素体外诱导第三代人MSC向肝细胞样细胞分化。通过流式细胞术分析鉴定.MSCs的纯度,于诱导培养的0、7、14、21、28天时留取细胞检测CK18、AFP和白蛋白的表达情况,同时进行糖原染色验证细胞功能。结果 用淋巴细胞分离液分离出的人MSCs纯度可达90％,采用HGF、FGF4及HGF FGF4三种处理因素均可在体外诱导人MSCs特异分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的细胞。结论 人MSCs能在体外扩增并定向诱导为肝细胞样细胞。     

异体间充质干细胞移植治疗酮症起病1型糖尿病的临床疗效

目的：初步观察异体间充质干细胞（MSCs）移植对以酮症起病的初发1型糖尿病（T1DM）的疗效并探讨移植时病程对疗效的影响。方法筛选2009年1月至2012年1月于南京大学医学院附属鼓楼医院内分泌科就诊的以酮症起病的初发T1DM患者10例进行异体MSCs移植,其中4例行骨髓MSCs移植,6例行脐带MSCs移植。纵向观察患者胰岛素用量、糖化血红蛋白（HbA1c）、C肽的变化。按移植时病程不同将移植患者分为病程≤1个月组（4例）和病程>1个月组（6例）并作进一步分析。采用方差分析比较移植后不同周期各指标的变化,分层及协方差分析比较移植时病程对移植疗效的影响,生存分析比较胰岛功能衰竭速度。结果与移植前比较,移植后不同周期时10例T1DM患者平均胰岛素用量及HbA1c水平不同程度地降低,其中HbA1c于6、12个月时降低显著（7.2%±2.1%、7.2%±1.7%比10.3%±3.5%,F=4.435,P<0.05）;空腹C肽（FC?P）及餐后2 h C肽（2h C?P）较移植前无明显变化;移植后不同周期时,病程≤1个月组患者胰岛素用量的减少（6、12个月时）及2 h C?P的增加（6个月时）均显著高于病程>1个月组患者[（-0.40±0.64）比（0.08±0.23）U·kg?1·d?1、（-0.50±0.46）比（0.08±0.17）U·kg?1·d?1和（191±258）比（-244±276）pmol/L,F=7.94、16.21、8.69,均P<0.05];移植后各周期时,病程≤1个月组患者胰岛功能衰竭速度低于病程>1个月组患者（χ2=3.74,P=0.05）。结论异体MSCs移植能够改善酮症起病初发T1DM患者的糖代谢水平,减少胰岛素用量;移植时的病程可能是移植疗效的重要影响因素。     

大鼠骨髓间充质干细胞同种异体移植治疗糖尿病的初步研究

目的观察植入糖尿病大鼠体内的骨髓间充质干细胞（MSCs）能否分化为可分泌胰岛素的细胞或者促进胰岛β细胞增殖。方法采用贴壁法分离培养来自同种异体大鼠的MSCs,移植前用5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记。将60只雄性SD大鼠随机分为正常对照组（NC组）;糖尿病大鼠对照组（DM组）;经左心腔注射移植MSCs糖尿病大鼠组（MSCs组）;经左心腔注射移植MSCs并行环孢霉素A灌胃的糖尿病大鼠组（MSCs＋CsA组）。分别于造模前、成摸时和移植细胞后7、14、28天时检测OGTT和体重;每周固定时间测一次随机血糖;处死大鼠前从心脏取血测胰岛素;移植细胞后7、14和28天时,取各组大鼠胰腺组织行增殖细胞核抗原和Brdu免疫组化。结果移植MSCs后7天和14天都可在MSCs组和MSCs＋CsA组大鼠胰腺的血管内及其周围、胰腺外分泌组织和／或胰岛内发现Brdu阳性细胞。移植MSCs后14天MSCs＋CsA组OGTT的2h血糖值较DM组有下降趋势（P=0．069）;三组糖尿病大鼠间胰岛素水平和体重无明显差异;移植MSCs未使MSCs和MSCs＋CsA组胰岛中增殖细胞明显增多。结论通过左心室注入的大鼠MSCs可以迁移到损伤的胰腺组织中,植入的MSCs使糖尿病大鼠的血糖下降不显著,不能证明能分化为可分泌胰岛素的细胞,也未促进胰岛细胞增殖;在胰岛损伤高峰期移植细胞,很难达到治疗的目的。     

利拉鲁肽诱导骨髓间充质干细胞定向分化及移植治疗1型糖尿病大鼠的研究

目的 体外研究利拉鲁肽诱导骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）分化为胰岛素分泌细胞（IPCs）,并在体内进一步观察IPCs移植对1型糖尿病（T1DM）大鼠的治疗作用.方法 （1）体外采用密度梯度离心联合差壁培养法分离、纯化大鼠BM-MSCs,进一步分为未诱导组、高糖＋尼克酰胺诱导组、胰高血糖素样肽1（GLP-1）诱导组和利拉鲁肽诱导组;（2）倒置显微镜下观察各组细胞形态变化,双硫腙染色鉴定诱导后细胞,荧光定量PCR检测巢蛋白（Nestin）、胰十二指肠同源盒1（PDX-1）、葡萄糖转运蛋白2（Glut-2）、葡萄糖激酶（GK）、胰岛素和胰高血糖素等基因,细胞免疫荧光检测胰岛素和胰高血糖素等蛋白;（3）将180 ～ 220 g的30只雄性SD大鼠以60 mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素制备T1DM模型,造模成功后按随机数字表法分为对照组（T1DM组,n=8）、未诱导的BM-MSCs移植组（BM-MSCs组,n=9）和经利拉鲁肽诱导的BM-MSCs移植组（LIRA＋ BM-MSCs组,n=9）,给予相应干预8周,待血糖基本稳定后,选取4只正常、同龄、雄性SD大鼠作为对照,行腹腔注射的葡萄糖耐量试验（IPGTT）进一步观察移植后细胞对高糖刺激的反应性.结果 （1）利拉鲁肽诱导后BM-MSCs形态逐渐变圆,呈明显的聚集性生长状态,双硫腙染色为阳性;与高糖＋尼克酰胺诱导组比较,利拉鲁肽诱导组细胞Nestin mRNA表达下调（0.003 8±0.000 4比0.007 5±0.003 0,P＜0.05）,胰岛素（0.000 20±0.000 03比0.000 08±0.000 02）和胰高血糖素（0.001 1±0.0004比0.000 7±0.000 1）等mRNA表达上调（F=7.26、10.06、4.92,均P＜0.05）,PDX-1、Glut-2、GK mRNA表达亦上调;利拉鲁肽诱导组和GLP-1诱导组细胞胰岛素或胰高血糖素蛋白表达均呈阳性.（2）体内实验示,与T1DM组比较,LIRA＋ BM-MSCs组和BM-MSCs组大鼠8周末血糖均明显降低[分别为（28.0±1.2）、（8.9±1.1）、（14.5±0.9）mmol/L,F=719.61,均P＜0.05];IPGTT提示移植IPCs后的大鼠血糖在30 min时升至峰值,150 min时降至空腹水平,血糖变化曲线与正常组类似.结论 体外利拉鲁肽可以在一定程度上促进BM-MSCs分化成为IPCs,且移植后的IPCs能够在体内进一步发挥降糖作用.     

小鼠多能干细胞诱导的功能性胰岛素分泌细胞对1型糖尿病小鼠的治疗作用研究

目的探讨小鼠多能干细胞(iPSCs)经改良7步法诱导生成胰岛素分泌细胞(ISCs)的可行性及其对T1DM小鼠的治疗作用。方法分离和提取小鼠胚胎成纤维细胞,通过体外诱导构建小鼠i PSCs。小鼠iPSCs经改良的7步诱导法转化为小鼠ISCs。免疫荧光检测小鼠ISCs的胰十二指肠同源盒1(PDX-1)、胰岛素和C-P表达。流式细胞术检测小鼠ISCs的C-P表达以评估小鼠ISCs的分化率。ELISA法检测高浓度(23.3 mmol/L)和正常浓度(5.5 mmol/L)葡萄糖刺激下小鼠ISCs的胰岛素分泌水平。将小鼠ISCs移植到T1DM模型小鼠左肾包膜下,ELISA法检测小鼠血糖和胰岛素分泌水平。结果小鼠iPSCs经7步法诱导生成小鼠ISCs的PDX-1、胰岛素和C-P免疫荧光检测阳性;流式细胞术结果显示,小鼠ISCs的分化率为35.2%。ELISA结果显示,与小鼠iPSCs比较,小鼠ISCs在5.5、23.3 mmol/L葡萄糖浓度下的胰岛素分泌水平均升高[(0.82±0.49)vs(9.45±1.32)mIU/L,(2.38±0.67)vs(27.86±3.45)mIU/L,P<0.05];在小鼠ISCs中,23.3 mmol/L葡萄糖浓度胰岛素分泌水平高于5.5 mmol/L葡萄糖浓度[(27.86±3.45)vs(9.45±1.32)mIU/L,P<0.05]。小鼠ISCs移植后第3~12周,ISCs组血糖水平降低(P<0.05或P<0.01),胰岛素分泌水平升高(P<0.05或P<0.01)。结论小鼠iPSCs经改良的7步诱导法可有效转化为成熟的小鼠ISCs,且小鼠ISCs对T1DM小鼠有降低血糖、提升胰岛素分泌水平的作用。     

异基因骨髓间充质干细胞对类风湿关节炎患者淋巴细胞的影响

目的 探讨在体外环境中,异基因骨髓间充质干细胞(BMSCs)对类风湿关节炎(RA)患者T、B淋巴细胞的增殖和功能成熟的影响.方法 采集健康供者的骨髓标本,经密度梯度离心分离、纯化获得其BMSCs,进行体外培养扩增.同时采集RA患者的外周血,分离单个核细胞.将来源于健康供者的BMSCs与来源于RA患者的单个核细胞在体外进行共培养,同时分别加入T淋巴细胞和B淋巴细胞刺激物.分别检测异基因BMSCs对RA患者T、B淋巴细胞增殖的影响;正常BMSCs对RA患者T淋巴细胞增殖周期和凋亡的影响;BMSCs对RA患者外周血T淋巴细胞CD3、CD4、CD8、CD25表达的影响;以及BMSCs对B细胞分泌IgG的影响.结果 正常骨髓来源的BMSCs对RA患者T、B淋巴细胞增殖均有抑制作用,并且这种抑制作用与BMSCs的剂量呈依赖性;与BMSCs共培养组的T细胞主要处于G0/G1期,而进入细胞增殖周期的细胞比例减少,同叶与BMSCs共培养组的凋亡比例(15.2±0.6)%明显低于单纯T细胞活化组(28.2±1.8)%;与BMSCs共培养后CD3+CD4+T细胞表达阳性率(34±6)较对照组(44±7)降低(P<0.05),CD25+的表达下降,但CD4+CD25+调节性T细胞数(4.9±2.3)增加(P<0.05).在SAC刺激下,健康人BMSCs与RA患者外周血淋巴细胞共培养后IgG分泌升高.结论 异基因BMSCs对RA患者T、B淋巴细胞的增殖和功能成熟均有影响,BMSCs可能在RA发病和病情进展中起一定的作用,同时证明利用MSCs来调节RA的免疫功能紊乱进行生物治疗是可行的.     

应用犬骨髓间充质干细胞体外构建组织工程心脏瓣膜的实验研究

目的:将犬骨髓间充质干细胞（BMSCs）分离、自然扩增后,体外与去细胞猪主动脉瓣复合构成组织工程瓣膜（TEHV）,观察其生长情况,以评价其作为组织工程心脏瓣膜种子细胞的可行性。方法:采用密度梯度离心及贴壁筛选法分离犬的BMSCs,培养扩增,用免疫组化的方法进行鉴定;采用本实验室方法构建的生物材料———去细胞猪主动脉瓣为支架,种植犬的BMSCs,静态培养710 d;进行组织学切片及扫描、透射电镜观察,并进行机械力学性能检测。结果:分离的BMSCs细胞免疫组化显示SH2、V im entin、α-SMA（+）,CD34、VIII因子、Lam in in（-）,生长扩增能力强,2周内经3代培养即可扩增到（5.57±0.34）×107细胞数量级;组织工程瓣组织学示活组织和细胞外基质（extracellu larm atrix,ECM）形成;扫描电镜见细胞贴附均匀,透射电镜可见分泌活性的肌纤维细胞样细胞（含actin/myosin纤维、胶原纤维、弹性蛋白）;机械力学性能得到保留。结论:使用本方法可以构建成功组织工程心脏瓣膜;BMSCs与去细胞猪主动脉瓣的相容性良好,可以作为种子细胞之一。     

Transfection of bone marrow mesenchymal stem cells using green fluorescence protein labeled hVEGF165 recombinant plasmid mediated by liposome

ObjectiveTo study the role of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in construction of vascularized engineered tissue.MethodshVEGF165 was amplified via RT-PCR before recombinant with pShuttle- green fluorescence protein;green fluorescent protein (GFP)-CMV. Then the recombinant shuttle plasmid was transfected into BMSCs with Lipofectamine^TM 2000 for packaging and amplifying. hVEGF165 mRNA expression in BMSCs cells was tested. Results: The sequence of hVEGF165 in pShuttle-GFP-hVEGF165 plasmid was confirmed by double-enzyme cleavage method and sequencing. hVEGF165 was highly expressed in BMSCs.ConclusionsThe GFP/hVEGF165 recombinant plasmid vector was constructed successfully and expressed effectively in host cells, which may be helpful for discussing the possibility of the application of VEGF165-BMSCs in tissue engineering and ischemic disease cure.