大鼠睾丸间质细胞体外培养不同时间3β-羟基类固醇脱氢酶的表达

目的探讨通过差速贴壁法获得的7天龄、3周龄大鼠睾丸间质内细胞的细胞群体构成、体外培养不同时间3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）的表达水平变化,以及细胞睾酮分泌功能变化。方法联合应用胶原酶消化、不锈钢滤网过滤及差速贴壁法获得7天龄、3周龄雄性Wistar大鼠睾丸间质组织内细胞,贴壁细胞以DMEM/F12培养液培养,分别对原代培养2h、4d细胞进行3β-HSD免疫化学染色及流式细胞分析,原代培养细胞同时给予人绒毛膜促性腺激素（HCG）刺激,测定HCG刺激组和非刺激组各代细胞培养液上清中睾酮水平及其对HCG刺激的反应。结果7天龄、3周龄鼠差速贴壁法获得的睾丸间质内细胞群经流式细胞鉴定,3β-HSD阳性细胞所占比例分别为（5.4±1.2）%、（59.2±3.2）%;培养4d后,两组3β-HSD阳性细胞比例分别为（93.6±1.2）%、（95.4±3.2）%。两组原代培养细胞均有睾酮生成功能,在HCG刺激下睾酮分泌均明显上升,7天龄组培养细胞睾酮分泌高峰迟于3周龄组。结论差速贴壁法获得的7天龄、3周龄大鼠睾丸间质细胞群中均含有部分Leydig干细胞（Stem Leydig cells,SLCs）,SLCs在体外培养过程中逐渐分化,表达3β-羟基类固醇脱氢酶,并产生睾酮。     

简易快速获得大量高纯度大鼠Leydig细胞

目的 建立一种简易快速获得高纯度睾丸间质内莱迪希(Leydig)细胞的分离方法.方法 联合应用复合胶原酶消化、400目(30 μm)不锈钢滤网过滤和差速贴壁法获得雄性Wister大鼠睾丸间质内的Leydig细胞.分离细胞经3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)特异性酶学染色、免疫细胞化学检测和流式细胞学进行细胞表型鉴定和纯度分析.将分离细胞进行原代及传代培养,部分细胞同时给予人绒毛膜促性腺激素(HCG)刺激,观察传代后细胞生长情况,并测定HCG刺激组和非刺激组各代细胞培养上清睾酮水平,评价分离细胞的增殖能力、睾酮分泌功能及对HCG的反应.有血清和无血清2种条件培养液培养原代分离细胞,倒置相差显微镜及电镜观察细胞老化和凋亡状况,优化Leydig细胞的培养条件.结果 应用差速贴壁方法每克睾丸组织(湿重)可获得Leydig细胞(1.5±0.8)×106个,3β-HSD特异性酶学染色、免疫细胞化学检测均呈阳性反应.流式细胞学检测证实3β-HSD阳性细胞率为(95.2±3.7)%.传代后未见明显的细胞增殖,但仍可检测到3β-HSD表达.原代及传代细胞均具有睾酮生成功能,HCG刺激后睾酮分泌水平均明显上升,但原代细胞一定水平的睾酮分泌可持续6 d以上,传代后细胞仅持续48 h.结论 应用差速贴壁法可以获得大量高纯度有活性的Leydig细胞,并可以进行传代培养,且传代前后短期内均可分泌睾酮.该方法简单易行,细胞得率高.     

睾丸Leydig干细胞分离、纯化及鉴定的体外研究

目的 改进Leydig干细胞的分离及纯化方法,观察其生物学特性并进行鉴定.方法　通过胶原酶消化、差速贴壁法及双抗体免疫磁珠分选法,从大鼠睾丸内获得Leydig干细胞.以条件培养液进行培养,采用CCK法测定增殖能力.通过PDGFRα、LIFR及3β-HSD免疫组织化学染色鉴定Leydig干细胞.经定向诱导分化后,检测Leydig细胞的睾酮分泌能力.结果　每个睾丸约可获得83 000个干细胞,经免疫组织化学染色分析,PDGFRα阳性率为(98.0±0.8)％.在条件培养液中培养的SLCs增殖明显,在1个月内能稳定维持其干性而未向Leydig细胞系分化.免疫组织化学染色结果表明,PDGFRα、LIFR阳性表达,3β-HSD为阴性表达.Leydig干细胞在含有T3和HCG的培养液中培养后,第5天即可测到睾酮分泌,分化后的细胞3β-HSD+.结论　 由差速贴壁法及双抗体免疫磁珠分选法能获得纯化的PDGFRα+/LHRˉ细胞,这些细胞符合SLCs所必须具有的特征.采用该方法获取SLCs,操作简便,细胞损伤小并且获取纯度高.     

人脐带间充质干细胞在大鼠睾丸间质内向Leydig细胞分化的实验研究

目的:研究人脐带间充质干细胞(HUMSCs)在大鼠睾丸间质内向Leydig细胞分化的可行性。方法:贴壁法获得HUMSCs,分别通过流式细胞表面抗原染色与三系分化验证其纯度与多向分化能力,用CM-Dil标记HUMSCs后将其移植入大鼠睾丸间质内,并在移植后4周与8周对大鼠睾丸进行免疫荧光染色观察HUMSCs的存活与分化情况,移植后8周获得大鼠睾丸细胞悬液,通过流式细胞染色检测HUMSCs表达Leydig细胞标志物3β-HSD判断细胞分化的效率,通过流式细胞分选获得悬液内CM-Dil标记的在睾丸内分化后的HUMSCs,并对其进行培养,培养3 d后收集培养液,检测其睾酮水平。结果:Leydig细胞标志物CYP11a1在HUMSCs移植8周后有表达,而在移植4周后未见表达。3β-HSD流式染色显示其分化效率约为14.5%,流式细胞分选后细胞可存活,且其培养液内能检测出睾酮。结论:HUMSCs在大鼠睾丸间质内可向Leydig细胞分化。     

大鼠睾丸Leydig细胞的培养和鉴定

目的:研究体外培养大鼠睾丸Leyd ig细胞的有效方法。方法:原代培养大鼠睾丸Leyd ig细胞,用4 U/m l人绒毛膜促性腺激素(hCG)作用细胞,对照组未用hCG,放射免疫法测定培养液中睾酮浓度,3β羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)免疫组化染色观察睾丸Leyd ig细胞形态和生物学特性。结果:培养细胞成分均一、增殖旺盛、分化率高。接种72 h后大鼠睾丸Leyd ig细胞纯度达95%。接种后24 h内,hCG刺激组较对照组睾酮分泌量明显提高(P<0.05)。结论:体外培养的睾丸Leyd ig细胞可分泌高浓度的睾酮;睾丸Leyd ig细胞的纯化和培养方法的建立,可为中老年男性雄激素部分缺乏综合征睾酮替代治疗的基础和临床研究提供一条可行的思路。     

体外诱导人脂肪干细胞向Leydig细胞定向分化的研究

目的:探讨体外诱导脂肪干细胞(ADSCs)向Leydig细胞分化的可能性和条件。方法:应用I型胶原酶消化法分离人皮下脂肪组织中ADSCs,原代培养,适时传代。免疫组化方法检测波形蛋白的表达。以人绒毛膜促性腺激素(hCG)不同浓度及不同作用时间进行诱导后,实时荧光PCR检测类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)基因的表达。MTT法测定hCG诱导下的细胞增殖情况。在hCG、DMSO诱导1周后行3β-HSD免疫组化染色,并采用放射免疫法检测其培养上清及细胞裂解液的睾酮水平。结果:ADSCs增殖迅速,ADSCs波形蛋白呈黄褐色阳性表达;ADSCs中StAR基因的表达在一定范围内与hCG诱导浓度的增加成正相关,hCG 10 U/ml达到高峰,该浓度诱导1周内StAR表达随时间延长而增加;hCG诱导增加ADSCs细胞增殖;hCG 10 U/ml、DMSO 3.2×10-6mol/L条件下诱导1周后细胞中3β-HSD免疫组化染色可见胞质呈浅褐色弱阳性,且该条件下细胞裂解液睾酮测定值明显高于其它组。结论:①hCG在一定范围内促进ADSCs的StAR基因表达;②hCG可以促进ADSCs增殖;③在hCG 10 U/ml、DMSO 3.2×10-6mol/L诱导下,人ADSCs有向Leydig细胞分化的可能。     

非酶糖基化终末产物抑制大鼠睾丸Leydig细胞睾酮的生成

目的:研究非酶糖基化终末产物受体(RAGE)在大鼠睾丸Leydig细胞上的表达及非酶糖基化终末产物(AGEs)对大鼠睾丸Leydig细胞睾酮合成的抑制作用。方法:原代培养大鼠睾丸Leydig细胞,RT-PCR和免疫荧光技术检测RACE在大鼠Leydig细胞上表达,不同浓度AGEs处理Leydig细胞(25、50、100、200μg/ml),ELISA法测定睾酮分泌量。结果:RT-PCR和免疫荧光结果表明RAGE在大鼠睾丸Leydig细胞上表达,不同浓度AGEs处理后,人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导的Leydig细胞睾酮合成量呈剂量浓度依赖性下降,与对照组相比,50、100、200μg/ml AGEs处理组差异显著(P0.01)。结论:大鼠Leydig细胞上存在RAGE受体,AGEs显著抑制原代培养大鼠Leydig细胞睾酮的分泌。     

大鼠睾丸间质细胞的原代培养、鉴定与功能监测

目的:采用改良方法对大鼠睾丸间质细胞进行分离、纯化和原代培养,以得到更高纯度和稳定的间质细胞原代培养体系。方法:采用酶消化法分离大鼠睾丸间质细胞,再用Percoll连续密度梯度离心除去生精细胞、支持细胞等杂细胞,实现进一步纯化;用3β-HSD特异性染色法鉴定间质细胞,同时采用放射免疫法测定间质细胞睾酮分泌活性。结果:培养的间质细胞纯度达到95%以上,每个睾丸可获取间质细胞约1×106个;通过3β-HSD特异性染色鉴定,该间质细胞胞质呈蓝黑色,而且细胞具有分泌睾酮的活性。结论:酶消化后以Percoll连续密度梯度离心可分离得到高纯度且具有睾酮分泌活性的间质细胞,操作简单易行,实验方法稳定。     

ATP50荧光表达载体构建及其在TM3小鼠睾丸Leydig细胞定位研究

目的:构建ATP50的荧光表达载体,研究其在原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞中的表达和在TM3小鼠睾丸Leyd ig细胞中的定位。方法:原代培养小鼠睾丸Leyd ig细胞并利用3β-HSD染色法鉴定,应用PCR方法研究ATP50在小鼠睾丸Leyd ig细胞中的表达。利用BamH I和EcoR I酶切位点把ATP50克隆到pEYFP-N1。细胞转染和细胞荧光显微镜技术观察YFP-ATP50在TM3小鼠睾丸Leydig细胞的定位。结果:ATP50表达在原代培养的小鼠睾丸Leydig细胞中。TM3小鼠睾丸Leydig细胞中,绿色荧光的YFP-ATP50和红色荧光的线粒体标记物M ito-tracker有完全的共定位。结论:ATP50在小鼠睾丸Leydig细胞表达,成功构建了ATP50真核荧光蛋白表达载体,明确YFP-ATP50定位在Leydig细胞的线粒体。这些结果将对老年男性睾丸间质细胞睾酮合成功能障碍的研究提供重要的信息,有利于进一步深入研究。     

Cox7a2对睾酮合成及StAR、P450scc和3β-HSD蛋白表达影响研究

目的研究Cox7a2在TM3小鼠睾丸Leyidg细胞中过农达对LH诱导的睾酮合成及对StAR(睾酮合成调节关键蛋白),P450scc(胆同醇侧链裂解酶),3β—HSD(3β-羟基甾脱氢酶)蛋白表达的影响。方法构建Cox7a2荧光表达载体,转染TM3小鼠睾丸Leydig细胞,融合蛋白表达及LH诱导刺激后,ELISA测定细胞上清液中睾酮含量,Western blot检测StAR蛋白、P450scc和3β-HSD酶的表达变化。结果Cox7a2在TM3小鼠睾丸Leydig细胞中过表达抑制LH诱导的睾酮合成,降低StAR蛋白的表达,对P450scc和3β-HSD的蛋白表达没有明显影响。结论在TM3小鼠睾丸Leydig细胞中,Cox7a2至少通过抑制类固醇快速调节蛋白StAR的表达,进而抑制LH诱导的睾酮合成。     

植物雌激素对体外培养的大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮的作用

目的:研究植物雌激素(大豆苷元、染料木素)对睾丸间质细胞分泌睾酮的刺激作用,并初步研究其可能的分子作用机制。方法:采用Percoll不连续密度梯度离心,分离获得3月龄Sprague-Dawley(SD)大鼠的睾丸间质细胞。以人绒毛膜促性腺激素(hCG)为阳性对照药物,测定不同浓度(0、0.02、0.1、0.5、1、5μmol/L)大豆苷元、染料木素对睾丸间质细胞分泌睾酮的影响。RT-PCR检测睾酮生物合成过程中胆固醇侧链裂解酶细胞色素P450(P450scc)的表达。结果:0.1μmol/L的染料木素能显著刺激原代大鼠睾丸间质细胞的睾酮分泌,RT-PCR结果显示染料木素能显著上调睾酮合成过程中P450sccmRNA的表达。在较高浓度下(5μmol/L),大豆苷元和染料木素均能抑制睾丸间质细胞分泌睾酮。结论:染料木素在低浓度下(0.1μmol/L)显著促进睾丸间质细胞分泌睾酮,但随着浓度的增加(5μmol/L),大豆苷元和染料木素均显著抑制Leydig细胞的睾酮分泌。     

BALB/c小鼠精原干细胞体外长期培养和鉴定

目的:建立小鼠精原干细胞长期培养体系,探讨精原干细胞体外增殖分化的关键因子。方法:收集出生4~6 d BALB/c绿色荧光小鼠睾丸,采用改良的两步消化法获得细胞悬液,种植到铺有明胶的培养皿中,分别于种植后1、5、24 h通过差速贴壁法去除体细胞,获得高度纯化的精原干细胞,种植到丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养。基础培养液为StemPro-34SFM干细胞培养液并补充15种添加成分;添加20 ng/ml大鼠胶质细胞源神经营养因子(GDNF)、10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和200 ng/ml DDNF受体α1(GFRα1)促进精原干细胞增殖。分别采用免疫荧光染色和RT-PCR检测精原干细胞已知抗原和标志性基因的表达。结果:饲养层上培养3~4 d后精原干细胞增殖形成典型的克隆,为边缘不清楚的团块状;小鼠精原干细胞能在该培养体系中稳定传代培养达3个月。免疫荧光共聚焦显微镜观察示Oct-4特异性表达在培养的精原干细胞核上;而GFRα1显著表达在培养的精原干细胞膜表面;RT-PCR也证实培养的精原干细胞表达Oct-4、GFRα1、Sox2和c-Ret等象征未分化精原细胞的标志基因。结论:BALB/c小鼠精原干细胞可在体外长期培养(3个月),该培养体系的建立将为研究精原干细胞增殖分化调控机制及精原干细胞移植治疗男性不育奠定基础。     

小鼠胚胎睾丸Leydig细胞培养、纯化及其功能研究

目的:探讨小鼠胚胎睾丸Leyd ig细胞体外培养、鉴定、纯化的方法,并进行形态学观察、分泌睾酮能力等生物学特性检测。方法:选择胎龄16 d的胎鼠睾丸,0.03%胶原酶Ⅰ消化,3β-羟基类固醇脱氢酶(HSD)染色鉴定及纯度测定,锥虫蓝染色检测细胞活率。放免法测定Leyd ig细胞不同培养时间及密度下分泌睾酮的水平。结果:Leyd ig细胞培养前和培养72 h后纯度分别为(45.10±1.66)%和(81.17±2.32)%;培养液中可检测到睾酮,睾酮水平与Leyd ig细胞数、培养时间相关,单个Leyd ig细胞睾酮分泌能力逐日下降。结论:该法分离的胚胎Leyd ig细胞纯度较高,生长性好,保持增殖和分泌睾酮的生物学特性,可应用于相关的研究。     

睾酮对体外培养小鼠精原干细胞增殖与分化的影响

目的：探讨睾酮对体外培养小鼠精原干细胞增殖与分化的影响。方法：采用Percoll密度梯度分离及差速贴壁法纯化精原干细胞,用免疫荧光染色及流式细胞检测对小鼠精原干细胞进行鉴定。设置实验组和对照组,两组均以支持细胞作为饲养层培养精原干细胞,在实验组DMEM／F12完全培养液中添加睾酮。用酶联仪检测细胞的生长情况;用流式细胞仪对细胞生长周期进行判断;采用ICSI技术让精子细胞与卵母细胞结合,观察卵裂细胞数,体外培养3天后进行染色体形态与数量分析。结果：在添加睾酮的培养基中培养的精原干细胞,其OD值增长较快（P〈0．05）;精原干细胞DNA合成期（S期）的含量增多（P〈0．05）;精子细胞与卵子结合以后可得到二倍体配子。结论：睾酮能促进精原干细胞的体外增殖与分化。     

GnRH通过ERK途径来调控大鼠睾丸间质细胞类固醇激素的合成

GnRH是由下丘脑神经元分泌,且在脊椎动物生殖功能中非常的必要。GnRH还被发现存在于脑以外的组织中,在睾丸间质细胞的炎阎醇激素合成过程中发挥了重要的作用。然而,信号通路对其的调节作用仍然不清楚。本研究我们主要检测MAPK信号通路是否参与GnRH激动剂（GnRHa）诱导的雄激素的合成。我们建立了间质细胞的原代培养的方法。不同浓度GnRHa刺激间质细胞不同时间后3D—HSD和苇酮的量通过RT-PCR,Westernblot和RIA测定。在MAPK抑制剂PD-98059存在或不存在的情况下,我们也通过Westernblot的方法检测GnRHa对ERK1／2,JNK和p38的作用。结果显示GnRHa诱导睾酮的合成并且上调3β-HSDmRNA水平以及蛋A水平,同时也激活了ERK1／2水平,但是对JNK和p38的活化没有作用。虽然GnRHa最佳的浓度是100nmnol L-1,最佳时间是24h,但是GnRHa~]激细胞5min后ERK1／2活化作用达到最高水平,60min之内恢复到本地水平。而PD-98059则能完全阻滞ERKl／2活化,3β-HSD的上调以及睾酮合成。我们的数据显示GnRH通过ERK途径来调控大鼠睾丸间质细胞雄性激素的合成。GnRH对ERK1／2的活化诱导了3β—HSD基因和蛋白的表达,最终调节大鼠间质细胞类固醇激素的合成。     

Regulation of testosterone production in the adjuvant-induced arthritic rat.

Serum testosterone concentrations are reduced in men with rheumatoid arthritis and in rats with adjuvant-induced arthritis, a common model for rheumatoid arthritis. To understand the mechanism responsible for this reduction, testosterone production by testicular cells and Percoll-purified Leydig cells from nonarthritic and arthritic rats was studied. Leydig cells in crude interstitial cell preparations from arthritic rats secreted significantly less testosterone in response to human chorionic gonadotropin (hCG) stimulation than cells from nonarthritic animals. In contrast, no differences in hCG and dibutyryl cyclic adenosine monophosphate-stimulated testosterone production by Percoll-enriched Leydig cells from arthritic and nonarthritic animals were observed. To determine whether a secretory product from testicular macrophages was important to this reduction, macrophages from arthritic and nonarthritic animals were cultured. The conditioned media from these cultures were added to cultures of interstitial cells from nonarthritic animals. Nonarthritic rat testicular macrophage-conditioned medium had no significant effect on testosterone production. In contrast, conditioned medium from arthritic rat testicular macrophages significantly reduced testosterone production. These results suggest that testicular macrophages secrete a factor that may be important in the regulation of testosterone production in the adjuvant-induced arthritic rat.     

Characterization of functional Leydig cells after purification on a continuous gradient of percoll

Two human chorionic gonadotropin (hCG) responsive cells from rat testicular interstitium were previously isolated on a discontinuous gradient of Percoll. The light cells were non-steroidogenic and bound 125I-labeled hCG with high affinity (Kd 3.0 x 10(-10) mol/L), whereas the steroidogenic heavier cells (Leydig cells) produced cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and testosterone in response to hCG stimulation with very little hCG binding. In that study, the heavier cell fraction was contaminated with germ cells, red blood cells, and other cells. These cells have now been further purified on a continuous gradient of Percoll (20 to 60%, v/v), and have resolved into three visible bands. The cells in subfraction I, predominantly damaged Leydig cells, germ cells, and/or residual light cells, bind 125I-labeled hCG with high affinity (Kd 4.09 x 10(-10) mol/L) without producing cAMP and testosterone in response to hCG. Subfraction III consists mainly of red blood cells. The cells in subfraction II, identified as typical Leydig cells by electron microscopy, produce cAMP and testosterone in response to hCG but, again, bind only a small amount of hCG (4.5 +/- 0.3 fmol/2 x 10(6) cells/250 microliters/per hour at 37 degrees C). Thus, further purification of the heavier cell fraction from a discontinuous gradient of Percoll on a continuous gradient of Percoll yields Leydig cells, free of contaminating germ cells and red blood cells, which actively produce cAMP and testosterone with a very low level of hCG binding, the affinity of which is undetectable by current binding techniques.