137Csγ射线慢性照射诱导大鼠外周血GADD45A基因表达变化的研究

目的 探讨长期慢性照射条件下辐射诱导的大鼠外周血GADD45 A基因的表达变化.方法 将SD大鼠置于137 Cs放射源下累积照射,吸收剂量分别为0.05、0.1、0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、1、2、3 、4和5Gy,照射完成组禁食2h后腹主动脉采血,利用实时荧光定量PCR检测外周血GADD45 A基因的表达...     

^60Coγ射线诱发人外周血GADD45A基因表达的变化研究

目的探讨电离辐射诱导人外周血GADD45A基因的表达变化,为寻找急性照射条件下辐射损伤早期诊断标志物提供实验依据。方法采集无急慢性疾病、不抽烟、年龄在26～29周岁的3名男性非放射性工作者外周血各10ml,分为10组,每组1ml。利用中国辐射防护研究院。^60Co照射装置对采集的血样分组照射,剂量率为0．313Gy／min。吸收剂量分别为0．05、0．1、0．2、0．4、0．6、0．8、1、2和3Gy,照射后的人外周血于37℃培养箱中静置2h后提取RNA,利用实时荧光定量PCR技术对外周血GADIM5A基因进行检测。结果实时荧光定量PCR检测结果表明各剂量组与对照组相比,其基因表达均有显著变化。0．05～0．6Gy剂量组与对照组相比基因表达下调,其中0．05～0．2Gy之间,随着照射剂量的增加,基因表达量逐渐降低;0．2～0．6Gy之间,随着照射剂量的增加基因表达量又逐渐增加。0．8Gy时,基因表达量增幅较大,高于对照组和1Gy剂量组。1～3Gy剂量组基因表达量均高于对照组,且随着剂量增大,表达量增加,具有明显剂量相关性。结论电离辐射可以诱导人外周血GADD45A基因的差异表达,1～3Gy之间具有明显剂量相关性。0．05～0．2Gy之间外周血淋巴细胞表现出辐射刺激效应。     

实时定量聚合酶链反应与巢式聚合酶链反应在101例白血病融合基因检测中的比较

目的探讨实时定量聚合酶链反应与巢式聚合酶链反应在白血病融合基因检测中的价值并进行比较。方法对101例白血病患者分别应用定时定量PCR法和巢式PCR法进行融合基因的检测,主要包括BCR/ABL、PML/RARa及AML1/ETO三类,并结合病人骨髓细胞形态学及临床表现予以分析。结果 RT-PCR和nPCR对融合基因的检出率比较:40例慢性粒细胞白血病患者中,RT-PCR与nPCR检测BCR/ABL融合基因阳性率分别为91.2%和88.4%;21例急性淋巴细胞白血病患者中,RT-PCR与nPCR检测BCR/ABL融合基因阳性率分别为41.2%和35.5%;26例急性早幼粒细胞白血病患者中,RT-PCR与nPCR检测PML/ARa融合基因阳性率分别为66.4%和61.2%;14例急性粒细胞白血病M2患者中,RT-PCR与nPCR检测AML/ETO融合基因阳性率分别为49.3%和31.2%。结论定时定量PCR较巢式PCR有更强的敏感性、更为准确,另外RT-PCR可以提高微小残留病的检出率,对临床早期干预治疗具有重要价值。     

健康人周围全血线粒体DNA 4 977 bp缺失的实时定量聚合酶链反应检测

目的 了解健康人周围全血线粒体DNA(mtDNA)4 977 bp缺失(△mtDNA4977)情况.方法 采集60名年龄20～80岁的健康人周围血,用实时定量聚合酶链反应(PCR)方法 检测△mtDNA4977和总mtDNA(mtDNAtotal)的量并进行分析.结果 在60名健康人周围血样品中,△mtDNA4977研的检出率为45%(27/60),△mtDNA4977率在0%～3.076×10-5%,年龄和性别不影响△mtDNA4977水平(P>0.05).结论 在健康人周围血中,△mtDNA4977水平较低,且未显示出年龄依赖性累积现象.     

利用基因表达改变估算电离辐射生物剂量的研究进展

随着核能和核技术在国防及医学诊断、治疗等领域应用的不断扩展,辐射可能对人类造成的危害也越来越多。作为辐射损伤救治的重要依据,辐射剂量的准确估算对辐射损伤的诊断和治疗有重要的指导作用,在可能受到职业辐射的正常群体,生物剂量的估算还能对其健康状况进行更加深入的评价。现有的辐射生物剂量估算方法有以下几种:染色体畸变分析、淋巴细胞微核检查、血型糖蛋白A(GPA)基因突变分析、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因突变分析以及单细胞凝胶电泳技术分析DNA双链断裂等。上述几种方法是临床应用比较多,也比较成熟的方法,但也都…     

立氏立克次体实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立

目的采用TaqMan-MGB探针建立立氏立克次体实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测方法.方法依据立氏立克次体外膜蛋白B基因序列设计引物和探针,以克隆的ompB基因片段为DNA模板,在ABI 7900型荧光定量PCR检测仪上建立实时荧光定量PCR检测方法.结果建立的定量标准曲线Ct值与模板拷贝数呈线性关系（R2=0.996）,最低检测浓度为5拷贝/μl;用荧光定量PCR方法检测其他相关立克次体和常见非立克次体病原菌,检出结果均为阴性.用该方法检测立氏立克次体感染的豚鼠血液标本、小鼠脾脏标本及细胞培养标本,检测的结果与立氏立克次体感染相关.结论研究建立的检测立氏立克次体实时荧光定量PCR方法具有高特异性和高敏感性,适用于快速检测各种样本中的立氏立克次体和立氏立克次体感染早期的实验室诊断.     

实时荧光定量PCR检测胃癌组织Twist基因的结果分析

目的分析实时荧光定量PCR检测胃癌组织Twist基因的临床意义。方法用实时荧光定量PCR的方法检测正常胃黏膜、胃癌原发灶、胃癌转移灶组织中TwistmRNA的表达含量。并以Twist基因和18stRNA含量的比值作为评价Twist表达水平的指标,组间进行配对t检验。结果Twist／18stRNA（10g比值）正常组为0．139±0．003;原发组为0．304±0．046;转移组为0．654±0．015。原发性胃癌组织及转移组织中Twist基因表达水平与正常胃黏膜组织比较,差异有统计学意义（P〈0．05）;转移组与原发组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论Twist基因在正常胃黏膜组织中表达量较低,在胃癌及其转移组织中表达水平较高,而且Twist基因的表达水平与胃癌转移程度存在一定相关性。可以辅助诊断和观察胃癌术后疗效。     

实时荧光定量PCR法检测RNA干扰后的GES-1细胞中MYCT-1基因的表达

目的建立MYCT-1基因的实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative-PCR,RFQ-PCR)检测方法,检测RNA干扰(RNA interference,RNAi)后GES-1细胞中MYCT-1mRNA的表达水平,探讨不同剂量siRNA对MYCT-1基因的沉默效果。方法取5×104对数生长期GES-1细胞,分别转染1μg、2μg、4μg siRNA。转染第4天分别收集细胞提取总RNA,合成cDNA并进行RFQ-PCR检测,以未转染组作为对照。结果加入1μg、2μg组MYCT-1表达量分别降低19.4%和55.2%,加入4μg siRNA组细胞死亡。结论成功建立了MYCT-1基因的RFQ-PCR检测方法。加入2μg siRNA,脂质体与siRNA比例为4:1时,可使GES-1细胞中MYCT-1表达降低55.2%,为最佳实验条件。     

实时荧光定量PCR检测特殊人群中HCV-RNA的研究

[目的]探讨HCV在特殊人群中的流行和干扰素治疗效果对HCV-RNA含量的影响。[方法]收集223份抗-HCV阳性血清并跟踪观察和用荧光定量实时荧光定量PCR法检测HCV-RNA的含量。[结果]在141份抗-HCV阳性血清中,58份实时荧光定量PCR阳性,阳性符合率为41.13%,在86份有输血史患者中39份实时荧光定量PCR阳性,阳性率为45.35%,17份有家族遗传史患者中11份实时荧光定量PCR阳性符合率为64.70%。在38例不明原因感染者中有8份实时荧光定量PCR阳性,阳性率为21.05%（χ^2=16.21Р=0.000）。58例实时荧光定量PCR阳性的病人经治疗两年后,39份有输血史患者,转阴24例,转阴率61.53%。11份有家族遗传史患者中6例转阴,转阴率54.54%。在8例不明原因感染者中有5例转阴,转阴率62.24%。[结论]不同的传染途径在RNA的含量和治疗的预后有差异。     

实时荧光定量PCR快速检测嗜水气单胞菌方法的建立

目的利用实时荧光定量PCR技术,建立一种快速、特异、灵敏、定量检测嗜水气单胞菌的方法,用于病人腹泻物或水产品病变部位目的菌的快速检测。方法以GenBank中嗜水气单胞菌WP3的溶血素基因(hlyA)为靶序列,设计引物与TaqMan探针,对模板DNA制备方法,PCR反应时间和温度进行优化,以嗜水气单胞菌ATCC7966和20株相关细菌考核检测体系的特异性、灵敏性和重复性。结果本方法检测时间仅需30min,定量线性范围5.4×103～5.4×108cfu/ml,与20株常见肠道细菌均无反应,对4个浓度的嗜水气单胞菌测定的批内标准差在0.08～0.14之间。结论成功建立实时荧光定量PCR检测嗜水气单胞菌方法,该方法可在半小时左右直接定量检测病人腹泻物或水产品病变部位中的嗜水气单胞菌,具有推广应用价值。     

疟疾的实时荧光PCR快速检测方法

目的:建立疟疾的实时荧光PCR检测方法并用于疟疾的快速检测。方法:设计了疟原虫通用型实时荧光PCR检测的引物和探针,建立了疟疾的实时荧光PCR检测方法。对40份疟疾镜检阳性样本和20份镜检阴性样本进行实时荧光PCR检测,并和巢式PCR方法检测结果进行了比较。结果:疟疾实时荧光PCR检测速度快,20分钟即可完成。40份镜检阳性样本的荧光PCR检测均为阳性,2份样本的巢式PCR结果为阴性;20份镜检阴性样本中有3份样本为实时荧光PCR阳性,其余17份样本为实时荧光PCR阴性,与疟疾巢式PCR检测结果相同。结论:该实时荧光PCR方法检测速度快,特异性强,准确性高,阳性率高,不易漏检,适用于疟疾的快速检验,这对防止该病在国境口岸的传入提供了技术依据。     

TaqMan荧光定量RT—PCR快速检测西尼罗病毒的研究

目的建立特异、快速、灵敏的TaqMan实时荧光定量聚合酶链反应（TaqMan—based Real—timePCR）用于西尼罗病毒（WNV）核酸检测，为WNV的感染诊断和流行病学监测奠定技术基础。方法根据文献公开发表的WNV核酸检测引物和TaqMan探针，优选最佳引物探针。应用DNAWorks2．4在线软件设计8条寡核苷酸片段，基于PCR合成包含引物探针扩增区域的230个核苷酸作为WNV模拟核酸。并对TaqMan-based Real—timePCR条件进行优化，验证该方法的特异性、灵敏度。结果该方法对WNV核酸检测有高度特异性，与流行性乙型脑炎、登革热1～4型等虫媒病毒均无交叉反应，对构建的DNA检测灵敏度达100拷贝／反应。结论TaqMan—based Real—timePCR是一种快速检测WNV特异、敏感的方法，适用于WNV的早期感染诊断和流行病学监测。     

2011年北京市顺义区应用实时荧光PCR检测肺炎支原体检测结果分析

目的:通过对北京市顺义区2011年肺炎支原体(mycoplasma pneumonia,MP)实时荧光PCR检测数据进行分析,为支原体肺炎早期诊断及防控工作提供科学依据。方法:采用实时荧光PCR法对肺炎病例鼻咽拭子进行MP核酸检测。采用SPSS13.0对检测结果进行统计学分析。结果:117例肺炎病例中共检出MP核酸阳性18例,阳性率为15.38%。各季节、性别之间MP阳性率差异无统计学意义。分年龄组对MP阳性率进行比较,主要感染人群在35岁以下,差异具有统计学意义。结论:青少年为MP检测阳性的重点人群。MP感染与性别、发病季节无明显关系。实时荧光PCR检测对支原体肺炎的早期诊断和临床用药具有重要意义。     

实时荧光定量PCR检测膀胱癌TWIST1基因启动子的甲基化状态

目的建立针对TWIST1基因启动子甲基化状态的荧光定量检测方法,进而评估其在膀胱癌临床研究的应用前景。方法应用实时荧光定量PCR方法检测南通地区50例确诊膀胱癌患者和25例非膀胱癌的健康对照者的尿液标本中TWIST1基因启动子的甲基化和非甲基化含量,对其甲基化率进行对比。结果正常人的TWIST1启动子的甲基化率为8.1%～17.3%,平均值为12.3%,膀胱癌患者的甲基化率为25.2%～48.3%,平均值为38.2%,膀胱癌患者的TWIST1基因启动子甲基化率有明显的增高(P<0.05)。结论 TWIST1基因启动子区在膀胱癌中异常甲基化,能够作为有效检测膀胱癌的基因。     

基于M基因构建的麻疹病毒实时荧光PCR检测技术

目的:建立麻疹病毒的实时荧光PCR检测方法并应用于临床标本的检测。方法:根据四十年来在我国流行的麻疹病毒M基因序列,设计用于病毒实时荧光PCR检测的引物和探针,建立麻疹病毒实时荧光PCR检测方法。用此法对40例麻疹的病人标本进行检测,并与血清学检测结果比较。结果:通过40例病人标本中实时荧光PCR检测,39份阳性,1份阴性,阳性率97.5%,高于血清学检测(阳性率77.5%)。结论:该方法方便快捷、特异性强、敏感性高,可用于麻疹病毒的快速诊断和分子流行病学调查。     

实时荧光定量PCR快速检测无菌性体液革兰阳/阴性细菌感染

目的　探讨将实时荧光定量PCR（qPCR）检测细菌16S rRNA基因用于快速判断无菌性体液革兰阳/阴性细菌感染,并评价其分析性能。方法　以细菌16S rRNA基因为目标设计通用引物、通用探针及革兰阴性（GN）菌探针,对14种标准菌株、20种临床菌株、白色念珠菌、乙型肝炎病毒(HBV)、人基因组及阴性对照进行qPCR检测,评价该方法引物和探针的通用性和特异性及检测限。以104 cfu/ml菌悬液、阴性对照的循环域（Ct）值99%置信区间下限分别作为尿路、其他无菌性体液细菌感染判定的分界值。用271例临床无菌性体液标本评价qPCR法的临床效能。结果　通用探针-qPCR,所有实验菌株检测为阳性。GN探针-qPCR,所有实验革兰阴性菌株检测为阳性。通用探针的检测限为1×101～1×102 cfu/ml。GN探针的检测限可低至1.0×101 cfu/ml。判定尿路、其他无菌性体液细菌感染的分界值分别为23.76、29.37。结论　应用细菌16S rRNA基因通用探针和GN探针的qPCR方法通用性好、特异性强、检测限低,可快速检测临床无菌性体液常见细菌感染,为临床提供准确、可靠的病原学诊断依据。     

TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体方法的建立

目的建立敏感、特异、定量Real-time PCR方法,用于恙虫病东方体的检测。方法根据恙虫病东方体56 kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的TaqMan-MGB探针具有良好的特异性,建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.99),灵敏性评估发现每个20μlPCR反应管中只要有26个拷贝的目的基因即可被检测到,即最低检出浓度为2拷贝/μl,并且具有较好的重复性。结论建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于恙虫病东方体感染的快速检测。     

实时荧光定量PCR测定早孕子宫蜕膜白血病抑制因子的研究

目的 :探讨白血病抑制因子 (LIF)在人类早孕蜕膜组织的表达情况。方法 :采用实时荧光定量PCR技术 ,对 36例正常早孕妇女子宫蜕膜进行定量检测。结果 :36例蜕膜组织均有LIF表达 ,表达水平中位数为 4 6 .5 0 pg/ml。结论 :人早孕期子宫蜕膜LIF基因表达可能与早期妊娠的维持有关     

应用实时荧光PCR技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素基因

目的:建立一种简便、特异的荧光PCR检测方法,用于金黄色葡萄球菌肠毒素的检测。方法:按金黄色葡萄球菌SEA～SEE型肠毒素基因序列设计引物,在普通PCR检测体系中,加入SYBR Green I荧光染料,建立荧光PCR检测体系。结果:46株金黄色葡萄球菌中检出22株携带肠毒素基因,阳性率为47.83%。以SEA、SEB检出率较高,分别为31.82%和27.27%;不同来源的分离株携带肠毒素基因的比例不同,同时携带2种及以上毒素基因的菌株占27.27%。结论:荧光PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法具有快速、敏感、特异性高的特点,适用于肠毒素基因的分型与分布的研究,适合基层疾控部门使用。