Decorin基因过表达对HEK 293T细胞微管相关蛋白LC3和自噬基因beclinl表达的影响

目的:构建人核心蛋白聚糖(DCN)重组质粒,研究其对微管相关蛋白LC3和自噬基因beclinl表达的影响。方法:从人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)提取总RNA,经RT-PCR获得decorin的全长cDNA,克隆至T-载体pUM-T并测序,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,再次测序正确后以磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK293T细胞,利用RT-PCR、Western Blot方法检测空载体组和重组质粒转染组微管相关蛋白LC3和自噬基因beclinl转录水平及翻译水平的表达。结果:经DNA测序证实人DCN cDNA片段正确插入真核表达载体中。Western Blot结果显示经磷酸钙共沉淀法转染的HEK 293T细胞中目的基因高表达。RT-PCR和Western Blot结果显示,与空载体组相比,重组质粒转染组LC3转录水平显著降低,beclin1和LC3-II的翻译水平均显著降低。结论:成功构建人DCN重组质粒,其在HEK 293T中过表达可以显著降低微管相关蛋白LC3和自噬基因beclinl表达,为进一步研究DCN与自噬的相互作用奠定了基础。     

pLC3-EGFP真核表达载体的构建与表达

目的 构建人微管相关蛋白轻链3(LC3)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的真核表达载体(pLC3-EGFP)并在哺乳动物细胞中表达,为研究自噬的过程及机制提供实验基础.方法 应用RT-PCR从人胚肾细胞系HEK293T细胞中扩增全长LC3基因,将产物LC3 cDNA片段亚克隆入载体pEGFP-N3,筛选阳性克隆,提取质粒测序进行鉴定.将表达质粒pLC3 -EGFP转染HEK293T细胞,荧光显微镜观察融合蛋白在细胞内的表达与定位,westem blot检测LC3-EGFP蛋白的表达.结果 测序结果表明,从人胚肾HEK293T细胞中所获得的LC3 cDNAs含有378个碱基,与Genbank( NM 022818)序列完全一致.构建的重组真核表达载体pLC3-EGFP经鉴定证实LC3基因已完全正确亚克隆到pEGFP--N3;LC3-EGFP融合蛋白能够在HEK293T细胞中表达,并主要定位于细胞质中.结论 成功构建具有报告基因-增强绿色荧光蛋白基因的重组真核表达载体pLC3-EGFP并在HEK293T细胞中很好地表达,实验结果为研究细胞自噬的进程及机制提供了实验基础.     

二氢生物喋呤还原酶参与调控HEK293T细胞自噬作用的初步研究

目的探讨二氢生物喋呤还原酶(dihydropteridine reductase,QDPR)对HEK293T细胞自噬作用的影响。方法构建野生型QDPR和突变型QDPR重组质粒分别转染HEK293T细胞,并设空载体对照组。采用RT-PCR及Western blot方法检测空载体组,野生型QDPR组和突变型QDPR组自噬相关蛋白LC3和Beclin 1的表达量变化。结果 1)测序结果证实PCR扩增得到编码正常QDPR的cDNA序列正确以及突变的cDNA也在正确的位置突变;2)磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,野生型QDPR和突变型QDPR融合蛋白成功表达;3)RT-PCR结果显示,与对照组相比,野生型QDPR组LC3基因水平明显上调(P0.05),突变型QDPR组LC3基因水平与对照组相比无统计学差异;与对照组相比,野生型和突变型组Beclin1基因水平无统计学差异;4)Western blot结果显示,与对照组相比,野生型QDPR组LC3-II和Beclin1的蛋白表达量明显上调(P0.05),但LC3-I的蛋白表达量无统计学差异,突变型QDPR组与对照组相比LC3-I,II和Beclin1的蛋白表达量均没有统计学差异(P0.05)。结论二氢生物喋呤还原酶能增强HEK293T细胞自噬相关基因LC3和Beclin 1的表达,提示其可能具有激活自噬作用的功能;二氢生物喋呤还原酶93位氨基酸的突变影响了其对细胞自噬作用的调控,降低了自噬标志分子LC3-I和Beclin1的基因表达。     

稳定表达HIV-1 GagPol基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建能稳定表达HIV-1 GagPol基因的真核表达载体.方法:用PCB方法扩增HIV-1 GagPol基因,克隆入pMD18-T,然后亚克隆人真核表达质粒pcDNA3.2(一)中,将构建的重组质粒pcDNA3.1(-)/GagPol分别瞬时和稳定转染HEK293细胞,经G418筛选,建立稳定转染GagPol基因的细胞系,并应用Western Blot方法鉴定表达产物.结果:酶切鉴定和Western Blot检测证实重组质粒pcDNA3.1(-)/GagPol构建正确,并能稳定表达HIV-1GagPol蛋白.结论:成功构建携带HIV-1 GagPol基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/GagPol,并在HEK293细胞中获得稳定表达.     

小鼠重组釉蛋白基因稳定表达细胞系的建立

目的:构建小鼠重组釉蛋白基因的真核表达系统,并建立稳定表达该蛋白的细胞系.方法:取初生小鼠牙胚组织,提取 RNA,用 RT-PCR 技术扩增釉蛋白基因片段,经双酶切后克隆至真核表达载体 pcDNA3.1^TM/myc-His(-)B 上, 转化大肠杆菌E.coli DH5α, 中提质粒,将该重组表达质粒转染至 HEK 293A 细胞,用 G418 筛选出阳性克隆,并检测釉蛋白的表达水平.结果:通过测序表明,小鼠釉蛋白基因被成功地连接到了真核表达载体上.将该表达系统转染 HEK 293A 细胞后,进行 Western Blot 检测,证明其中有相对分子质量约 32 000 的釉蛋白表达.结论:成功构建了小鼠重组釉蛋白真核表达载体,建立了稳定细胞系,为获得高纯度的釉蛋白,为进一步研究蛋白质功能奠定了基础.     

人phb1基因在哺乳动物细胞株中的转染定位和表达

目的 构建带Flag标签的phb1真核表达载体,将其转染至COS7细胞中观察phb1蛋白在细胞内的定位,并转染至HEK293T细胞检测其表达.方法 以含人phb1全长cDNA序列的质粒pLenti6-phb1为模板,用PCR方法扩增phb1全长序列,连接至T载体,构建pUCm-T-phb1,Kpn Ⅰ和EcoR I双酶切后插入真核表达载体pCDNA3中,将重组表达质粒pCDNA3-Flag-phb1转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位.转染至HEK2931、细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测.结果 经测序鉴定,成功构建了真核表达载体pCDNA3-Flag-phb1,转染后荧光显微镜观察phb1在COS7细胞中主要定位于胞质;经Western blot检测phb1基因在HEK293T细胞中能够有效表达.结论 实验结果为进一步了解phb1的功能打下了基础.     

高表达JNK3促进表阿霉素诱导的细胞凋亡

目的:构建人c-Jun氨基末端激酶3(JNK3)真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定表达细胞系;以表阿霉素作为凋亡诱导剂研究JNK3与细胞凋亡关系.方法:以pD-BLeu-JNK3质粒为模板PCR扩增人JNK3基因全长,DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体peDNA3.1/myc-His B,经PCR和酶切鉴定,DNA测序正确,脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418选择培养,建立稳定表达细胞系.RT-PCR,Western Blot检测携带Myc标签的JNK3融合蛋白的表达,流式检测表阿霉素对稳定表达JNK3基因的HEK293细胞的促凋亡作用.结果:成功构建了pcDNA3.1-JNK3真核表达载体并已稳定转入HEK293细胞,建立了稳定表达细胞系,成功地表达目的基因;与对照细胞相比表阿霉素能明显促进高表达JNK3基因的HEK293细胞发生细胞凋亡.结论:JNK3稳定表达细胞系的建立和高表达JNK3促进表阿霉素诱导的细胞凋亡,为进一步研究JNK3的功能提供了良好的实验基础.     

人类pEGFP/H2B真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HEK293细胞中表达.方法:通过RT-PCR从HEK293细胞总RNA中扩增获得H2B基因的部分cDNA序列,与载体pEGFP-C1连接构建H2B基因与GFP融合表达的真核表达质粒pEGFP/H2B,经酶切和测序鉴定;应用脂质体转染技术将重组质粒转染HEK293细胞观察融合蛋白的表达.结果:成功构建H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达载体,与对照组中转染空载体pEGFP-C1的HEK293细胞中的弥漫荧光相比,转染重组质粒的细胞中可观察到绿色荧光蛋白集中表达在细胞核内,分裂期细胞中可见与染色体形态一致的绿色荧光.结论:该载体的成功构建为研究染色体的分离机制建立了有效的观察体系.     

自噬相关基因LC3B真核表达载体构建及胃癌细胞自噬的观察

目的:构建人自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)真核表达载体,并鉴定其生物学功能.方法:通过RT-PCR方法扩增得到人LC3B cDNA,应用基因重组技术构建pEGFP-C1-LC3B真核表达载体,通过酶切和测序进行鉴定.将pEGFP-N1-LC3B表达载体转染胃癌细胞MKN1,倒置荧光显微镜观察饥饿诱导后细胞中EGFP-LC3B的表达及分布变化.结果:通过测序鉴定,pEGFP-N1-LC3B真核表达载体序列正确,编码框正确.转染后的MKN1细胞经饥饿诱导后,检测发现EGFP-LC3B由散在分布向点状分布改变,即生成细胞自噬体.结论:成功构建了人自噬相关基因LC3B真核表达载体,并证实饥饿诱导胃癌细胞自噬的发生,为进一步研究自噬在肿瘤中的作用机制奠定了基础.     

成纤维细胞生长因子受体FGFR1真核表达质粒的构建及其在HEK293T细胞的表达

目的建立一个有效表达FGFR1的真核系统。方法从人胎盘组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增得到FGFR1基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1上,构建成pcDNA3.1-FGFR1质粒表达载体,并在HEK293T细胞重组表达;将pcDNA3.1-FGFR1质粒转染HEK293T细胞,通过免疫印迹和免疫荧光检测FGFR1在细胞中的表达情况。结果扩增的FGFR1序列与数据库一致;通过构建表达载体和转染细胞实现了FGFR1c DNA在HEK293T细胞膜上的表达。结论成功扩增出FGFR1 c DNA基因,经过转染HEK293T细胞,实现了FGFR1在HEK293T细胞的高效表达。