抑制端粒保护蛋白TPP1表达诱导ATM依赖的DNA损伤反应

目的:构建端粒保护蛋白TPP1短发夹RNA表达载体,探讨抑制TPP1表达后对端粒DNA损伤及细胞增殖的影响.方法:体外构建端粒保护蛋白TPP1 shRNA逆转录病毒表达载体shTPP1-01,shTPP1-02,与表达外源性TPP1的TPP1-HA质粒共同转染293T细胞,Western Blot检测shTPP1抑制外源性TPP1蛋白表达;RT-PCR检测shTPP1抑制小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)内源性TPP1 mRNA的表达. 再用shTPP1分别感染ATM / MEF和ATM-/- MEF细胞后,分别采用细胞生长曲线和BrdU掺入法检测细胞增殖,免疫荧光/端粒肽核酸荧光原位杂交法(IF/PNA-FISH)检测端粒功能障碍诱导损伤灶(TIF)的形成.结果:shTPP1-01和shTPP1-02均能明显抑制外源性TPP1蛋白和内源性TPP1mRNA的表达,shTPP1-01和shTPP1-02作用于原代培养的MEFs后细胞生长缓慢,BrdU阳性细胞数量分别占8.0%和8.7%,显著低于对照细胞的29.3%(P＜0.01, P＜0.01);而细胞表现为体积变大,形态扁平等类似细胞衰老的形态学改变;IF/PNA-FISH法检测结果显示,shTPP1作用于ATM / MEF细胞后导致端粒DNA损伤标志物-磷酸化的H2AX(γ-H2AX)和53BP1损伤灶(TIF)的形成,定量结果显示约50%的ATM / 细胞中出现至少5个TIF;而在shTPP1作用后的ATM-/-细胞中,端粒γ-H2AX 和53BP1形成的TIF数量显著减少,出现5个TIF的细胞数量不足5%,与对照组细胞相比无显著性差异.结论:抑制TPP1表达后诱发端粒ATM依赖的DNA损伤反应,进而抑制细胞增殖,促进细胞衰老.     

端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌中的表达

目的检测端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌组织中的表达。方法收集我院33例明确诊断为食管癌患者的中心组织及其相应癌旁组织,然后提取总RNA并逆转录成cDNA,适时荧光定量PCR方法检测TRF1、TRF2和POT1基因在这些组织中的表达水平。结果 TRF1mRNA在食管癌中心和癌旁表达所得CT值分别为（1.42±2.31）和（1.02±1.04）,差异有统计学意义（P〈0.05,n=33）;TRF2为（8.53±2.57）和（8.38±1.50）,两者差异无统计学意义（P〉0.05,n=33）;POT1为（4.72±1.47）和（3.80±1.06）,两者差异有统计学意义（P=0.001,n=33）。结论虽然TRF2基因在食管癌中表达没有统计学差异,但TRF1和POT1基因在食管癌组织中表达显著降低,提示TRF1和POT1有可能与食管癌的发生、发展有着密切的关系。     

端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌中的表达

目的检测端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌组织中的表达。方法收集我院33例明确诊断为食管癌患者的中心组织及其相应癌旁组织,然后提取总RNA并逆转录成cDNA,适时荧光定量PCR方法检测TRF1、TRF2和POT1基因在这些组织中的表达水平。结果 TRF1mRNA在食管癌中心和癌旁表达所得CT值分别为(1.42±2.31)和(1.02±1.04),差异有统计学意义(P<0.05,n=33);TRF2为(8.53±2.57)和(8.38±1.50),两者差异无统计学意义(P>0.05,n=33);POT1为(4.72±1.47)和(3.80±1.06),两者差异有统计学意义(P=0.001,n=33)。结论虽然TRF2基因在食管癌中表达没有统计学差异,但TRF1和POT1基因在食管癌组织中表达显著降低,提示TRF1和POT1有可能与食管癌的发生、发展有着密切的关系。     

端粒及端粒酶对细胞衰老的影响

近年来 ,对端粒 (telomere)及端粒酶 (telomerase)与细胞衰老关系的研究已成为生物科学领域的一个热点问题 ,并取得了极大的进展 ,现予综述如下。1　端粒的基本结构及特点端粒是真核细胞内染色体末端的DNA重复序列以及一些蛋白质共同组成的复合体结构 ,首先在四膜虫 (tetrahyme     

长期紧张对染色体端粒的影响

染色体端粒是DNA与蛋白质的复合体,它覆盖于染色体的末端。细胞每复制一次,端粒就缩短一些,因而端粒可作为大多数细胞生物年龄的标记。美国加利福尼亚大学Elissa Epel等对39名患慢性病孩子的母亲与19名健康孩子的母亲的染色体端粒及应激水平进行比较,结果发现患慢性病孩子的母亲的细胞衰老得更快,染色体端粒变短。     

人端粒保护蛋白1与冠状动脉病变的关系

目的 探讨人端粒保护蛋白1(hPOT1)的表达水平与冠状动脉粥样硬化病变发生的关系。方法 选取山东大学第二医院心脏内科住院患者79例,通过冠状动脉造影术,分为冠心病组(n=49)和对照组(n=30),分离外周血白细胞,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测hPOT1 mRNA表达水平,研究对象均测定身高、体质量、血压等指标,检测空腹血糖、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等指标。结果 冠心病组hPOT1 mRNA表达量与对照组相比明显减低(P<0.05);hPOT1 mRNA表达水平与冠心病的易患因素高血糖(r=-0.264,P<0.05)、高胆固醇(r=-0.213,P<0.05)及高血压(r=-0.331,P<0.01)分别呈负相关;多因素Logistic回归分析显示,hPOT1为冠心病发生的保护性因素(OR=0.871, 95%CI=0.852～0.900,P<0.05 )。结论 hPOT1表达水平减低与冠状动脉粥样硬化病变的发生及其易患因素密切相关。     

人端粒保护蛋白（hPOT1）的研究进展

2001年，Baumann等发现并鉴定出人端粒保护蛋白（human protection of telomeres，hPOT1），它是至今发现的唯一能与人类端粒单链DNA结合的蛋白质。hPOT1最重要的功能是对端粒有直接而重要的保护作用。hPOT1能直接与端粒DNA富G单链结合，似“帽子”戴在染色体两端，防止端粒DNA序列丢失、降解、重组，人们形象地称hPOT1为“端粒保镖”。     

端粒锌指相关蛋白在乳腺癌中的表达及其临床病理意义

目的端粒锌指相关蛋白（ZBTB48）在乳腺癌中的表达及其临床病理意义。方法选取2014年1月-2015 年12 月90 例在湖南省肿瘤医院接受手术切除的乳腺癌标本及配对正常组织,实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测ZBTB48 的信使核糖核酸（mRNA）表达水平,免疫组织化学检测ZBTB48、Ki-67 的蛋白表达水平,分析ZBTB48 的表达水平与临床病理因素的相关性;利用网络公共数据库,分析ZBTB48 的表达水平与患者预后的关系。结果ZBTB48 mRNA的表达水平在癌组织中比正常组织中低,差异有统计学意义（P =0.029）;ZBTB48 蛋白的表达水平在癌组织中比正常组织低,差异有统计学意义（P =0.000）;ZBTB48 蛋白的表达水平与Ki-67 蛋白的表达水平呈负相关（P =0.0005）;ZBTB48 的mRNA 表达水平与年龄、肿瘤大小、分化程度及TNM分期相关;ZBTB48 的表达水平低则乳腺癌患者的预后差。结论ZBTB48 低表达与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、分化程度及TNM分期有关,是乳腺癌患者预后差的危险因素。     

染色体端粒的缺失表达在头颈部磷癌的意义

目的通过对头颈部鳞癌(HNSCC)细胞系染色体端粒表达的检测和分析,研究端粒功能失调现象是否存于HNSCC,探讨其在促进肿瘤染色体变异的重要作用。方法8个HNSCC细胞系和6例头颈部正常组织上皮细胞培养。收获细胞用荧光结合(CCCTAA)3核酸探针以荧光原位杂交方法检测细胞分裂中期染色体末端端粒表达,计算平均每个细胞中端粒缺失染色体末端数。结果缺失TTAGGG重复DNA序列的染色体末端数/细胞的平均数为12.8±5.4;正常对照组上皮细胞不表现或仅偶尔出现染色体端粒缺失现象,平均值0.3±0.3。两组比较有显著差异(P<0.005)。结论HNSCC染色体端粒缺失,引起端粒功能失调造成双着丝粒及环状染色体形成,促使癌细胞异常分裂,致使HNSCC染色体不稳定性,以及大量基因组失衡。     

端粒结合因子－1在脑膜瘤中的表达及临床意义

目的探讨端粒结合因子－1（TRF1）在脑膜瘤及正常脑组织中的表达及其临床意义。方法选取26例脑膜瘤（其中良性脑膜瘤18例,恶性脑膜瘤8例）和10例正常脑组织（脑外伤患者内减压切除的脑组织）石蜡切片标本作为研究对象,应用免疫组化技术检测各组TRF1的表达水平,应用半定量法计算不同标本肿瘤细胞免疫标记的频率和强度积分。结果所有肿瘤组织及正常脑组织中均检测到TRF1表达,其中正常脑组织中TRF1表达高积分构成比为90．00％,良性脑膜瘤的TRF1高积分构成比为66．67％,恶性（间变性）脑膜瘤组为12．50％。经统计分析发现,TRF1在脑膜瘤中的表达与其恶性程度成负相关（L=－0．586,P=0．002）。结论TRF1在人脑膜瘤组织及正常脑组织中均有广泛表达,其在脑膜瘤中的表达水平与其恶性程度呈负相关,TRF1可作为脑膜瘤病理分级及恶性程度判断的参考指标。     

p21Waf1／Cip1甲基化调控细胞衰老

目的：探讨 p21Waf1／Cip1启动子甲基化改变对细胞衰老进程的影响。方法采用克隆、测序的方法定量检测p21Waf1／Cip1启动子在人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）衰老过程中的甲基化改变;RT‐PCR和Western blot检测p21Waf1／Cip1的表达;采用5‐氮杂‐2‐脱氧胞苷去甲基化处理2BS细胞,通过M T T和β‐半乳糖苷酶染色检测细胞衰老。结果 p21Waf1／Cip1启动子在年轻2BS中,CpG甲基化的发生率为1．25％;在中年细胞中为27．27％;在衰老2BS细胞中为0．64％;p21Waf1／Cip1的表达在细胞衰老过程中呈波动性变化,先增加,后降低,到细胞开始衰老时,表达又显著增加;中年2BS细胞经5‐氮杂‐2‐脱氧胞苷处理后,p21Waf1／Cip1表达增加,细胞增殖速率较正常中年细胞显著降低,同时细胞β‐半乳糖苷酶染色阳性率增加。结论 p21Waf1／Cip1去甲基化加速细胞衰老。     

人参皂苷Rg1对神经细胞衰老和衰老相关异染色质聚集的影响

目的探讨人参皂苷Rg1预处理对三丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的神经细胞衰老及异染色质聚集(SAHF)的影响。方法常规培养Neuro-2a细胞株,在造模药物刺激前,给予不同剂量的人参皂苷Rg1,同时设置模型对照组、正常对照组。进行细胞活力检测、衰老相关半乳糖苷酶染色、衰老相关异染色质聚集检测。结果人参皂苷Rg1预处理可改善t-BHP诱导的细胞活力降低,此改善呈剂量依赖性;人参皂苷Rg1预处理各组,SA-β-gal染色细胞阳性数呈剂量依赖性降低;人参皂苷Rg1预处理可预防t-BHP诱导的SAHF形成,呈显著剂量依赖性。结论人参皂苷Rg1预处理可剂量依赖性地预防神经细胞衰老,防止异染色质聚集,有必要进一步研究。     

DEC1参与顺铂诱导食管鳞癌的细胞衰老

目的 探究化学治疗药物顺铂对食管鳞癌细胞衰老的影响及其机制。方法 检测4种食管鳞癌细胞株(ECA109、EC9706、TE-1、TE-3)和一株正常的人类永生化食管上皮细胞株(Het-1a)中细胞衰老因子p53、分化型胚胎软骨发育基因1(differentiated embryo-chondrocyteexpressed gene1, DEC1)的mRNA和蛋白的表达情况;选取TE-3为研究对象,采用MTT方法检测不同浓度的顺铂(2、4、6、8、10 μmol/L)对TE-3增生的情况,并结合衰老相关的β半乳糖苷酶染色方法,筛选出诱导细胞衰老的最适浓度。以顺铂最适浓度(4 μmol/L)作用TE-3 48 h,采用Western blotting方法检测顺铂作用前后p53、DEC1蛋白水平的表达情况。结果 检测食管鳞癌细胞系中细胞衰老因子p53、DEC1的mRNA和蛋白的表达,发现食管鳞癌细胞与食管上皮细胞相比,p53的表达均有不同程度下降,DEC1的表达均有不同程度升高。用不同浓度的顺铂(2、4、6、8、10 μmol/L)作用TE3,MTT显示顺铂对细胞TE-3的增生抑制作用呈剂量和时间依赖性;结合衰老相关的β半乳糖苷酶染色,发现顺铂可诱导TE-3出现细胞衰老,并在顺铂4 μmol/L作用48 h时细胞衰老现象最明显;在顺铂4 μmol/L作用TE-3细胞48 h检测对照组与实验组的p53、DEC1的蛋白表达情况,发现实验组中TE-3的p53、DEC1的表达量分别升高了4.6倍(P=0.040)、2倍(P=0.032)。结论 顺铂可诱导食管鳞癌细胞呈现细胞衰老表型,细胞衰老相关基因p53和DEC1可能参与这一过程。     

转录因子DEC1在肿瘤发生发展过程中的作用

转录因子DEC1属于bHLH家族,与肿瘤细胞增殖分化、淋巴细胞成熟、生物节律调节、免疫应答以及应激反应密切相关。近期研究表明,多种肿瘤组织和肿瘤细胞中DEC1异常高表达,且肿瘤组织中DEC1的表达与肿瘤分级相关。本文重点介绍DEC1与肿瘤细胞增殖、凋亡、衰老以及侵袭转移等表型之间的关系,从而进一步阐释DEC1在肿瘤发生发展中的作用。     

miR-125b confers resistance of ovarian cancer cells to cisplatin by targeting pro-apoptotic Bcl-2 antagonist killer 1

Chemotherapy is the preferred therapeutic approach for advanced ovarian cancer,but a successful long-term treatment is prevented by the development of drug resistance.Recent works have underlined the involvement of non-coding RNAs,microRNAs(miRNAs) in cancer development,with several conjectures regarding their possible involvement in the evolution of drug resistance.This study is to investigate the promoting effects and mechanism of miR-125b involved in the development of chemoresistance in ovarian cancer.The different expression of miR-125b in cisplatin-sensitive ovarian cancer cell line(OV2008) and its resistant variant(C13*) was identified by real-time PCR.An in vitro cytotoxicity assay and apoptosis assay using CCK-8 assay and flow cytometry,were carried out to detect the effect of miR-125b and Bak1 on cisplatin resistance of cells.Real-time PCR,Western blotting and luciferase reporter assay were used to detect whether Bak1 is a target of miR-125b.As compared with OV2008 cells,the expression levels of miR-125b in C13* cells were increased.It was found that the up-regulation of microRNA-125b caused a marked inhibition of cisplatin-induced cytotoxicity and apoptosis and a subsequent increase in the resistance to cisplatin in OV2008 and C13* cells.Moreover,Bak1 was a direct target of miR-125b,and down-regulation of Bak1 suppressed cisplatin-induced apoptosis and led to an increased resistance to cisplatin.Our study indicates that miR-125b has a significantly promoting effect on chemoresistance of C13* cells and up-regulation of miR-125b expression contributes to cisplatin resistance through suppression of Bak1 expression.This finding has important implications in the development of targeted therapeutics for overcoming cisplatin resistance in ovarian cancer.     

非编码RNA UCA1 基因的细胞定位和组织表达谱分析

目的对UCA1基因进行细胞定位和组织表达谱分析,证实它与膀胱肿瘤的相关性,为进一步研究该基因在膀胱肿瘤中的作用提供实验依据。方法采用电镜原位杂交方法对基因进行细胞定位,RT-PCR分析基因在组织中的表达情况。结果透射电镜观察细胞膜上可见散在胶体金颗粒,胞浆有大量的胶体金均匀分布,没有特异性聚集现象,核内有散在的金颗粒。组织表达谱分析UCA1基因在绒毛组织、胎盘组织和胎儿的膀胱均有明显表达;在成人心脏和脾脏有表达外,其余组织均无表达;在8种常见癌中均有差异表达,且大多数癌比相应的癌旁组织表达量高;在膀胱正常粘膜、前列腺增生、肾癌及相应的癌旁组织中均不表达,而在膀胱肿瘤中均有不同程度的表达。结论UCA1基因定位于细胞浆,该基因可能与膀胱肿瘤密切相关,有望成为膀胱肿瘤分子标记物。     

UVB诱导下早衰人皮肤成纤维细胞中miR-34c及SIRT1表达的研究

目的:运用反复亚毒性剂量紫外线B(ultraviolet B,UVB)辐射人皮肤成纤维细胞,构建应激诱导早衰(stress-induced premature senescence,SIPS)模型,观察衰老相关生物学标志、衰老相关基因信号分子p53、p21、p16、沉默信息调节因子2相关酶1(sirtuin1,SIRT1)以及miR-34c的表达情况。方法:体外培养人皮肤成纤维细胞,予连续5次、每次剂量10 mJ/cm2的UVB辐射,细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测衰老细胞,流式细胞术检测细胞周期阻滞情况,实时荧光定量PCR检测miR-34c及衰老相关基因p53、p21、p16、SIRT1 mRNA表达水平变化,Western blot检测p53、p21、p16及SIRT1蛋白水平表达。结果:与对照组相比,SIPS组细胞SA-β-Gal染色呈强阳性[对照组(8.13 ± 1.92)%,SIPS组(94.72 ± 2.08)%,P < 0.05];多数细胞阻滞于G1期[对照组(52.96 ± 1.76)%,SIPS组(77.31 ± 2.05)%,P < 0.05];另外,实时荧光定量PCR显示miR-34c mRNA的表达升高(miR-34c-3p、miR-34c-5p分别为对照组0.93 ± 0.09、1.03 ± 0.03,SIPS组2.08 ± 0.19、12.28 ± 1.64,P < 0.05);衰老相关基因p53、p21、p16、SIRT1 mRNA的表达亦升高(对照组分别为0.74 ± 0.23、1.06 ± 0.23、0.86 ± 0.13、0.74 ± 0.25;SIPS组分别为1.84 ± 0.55、20.25 ± 2.34、16.7 ± 3.94、2.15 ± 0.22,P < 0.05);Western bolt表明p53、p21、p16及SIRT1蛋白水平表达明显升高,差异有统计学意义(P < 0.05)。结论:miR-34c在反复多次亚毒性剂量UVB辐射人皮肤成纤维细胞后表达升高,对p53起正反馈调节作用,而SIRT1并未受miR-34c的抑制。     

hERG1a突变H70R对hERG1a单源四聚体和hERG1a/hERG1b二源四聚体通道功能的影响

目的 本研究拟探索KCNH2编码心肌细胞快速延迟整流钾离子通道(rapidly activating delayed rectifier K⁺ channel, I_Kr)α亚基(the human ether-à-go-go-related gene,hERG)转录产物——hERG1a特有突变H70R对hERG1a单源四聚体通道(I_hERG1a)及hERG1a/ hERG1b二源四聚体通道(I_{hERG1a/hERG1b})功能的影响,明确是否存在差异。方法 以脂质体转染技术通过HEK293细胞表达可疑致病突变。应用全细胞膜片钳技术分别记录I_hERG1a、I_{hERG1a/hERG1b}电流。结果 H70R对I_{hERG1a/ hERG1b}电流密度抑制较I_hERG1a更为显著(61% vs 42%;P<0.001);且至稳态激活曲线左移,显著降低半激活电压(P<0.05);H70R对I_hERG1a和I_{hERG1a/hERG1b}通道灭活动力学无显著影响(P>0.05),I_{hERG1a/hERG1b}较I_hERG1a灭活显著加快(P>0.05)。结论 H70R对I_hERG1a及I_{hERG1a/hERG1b}通道功能影响趋势一致,但对I_{hERG1a/hERG1b}通道电流抑制更为显著,I_{hERG1a/hERG1b}较I_hERG1a灭活显著加快,提示在hERG相关临床致病突变研究中应重视I_{hERG1a/hERG1b}通道功能的改变。