5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:研究体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(mensenchymal stem cells,MSCs) 经5-氮胞苷(5-aza) 诱导定向分化为心肌样细胞形态学及分子生物学特征?方法:SD大鼠股骨骨髓经密度梯度离心及贴壁分离培养传代MSCs,体外用5-aza定向诱导向心肌样细胞分化?相差显微镜观察心肌样细胞形态学变化?免疫组化检测肌钙蛋白T(cTnT)?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达?结果:密度梯度离心及贴壁法分离培养的MSCs生长稳定,增殖快?5-aza诱导后,部分细胞形态发生变化,有肌管样结构形成?随诱导后培养时间延长MSCs中cTnT?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达逐渐增强?结论:密度梯度离心及贴壁分离培养可获得大量纯度较高的骨髓间充质干细胞?经5-aza诱导骨髓间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞?     

骨髓间充质干细胞的分离与培养

目的　摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件 ,并观察其部分生物学活性。方法　采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法 ,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响 ,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果　以选用 4～ 2 4h贴壁的有核细胞 ,加入 5 %～ 1 0 %胎牛血清、种植密度(4～ 8)× 1 0 4个 /ml的培养条件为最适宜细胞生长 ;在此条件下 ,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性 ;其形态呈梭状 ,具有快速增殖的能力 ;培养细胞在 3～ 4d进入对数生长期 ,随后进入平台期 ,分裂相细胞明显减少 ;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状 ,2～1 0代的细胞呈均质状 ;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论　建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件 ,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性 ,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础     

兔骨髓间充质干细胞向神经元的诱导分化

目的 :探讨兔骨髓间充质干细胞 (bonemarrowmesenchymalstemcells ,BM -MSCs)向神经元定向诱导分化及分化前后体外培养的条件。方法 :无菌条件下收集兔股骨骨髓 ,用相对密度为 1 0 77的淋巴细胞分离液分离出白膜层细胞群 ,贴壁法筛检其中的MSCs ,用DMEM H条件培养基进行原代及传代培养。分别取 5和 10代的MSCs向神经元定向诱导。诱导后更换为神经培养基继续培养 ,并在 1～ 2 0d用免疫细胞化学方法检测分化细胞的特异性表面标志。结果 :兔骨髓MSCs在DMEM H条件培养基中建立高纯度的细胞培养 ,能够稳定地连续传代达 10代以上。不同代数的MSCs诱导后均表达巢蛋白 (nestin)和神经特异性烯醇化酶 (neuron specificenolase ,NSE)。诱导后NSCs在神经培养基中继续存活 2 0d以上 ,但未见扩增。结论 :兔骨髓MSCs能够诱导表达神经元特异性标志 ,且诱导前后的MSCs均可在体外培养条件下存活。     

大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性及分化潜能研究

目的建立一种体外分离、培养和扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法.探讨体外培养骨髓间充质干细胞的一些生物学特性,为利用MSCs进行多种疾病的细胞治疗提供实验基础. 方法分离6～8周龄的大鼠胫骨、股骨,用DMEM/F12培养基冲出骨髓,采用Percoll淋巴细胞分离液获得骨髓中的单个核细胞,并结合MSCs的贴壁特性,获得大鼠MSCs,体外扩增.体外进行多向诱导分化鉴定分离的细胞,并测定传代细胞的生长曲线、观察其接种贴壁率、检测细胞周期和超微结构.结果体外培养的MSCs生长状况良好,并能迅速扩增,具有分化形成成骨和成脂肪细胞的能力;MSCs倍增时间约为28.8h;传代后10h贴壁达95.5% 以上;细胞周期显示有92%细胞处于G0/G1期;电镜显示的结果进一步证实MSCs具备了干细胞的结构特点.结论在本实验条件下,体外培养的MSCs具有多向分化潜能,体外生长稳定,传代后的细胞适应性强,增殖较快,超微结构和细胞周期表现出较早期细胞特点.使干细胞用于移植治疗、基因治疗成为可能.     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的:探讨一种简便可行的兔骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养方法。方法:通过全骨髓贴壁分离法体外分离、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线;倒置相差显微镜观察细胞形态;并向软骨细胞诱导分化,采用番红快绿染色和甲苯胺蓝染色鉴定。结果:经全骨髓贴壁法得到的骨髓间充质干细胞性状稳定,为纺锤状,呈克隆样生长;成软骨诱导培养的骨髓间充质干细胞,表现出软骨细胞的形态特征和生物学特征。结论:采用全骨髓贴壁分离法操作简便,是培养兔骨髓间充质干细胞的理想方案,在适当的条件下BMSCs能多向分化。     

兔骨髓基质干细胞的分离、扩增和生物学特性检测

目的探讨密度梯度离心法分离培养兔骨髓基质干细胞(MSCs)的条件,为组织工程选择合适的种子细胞奠定基础。方法采用密度梯度离心法将兔MSCs自少量骨髓中分离并培养,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线,测定贴壁率。结果兔MSCs性状稳定,生长曲线相似,第5-6天细胞数目最多;传代后10 h贴壁率高达90%。结论密度梯度离心法是分离兔MSCs的理想方法,MSCs能为未来组织工程提供足量种子细胞。     

骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及生物学特性研究

目的 通过体外细胞培养和贴壁筛选法将骨髓间充质干细胞由骨髓中分离纯化并加以鉴定，观察该细胞的生物学特性，为其用于组织工程提供实验基础。方法 提取骨髓，通过离心和贴壁筛选培养获取骨髓间充质干细胞，原位杂交检测骨髓间充质干细胞的表面标志CD44对培养细胞进行鉴定；测定其生长曲线和贴壁率。结果 通过体外培养和贴壁筛选可获得骨髓间充质干细胞，该细胞在体外培养条件下可在短时间内贴壁生长，增殖速度迅速，适应性强，长期传代不改变其生物学特性。结论 体外细胞培养和贴壁筛选能有效分离纯化免骨髓间充质干细胞，细胞扩增稳定。     

大鼠骨髓间充质干细胞适宜分离和培养条件的研究

目的 :寻求适宜有效的大鼠骨髓间充质干细胞 (mensechymalstemcell,MSCs)体外分离、纯化和培养的条件 ,为MSCs进一步的实验研究打下基础。方法 :分别用贴壁筛选法和密度梯度离心法来分离和纯化MSCs ,并用不同的接种密度、不同的血清浓度和不同的培养基检测细胞的生长情况 ,绘制出细胞的生长曲线 ;流式细胞仪检测MSCs生长周期。结果 :细胞贴壁呈纤维状生长 ,以 2× 10 9的浓度接种 ,在含 10 %胎牛血清的DMEM /F12培养基中 ,37℃、5 %CO2 细胞培养箱中 ,细胞生长状况良好 ;细胞在培养的最初几天处于生长的潜伏期 ,而后呈指数级生长 ,随着时间的延伸 ,细胞的生长速度减慢 ;而流式细胞仪检测示细胞大多处于G0 G1期。结论 :在适宜的培养条件下 ,MSCs在体外培养的过程中生长状态良好 ,增殖速度快 ,为进一步的研究打下了基础。     

两种培养方法在猪自体骨髓间充质干细胞培养的比较研究

目的 比较应用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合直接贴壁法两种方法分离、纯化、扩增猪骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养效率,为临床应用提供理论依据和实验方法.方法 取滇南小型猪的骨髓液用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合贴壁培养法两种方法分离猪骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,绘制其生长曲线,通过显微镜观察培养细胞的生物学形状.结果 直接贴壁法收集到的细胞扩增速度较慢,密度梯度离心法收集到的细胞扩增速度较快,细胞培养后成梭形.结论 密度梯度离心结合贴壁培养法较单纯的直接贴壁法培养骨髓间充质干细胞的培养效率更高.体外培养的猪骨髓间充质干细胞生长稳定,增殖力较强.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养的适宜条件。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁分离法分离培养大鼠骨髓MSCs,观察其形态,流式细胞仪检测细胞表面标记,MTT法观察不同浓度的胎牛血清(FBS)对MSCs生长曲线的影响及不同代MSCs的生长曲线和细胞贴壁率。结果:大鼠MSCs呈梭形或纺锤形,CD34、CD45表达阴性,CD44表达71.5%、CD166表达83.2%;MSCs用10%的FBS培养,其增殖明显高于用无血清、5%及20%的FBS培养;第1、3、5、10代MSCs的生长曲线及细胞贴壁率无明显差异(P>0.05)。结论:密度梯度离心法结合贴壁分离法适于大鼠MSCs的分离;10%的FBS适合MSCs的培养;早期传代对MSCs的增殖无影响。     

兔骨髓间充质干细胞培养与多向分化潜能鉴定的实验研究

目的原代培养兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察体外培养中MSCs的生物学特性及多向分化潜能。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察形态学特点,测绘传代MSCs生长曲线,检测细胞周期及表面标记,体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果原代及传代MSCs为长梭形成纤维细胞样细胞;生长曲线显示传代细胞具有类似的生长规律;流式细胞仪分析MSCs CD44表达阳性,CD45表达阴性;细胞周期分析显示87%以上细胞处于G0/G1期;经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红染脂滴。结论通过密度梯度离心联合贴壁培养法可大量扩增、纯化MSCs,所获细胞具有高度自我更新和多向分化潜能。     

兔骨髓间充质干细胞体外软骨向诱导的实验研究

目的:体外分离培养兔骨髓间充质干细胞(MSCs),并定向诱导其向软骨细胞表型分化。方法:抽取兔股骨骨髓,经密度梯度离心与贴壁培养分离得到MSCs。用含有TGF-β、b-FGF、胰岛素、维生素C、转铁蛋白等的DMEM/Ham′s-F12培养基进行软骨向诱导。通过形态学观察,阿辛蓝-PAS特染及Ⅱ型胶原免疫组化染色,鉴定经过诱导后细胞的软骨细胞的表型。结果:兔MSCs原代细胞呈梭形,克隆样生长,经过诱导培养7d后,细胞形态由梭形、多角形变为椭圆形,胞浆丰富,细胞核和核仁清晰可见。阿辛蓝-PAS和Ⅱ型胶原染色阳性。结论:密度梯度离心与贴壁培养两种方法相结合可获得相对高纯度的MSCs,该细胞经诱导后可向软骨细胞分化。     

巴马香猪骨髓间充质干细胞的分离扩增及初步鉴定

目的建立巴马香猪骨髓问充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）分离、培养、扩增的方法,并进行鉴定。方法采用梯度离心法分离并结合贴壁筛选法传代纯化培养猪的MSCs;采用倒置相差显微镜观察MSCs的形态学特征;流式细胞仪检测第3代细胞表面标志抗原CD71、CD34的表达率。结果原代培养的MSCs于6h后贴壁,贴壁细胞呈集群生长趋势。培养7～9d后可见细胞融合,14～21d达到95％融合。第3代细胞表面标记物CD71阳性率为95％,CD34阳性率为O％。结论采用全骨髓梯度离心法分离并结合贴壁筛选法能够成功分离和培养巴马香猪的MSCs,在第3代可获得高纯度MSCs。     

全骨髓贴壁法分离培养rBMSCs及成骨诱导探讨

[摘要]　目的 通过研究在体外培养大鼠骨髓基质干细胞(rBMSCs)及其成骨生物学特性,探讨构建骨组织工程种子细胞的方法。方法 通过全骨髓贴壁培养法分离大鼠骨髓基质干细胞,应用含地塞米松、维生素C、β2甘油磷酸钠的诱导培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化,并检测碱性磷酸酶活性及钙结节茜素红染色反应,进行成骨细胞鉴定。结果 全骨髓贴壁培养下,骨髓基质干细胞增殖能力强,生长迅速,呈成纤维细胞样生长。诱导条件下细胞的碱性磷酸酶活性明显增高,并且钙结节茜素红染色反应阳性。结论 采用全骨髓贴壁培养法,骨髓基质干细胞分离培养及体外扩增更为简便迅速,诱导条件下成骨能力肯定,可为骨组织工程构建提供大量种子细胞。     

MSCs 2种分离培养方法及其培养液中的 VEGF、SDF-1α浓度比较

目的：通过2种分离培养方法所得骨髓间充质干细胞（MSCs）的生长特征和微环境中细胞因子的比较,提供一种可以快速、安全、高效地为临床和实验提供大量优质MSCs的方法。方法提取C57BL／c小鼠的骨髓,分别作密度梯度离心法和全骨髓贴壁培养分离法分离培养MSCs ,通过流式细胞仪检测细胞表面CD29＋、CD31－、CD34－、CD45－表达水平,并比较各自所得细胞的生长曲线;ELISA检测培养液中的血管内皮生长因子（VEGF）、SDF‐1α浓度并比较二者的差异。结果与密度梯度离心法比较,全骨髓贴壁分离法所得原代细胞有较快的生长速度,较短的生长周期;培养液中VEGF和SDF‐1α浓度也稍高于密度梯度离心法。结论全骨髓贴壁培养法可以快速、方便、有效地为临床和实验提供大量MSCs ,所得细胞的培养环境优于密度梯度离心法,减少了对细胞功能的损害。     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养及形态学观察

目的：对兔骨髓间充质干细胞进行体外分离培养,观察其形态学特征。方法：通过密度梯度离心联合贴壁培养法,对兔骨髓间充质干细胞进行体外分离、扩增、纯化,倒置相差显微镜观察其形态学特点。结果：体外培养的兔骨髓间充质干细胞为贴壁生长,长梭形成纤维细胞样细胞,可增殖形成克隆。结论：兔骨髓间充质干细胞通过密度梯度离心联合贴壁培养法可大量扩增、纯化,并表现为一定的形态学生长特征。     

人乙型肝炎病毒DNA阳性血清对人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的影响

目的:探索人乙型肝炎病毒感染血清对间充质干细胞向肝细胞分化的影响,为肝细胞移植提供实验基础.方法:体外分离和纯化骨髓间允质干细胞,接种在肝细胞诱导培养基中,刺激干细胞向肝细胞分化.设立4个实验组加入不同血清:A组,5%(体积分数)胎牛血清(FBS);B组,2.5%(体积分数)FBS+2.5%(体积分数)乙型肝炎感染血清;C组,2.5%FBS+2.5%(体积分数)正常人血清;D组,以含10%(体积分数)FBS的LG-DMEM培养液作为对照.诱导培养后,利用免疫组织化学染色检测肝细胞特异性标志,以及感染细胞是否表达乙型肝炎特异性蛋白.应用糖原染色技术检测细胞合成和储存糖原的功能.结果:诱导组的间充质干细胞表达白蛋白(ALB)和甲胎球蛋白(AFP),并具备合成和储存糖原的功能.B组细胞加入感染血清后,扩增能力受到抑制,少量细胞可表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg),但ALB和AFP的表达阳性率以及糖原储存能力与C组相似.荧光共聚焦技术检查可见部分细胞同时表达ALB和HBsAg.结论:骨髓间充质干细胞在特定的肝细胞诱导条件下具有向肝细胞分化的能力;乙型肝炎感染血清可以明显抑制间充质干细胞的体外扩增,但对其向肝细胞分化没有明显影响.     

人骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化的实验研究

目的:探索体外分离子与培养人骨髓间充质干细胞的方法,同时研究其细胞生物学特性,分析其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法:分离人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stemcells,hBMSCs),通过常规培养,在体外观察其生长特性、抗原表达等特征;然后通过条件培养基定向诱导,观察其分化潜能。结果:人骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,常规培养条件下,原代培养需要2～3周,转代后生长速度加快;应用流式细胞仪检测MSCs的表面抗原,CD44、CD29、CD105阳性,CD45、CD06、CD34以及HLA-DR阴性;在相应条件培养基的诱导作用下,MSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞以及神经细胞。结论:人骨髓间充质干细胞可以从骨髓中分离并在体外培养增殖,同时在体外具有多向分化潜能,可以分化成为骨细胞,符合骨组织工程种子细胞的要求。