新型阳离子核酸载体的细胞转染效率研究

新型阳离子核酸载体ＬＷ１３ ２进行研究,分析其细胞毒性和基因转染效率,探讨其作为核酸载体的可能性。方法　使用ＭＴＴ比色法分析ＬＷ１３ ２与ＤＮＡ在不同比例下的细胞毒性。选用绿色荧光蛋白表达质粒ＥＧＦＰ为报告基因,以人胚胎肾ＨＥＫ２９３细胞为工具细胞,在荧光显微镜下观察计数,计算转染效率。结果　当ＬＷ１３ ２与ＤＮＡ的质量比为（１～３）∶１时,细胞毒性最低。ＬＷ１３ ２与ＤＮＡ的质量比为３∶１时,转染作用４ｈ,在无血清培养基中继续培养４８ｈ,得到ＬＷ１３ ２的最大转染效率为８７６％。结论　通过与市售成熟转染试剂Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００的对比,新型阳离子核酸载体在大幅提高基因转染效率的同时并没有增加其细胞毒性,有望成为核酸转移的有效载体,为相关研究及基因的靶向治疗研究提供基础。     

阳离子磷酸胆碱聚合物负载siRNA进行细胞转染的可行性

目的 探讨新型阳离子磷酸胆碱聚合物(MPC30DEA70)负载短片断干扰RNA(siRNA)进行细胞转染的可行性以及生物学效应.方法 MTT法分析MPC30DEA70对HepG2.2.15细胞的毒性;设计特异性siRNA,以MPC30DEA70负载红色荧光标记的siRNA转染HepG2.2.15细胞,在荧光显微镜下观察该载体携带siRNA能否进入细胞中及在该细胞中的转染效率.在此基础之上,观察对荧光素酶基因表达的抑制效应.结果 在MPC30DEA70的浓度为0.5、1、3、5μ1时,未发现对HepG2.2.15细胞产生明显的毒性,细胞存活率均在80%以上,并且能够携带siRNA进入细胞内,在48h的转染效率达(52.33±1.97)%,转染后能够有效地抑制荧光素酶质粒在HepG2.2.15细胞内的表达.结论 MPC30DEA70携带的siRNA在HepG2.2.15细胞中有着较高的转染效率,并发挥一定的生物效应,有望成为有效的siRNA载体.     

脂质体介导C-erbB-2反义寡核苷酸转染小鼠乳腺癌TM40D细胞的效率及毒性

目的 探讨阳离子脂质体为载体的反义寡核苷酸（ODNs）转染小鼠乳腺癌TM40D细胞的最佳转染效率及对细胞的毒性作用。方法 分别将有／无脂质体介导的反义ODNs转染小鼠乳腺癌TM40D细胞,应用流式细胞仪观察不同时间的反义ODNs的转染效率,荧光显微镜观察反义ODNs在细胞内的分布,全自动生化分析仪检测转染培养上清液的乳酸脱氢酶（LDH）浓度。结果 无脂质体介导的反义ODNs转染细胞效率随着时间的延长增加,6h达到63．00％。脂质体介导的反义ODNs转染细胞4h时转染效率达到高峰为72．23％。细胞内荧光强度与细胞转染效率相关。无脂质体介导的FAM标记的反义ODNs分布在细胞浆,脂质体介导的反义ODNs在细胞浆及细胞核内均有分布。各组LDH浓度无统计学差异。结论 脂质体介导组反义ODNs转染效率高于无脂质体组,同时转染高峰提前出现。脂质体促进反义ODNs进入细胞核内。短时间内阳离子脂质体及反义ODNS对细胞的毒性不明显。     

胆固醇衍生物阳离子脂质体复合EGFP—IL-1Ra质粒体外转染HELA细胞系的研究

目的研究胆固醇衍生物阳离子脂质体复合EGFP—IL—IRa质粒体外转染HELA细胞系的效率,为类风湿性关节炎治疗提供新的选择。方法制备新型胆固醇衍生物脂质体及EGFP—IL-1Ra质粒,两者结合转染HELA细胞系,通过体外凝胶阻滞试验检测阳离子脂质体与质粒DNA的最佳配比关系,MTT法检测脂质体细胞毒性,荧光免疫法检测HELA细胞的转染效率。结果实验中所用脂质体的IC50为650μg／mL,较对照组有更低的细胞毒性。脂质体／DNA质量比为50：1作为最适比例,荧光显微镜观测脂质体结合EGFP—IL-1Ra质粒转染HELA荧光强度高于单纯EGFP—IL-1Ra质粒转染组。结论胆固醇衍生物阳离子脂质体复合EGFP—IL-1Ra质粒可高效的转染HELA细胞系,有望成为类风湿性关节炎治疗的新方法。     

三种阳离子转染试剂对小鼠血管瘤内皮细胞转染效率及细胞毒性的影响

目的 从三种常用的阳离子转染试剂中筛选出对小鼠血管瘤内皮细胞(EOMA)有较高转染效率和较低细胞毒性的转染试剂.方法 以含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1为报告基因,以阳离子脂质体LipofectamineTM2000、LipofectamineTM PLUS和阳离子聚合物JetPEITM为转染试剂,按照转染试剂盒的说明优化其转染条件,分别转染EOMA细胞,24 h后在荧光显微镜下计数阳性细胞率、MTT法检测各转染条件下对EOMA的细胞毒性.结果 经优化转染条件,LipofectamineTM PLUS和JetPEITM转染的细胞中阳性细胞的最高比例分别为45%和47%,LipofectamineTM2000转染的细胞中荧光蛋白表达的比例最高(＞80%),Lipofecta-mineTM2000试剂在最高转染效率的剂量下仍然保证了80%的细胞存活率.结论 阳离子脂质体LipofectamineTM2000对小鼠EOMA细胞有较高的转染效率和较低的细胞毒作用.     

阴离子脂质体－阳离子脂质体复合物介导的基因转染

目的评价阴离子脂质体-阳离子脂质体复合物介导质粒转移至HepG2肝癌细胞中及其毒副作用。方法制备携载表达绿色荧光蛋白质粒的阳离子脂质体,与阴离子脂质体形成复合物。测定脂质体复合物的zeta电位,凝胶阻滞实验考察质粒包封情况,流式细胞仪测量各阴离子脂质体-阳离子脂质体复合物的转染效率,MTT法检测细胞毒性。结果复合物能完全包裹质粒,其zeta电位低于阳离子脂质体zeta电位;脂质体复合物介导的转染效率略低于阳离子脂质体,其细胞生存率高于阳离子脂质体。结论阴离子脂质体-阳离子脂质体复合物在降低细胞毒性的同时,可实现对HepG2细胞较高的转染效率。     

聚乙烯亚胺介导基因转染的影响因素研究

目的研究非病毒基因载体聚乙烯亚胺（PEI）介导基因转染的影响因素。方法采用透射电镜观察PEI与DNA形成复合物的形态,分别考察质粒量、复合物形成时间、复合物在细胞上作用时间和氮磷比（N/P）对转染效率的影响,以筛选较优的转染条件。结果PEI可有效地与DNA形成复合物,当质粒量为每孔2μg、复合物形成时间为30min、复合物在细胞上的作用时间为4h且N/P为20时转染效率最高。结论PEI可作为合成新型非病毒载体的骨架,但必须控制有关因素才能得到最佳的和可重复的转染结果。     

阳离子脂质体介导肽核酸转染K562细胞的研究

目的 优化阳离子脂质体介导肽核酸(PNA)转染K562细胞的条件.方法 以阳离子脂质体lipofectamine 2000为载体,将标记有FITC荧光基团的PNA转染K562细胞,在荧光显微镜下观察并计算其转染效率,采用Cell Counting Kit(CCK-8)检测其细胞毒性.应用正交试验筛选出最佳的PNA和脂质体的用量及比例,并优化稀释用培养基血清浓度,以获得最优的转染效果.结果 以2.5× 105/mL～3×105/mL的细胞密度接种,100 μL/孔的培养基中加入PNA 6.25 pmol,PNA与脂质体的体积比为1∶3.5,稀释用培养基未加胎牛血清时,细胞转染效率和细胞毒性最佳,转染效率为87.2％,细胞存活率(RGR)为94.1％.结论 PNA可通过阳离子脂质体转染进入K562细胞,优化条件后得到的细胞转染效率和细胞存活率能够满足基因表达研究的实验要求.     

载碱性成纤维细胞生长因子质粒纳米粒的制备及体外转染活性研究

目的:制备壳聚糖载bFGF基因纳米粒,并对其体外性质及转染成纤维细胞效率进行考察。方法:以复凝集法制备载绿色荧光蛋白(EGFP)与人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)融合蛋白EGFP-bFGF质粒(pEGFP/bFGF)的壳聚糖纳米粒CS-pEGFP/bFGF,透射电镜、纳米粒度电位仪测定纳米粒形态、粒径和表面电位,凝胶阻滞实验分析质粒与壳聚糖结合情况,细胞增殖实验考察载bFGF质粒转染后对细胞增殖的影响,荧光分光光度计及荧光显微镜观测纳米粒转染成纤维细胞后细胞对EGFP的表达情况。结果:壳聚糖纳米粒可将质粒pEGFP/bFGF成功转入成纤维细胞中并能有效降低转染产生的细胞毒性,细胞自分泌的bFGF能促进成纤维细胞的增殖。结论:载bFGF纳米粒具有提高转染效率、降低毒性及促进成纤维细胞增殖的作用。     

转染内皮祖细胞的脂质体与腺病毒载体的比较

目的:比较脂质体和腺病毒作为肝细胞生长因子(HGF)基因转染内皮祖细胞载体的效力.方法:分离培养大鼠骨髓血管内皮祖细胞,并通过摄取DiL-acLDL、结合FITC-UEA-1及流式细胞术检测表面抗原CD133+进行鉴定.脂质体介导细胞转染,将细胞分为HGF质粒转染组(转染pIRES2-EGFP-HGF质粒)、空载质粒转染组(转染plRES2-EGFP质粒)和空白对照组.病毒介导细胞转染,细胞分HGF病毒转染组(pAdxsi-GFP-HGF重组腺病毒转染)、空载病毒转染组(导入pAdxsi-GFP腺病毒)和空白对照组.荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,ELISA法检测HGF的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞增殖能力.结果:脂质体和腺病毒载体均可成功将绿色荧光蛋白标记的HGF基因转入内皮祖细胞,其中腺病毒转染效率更高,最高可达80％以上,其表达HGF水平以及细胞增殖能力都明显强于脂质体转染.空载病毒转染组细胞增殖与空白对照组差异无统计学意义(P＞0.05),而空载质粒转染组细胞增殖明显少于空白对照组(P＜0.05).结论:腺病毒作为HGF基因转染内皮祖细胞的载体相对于脂质体载体具有更高效、低毒、高表达目的基因的优点.     

人寡肽转运体1转染MDCK细胞与转染HeLa细胞的比较研究

目的筛选出更适宜的转染受体细胞,提高构建人寡肽转运体1(human peptide transporter 1,hPepT1)高表达细胞系的效率。方法利用Lipofectamine~(TM) 2000转染试剂将pcDNA3.1(+)-hPepT1质粒分别转染进MDCK细胞与HeLa细胞,并进行单克隆细胞的挑选和扩大培养。通过qRT-PCR与Western blot技术来检测两种受体细胞中hPepT1 mRNA与蛋白的表达水平,并利用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)对两种单克隆转染细胞的hPepT1典型底物甘氨酰肌氨酸(Glysar)摄取能力进行考察。结果 MDCK细胞与HeLa细胞转染后,hPepT1 mRNA与蛋白表达水平以及Glysar的摄取能力均明显高于其野生型细胞(P<0.05);虽然Glysar在HeLa细胞中的摄取量高于MDCK细胞,但MDCK-hPepT1细胞中hPepT1 mRNA与蛋白表达水平以及Glysar的摄取能力却高于HeLa-hPepT1细胞。结论在hPepT1稳定高表达转染细胞模型的构建中,为提高hPepT1的转染效率,从而获得更高效的转染细胞模型,以MDCK细胞作为转染的受体细胞可能是更为适宜的选择。     

慢病毒载体介导apelin基因转染人脐带间充质干细胞的实验研究

【摘要】目的构建带有荧光标记基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和apelin基因的重组质粒pUbi-apelinFLAG-pSV40-EGFP并进行慢病毒包装,探讨其转染人脐带间充质干细胞的最佳感染复数（MOI）值及目的基因表达情况。方法化学合成目的基因片段并扩增。采用In-Fusion技术将酶切后的目的基因片段与线性质粒载体连接,转化入感受态DH5α细胞中后筛选阳性克隆并进行测序。重组质粒慢病毒载体转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度。将重组质粒慢病毒按不同MOI值转染人脐带间充质干细胞,根据转染效率得到最佳MOI值,并采用Real-timePCR及Western blot方法检测目的基因表达情况。结果通过PCR扩增获得酶切位点碱基修饰后的大小约284bp的目的基因片段,与慢病毒质粒载体连接后形成pUbi-apelin-FLAG-pSV40-EGFP重组质粒,测序结果与预期完全符合,并成功包装慢病毒颗粒。最佳MOI值为20,转染效率为（90.32±3.61）%。慢病毒载体能高效转染人脐带间充质干细胞且2周内持续稳定上调目的基因mRNA及蛋白的表达。结论重组质粒慢病毒载体pUbi-apelin-FLAGpSV40-EGFP可有效转染人脐带间充质干细胞,并可持续高表达apelin基因     

右旋糖苷衍生物纳米粒对人乳腺癌细胞的转染作用研究

目的以右旋糖苷为起始反应物制备对人乳腺癌细胞具有高转染活性的右旋糖苷衍生物纳米粒非病毒基因载体。方法先将右旋糖苷40与高碘酸钠以不同的配比进行反应,生成醛基含量不同的氧化右旋糖苷;氧化右旋糖苷与精胺以不同的配比反应,共生成9种右旋糖苷衍生物纳米粒;以绿色荧光蛋白基因为报告基因、mda-mb-435人乳腺癌细胞为转染细胞,考察9种合成物的基因转染活性,从中选出转染活性最高的生成物。结果高碘酸钠与右旋糖苷40按摩尔比为0.8∶1反应生成氧化右旋糖苷;该氧化右旋糖苷再与精胺按1∶1的摩尔比继续反应,生成的终产物的转染效率最高。结论制备出了对mda-mb-435人乳腺癌细胞具有高转染活性的右旋糖苷衍生物纳米粒非病毒基因载体。     

siRNA转染试剂的全面对比研究（英文）

siRNA已经成为生物研究的常用工具,也是目前最具潜力的下一代基因治疗药物。将siRNA成功转染进入细胞,仍然是限制siRNA广泛应用的关键技术,对于难转染细胞尤其如此。siRNA转染效率是摄取、细胞利用率及细胞毒性的综合作用结果,更高的转染效率通常需要高摄取、高细胞利用率和低细胞毒性。本研究旨在比较不同的转染试剂递送siRNA的摄取、siRNA敲低效率和毒性情况。新开发的CALNP RNAi转染试剂与传统转染试剂的摄取行为不同,转染效率显著高于传统转染试剂,同时毒性最低。CALNP RNAi转染试剂为难转染细胞的RNA干扰带来了新的选择。     

泊洛沙姆407修饰对聚乙烯亚胺的毒性和转染性质的影响

目的:考察泊洛沙姆407修饰对聚乙烯亚胺(PEI)的毒性和转染性质的影响.方法:使用琥珀酰亚胺碳酸脂法将P407连接在PEI的氨基上,得到新聚合物,通过1H-NMR确定新聚合物的结构,将该聚合物与DNA形成复合物,测定复合物的zeta电位,MTT法考察复合物的细胞毒性,使用质粒pGL3-lus作为报告基因,测定虫荧光素酶活性评价复合物对Hela细胞的转染效率.结果:1H-NMR结果表明合成的聚合物具有较高的纯度.复合物的Zeta电位随氮/磷比(N/P)值的增加而增高.复合物的细胞毒性随着N/P值的增加而增大,新聚合物其细胞毒性显著低于未修饰的PEI.新聚合物在高N/P值时仍能保持较高的转染效率.结论:泊洛沙姆407修饰的PEI可以作为一种有效的非病毒基因栽体.     

葡聚糖-精胺阳离子聚合物基因载体体外基因转染的研究

本文研究了葡聚糖-精胺阳离子聚合物(DSP)基因载体的性能及其对体外细胞基因的转染效率。氧化葡聚糖与精胺通过还原胺化法反应制得DSP，所得DSP与质粒pEGFP通过静电吸附形成复合物；当DSP/DNA质量比在4∶1至20∶1，能形成稳定的复合物，复合物粒径为162.6～187.9 nm，zeta电位则从+8.45 mV增至+39.6 mV；DSP能有效保护DNA不受核酸酶I降解，同时在一定pH范围内载体具有较强的缓冲能力；复合物在质量比为8∶1时对SMMC-7721肝癌细胞、BHK-21细胞的转染率分别达到最高，其效果均与Lipofectamine 2000相当。该研究表明葡聚糖-精胺阳离子聚合物是一种高效的基因载体。     

EGFP基因在不同细胞中的转染效率

目的旨在比较EGFP基因不同细胞中的转染效率。方法本试验使用阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)介导质粒pEGFP-N1转染AAV-293、NIH-3T3、CEF3种细胞,转染48h后在荧光倒置显微镜下观察,并分析转染效率。结果 3种细胞系都能够观察到绿色荧光。结论 EGFP基因在NIH-3T3细胞中的转染效率最高,其次是AAV-293细胞,而在CEF细胞中转染效率较低。     

脂质体转染技术进展及其应用

细胞转染是将目的基因导入细胞中 ,是研究基因功能和基因治疗的重要技术之一。细胞转染的成功的关键在于设计一种安全、高效的载体 ,能够将目的基因高效、特异地导入细胞中 ,而且要使其对细胞的毒性减到最低程度。与使用病毒性载体相比 ,使用非感染性载体 -脂质复合体日益受到人们的关注。     

壳聚糖纳米粒子介导TFPI基因转染的实验研究

目的：评价壳聚糖纳米粒子携带组织因子途径抑制因子（tissue factor pathway inhibitor,TFPI）基因转染的效率及其细胞毒性。方法：制备壳聚糖纳米粒子-TFPI基因复合物，检测其粒度。zeta电位。包埋效率。以Lipofectamine2000为对照，观察血管平滑肌细胞系A10对壳聚糖TFPI基因纳米复合物的摄入速度和数量；利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测体外转染效果；应用噻唑蓝（MTT）评价壳聚糖纳米粒子的体外细胞毒性。结果：壳聚糖TFPI基因纳米复合物的平均粒径约为141nm，zeta电位为6．8mV；其DNA包埋效率和DNA含量分别为（98．8±34）％和（38．1±2．3）％。A10细胞的摄入和转染实验显示其效率与商品化的细胞转染试剂Lipofectamine2000相近，但是其毒性远低于Lipofectamine2000。结论：壳聚糖纳米粒子可高效携带TFPI基因转染平滑肌细胞，而且对细胞基本无毒性。     

阳离子膜融合脂质体介导反义寡核苷酸在Hela细胞中的转染实验研究

目的研究阳离子膜融合脂质体(CFL)介导反义寡核苷酸(ASON)的细胞转染效率及影响因素。方法 逆相蒸发法制备3种不同阳离子含量的脂质体(CL),在CL上引入仙台病毒形成CFL,将制得的阳离子膜融合脂质体与反义寡核苷酸混合得到复合物,考察形态学及载药量,用MTT法考察该载体的细胞毒性,流式细胞仪测定阳性细胞百分率和平均荧光强度。结果制得的CFL形态均匀,粒径为(168±65) nm。载药量随着磷脂/ASON(+/-)电荷比增加而增加。CFL细胞毒性明显低于相同电荷比的CL,细胞转染效率是随阳离子含量、磷脂/ASON(+/-)电荷比增加而增加,血清和低温均对CFL的细胞转染有影响。结论阳离子膜融合脂质体作为载体在低电荷比条件下可降低细胞毒性并可提高细胞转染效率,可作为该ASON的给药系统而进一步研究。