周期性牵张应力作用下成肌细胞ROS生成及其与JNK和NFkappaB的交互对话

目的探讨不同应力作用下成肌细胞内ROS产生的量J、NK和NFkappaB的活化程度以及它们间的交互对话。方法利用Flexercell细胞加力仪对体外培养C2C12成肌细胞施加不同频率、不同幅度的牵张应力。细胞计数、MTT实验检测应力条件下细胞的活性,通过荧光染料检测ROS的生成,荧光报告系统检测NFkappaB的活性以及Western Blot检测磷酸化和总体JNK1的水平,分析三者之间的交互对话关系。结果随着周期性应力的增加,细胞内ROS生成逐渐增加。随着应力的增大,细胞的凋亡逐渐增加,与此同时J,NK1活性逐渐增高,而JNK1表达水平并没有明显改变。与ROS生成量和JNK1活化逐渐增加不同,应力在10%以下时NFkappaB的活性随着应力的增大而增大,而当应力大于15%时,NFkappaB活性开始下降。结论当ROS的量积累到一定的时候J,NK开始激活,而ROS的量较低的时候,NFkappaB被激活。     

周期性牵张应力下成肌细胞面积、周长的变化研究

目的基于成熟的细胞力学加载和细胞图像处理、分析方法,从细胞层次上定量观察成肌细胞周期性牵张应力加载后的面积、周长的时间改建效应。方法通过4点加力装置给成肌细胞施与各种时间段的生理性牵张应力(0.1Hz,2000μstrain),在相差显微镜下观察并记录细胞形态变化;借助计算机细胞图像处理和分析系统对成肌细胞形态进行定量分析。结果加力组和对照组的成肌细胞面积、周长测量值在加力0.5、1.0、2.0h后,两者差异不大,加力4h后两者的差异开始出现,加力8h后两者的差异变得明显;随着加力时间的延长,加力组和对照组间细胞形态参数测量的差别越来越明显。而去除细胞力学刺激后,成肌细胞形态都出现回复趋势。结论连续加力时细胞形态面积、周长变化明显,而停止加力后细胞面积、周长有回复的趋势。     

机械应力对大鼠成肌细胞凋亡的影响

目的：探讨周期性张应力对大鼠成肌细胞凋亡的影响及Caspase-3凋亡通路在此过程中的作用。方法：采用细胞体外加力装置将不同强度的周期性牵张力施加于体外培养的大鼠成肌细胞,24h后,立即使用流式细胞仪对各组凋亡细胞计数,统计学分析,Western-blot检测各组细胞内Caspase-3表达变化。同时采用Caspase-3抑制剂对照检测,进一步明确Caspase-3的具体作用。结果：随周期性牵张力强度的增加,细胞凋亡比例也随之增加,当牵张力达到20%细胞表面拉伸率时,凋亡细胞比例由不加力时的4.18%增加到7.78%,细胞内Caspase-3含量也呈强度依赖性升高,相对OD值由0.027增加到0.081,这一凋亡过程可被Caspase-3的抑制剂所阻断。结论：周期性张应力可以导致大鼠成肌细胞凋亡,并呈强度依赖性,该过程是由Caspase-3凋亡通路介导的。     

周期性机械应力诱导的自噬抑制caspase通路依赖的成肌细胞凋亡

目的 观察大鼠成肌细胞（L6 myoblast,L6）在周期性机械应力作用下细胞凋亡与自噬的水平变化,探讨机械应力诱导的细胞自噬对凋亡的作用。方法 构建大鼠成肌细胞力学刺激模型,加载参数为细胞拉伸形变率15%,加力周期包括 3 s 拉伸及 3 s 舒张,加力时间为 6、12、24 h,以不加力0 h组为对照组。通过Hoechst染色及AnnexinV-FITC/PI染色观察各组细胞凋亡情况;通过MDC染色及透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）评价各组细胞自噬变化;应用 Western 免疫印迹检测各组凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax及自噬相关蛋白LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62表达变化。加入自噬抑制剂3-MA后重复实验,检测各组细胞凋亡情况。采用 SPSS 17.0 软件包对数据进行统计学分析。结果 Hoechst染色及AnnexinV-FITC/PI流式结果表明,大鼠成肌细胞在周期性应力诱导下发生凋亡,24 h 时达到凋亡最大值。Western 免疫印迹结果显示,凋亡相关蛋白表达水平随加力时间延长而逐渐升高, caspase抑制剂z-VAD-fmk有效抑制应力诱导的细胞凋亡。MDC染色及TEM扫描电镜显示,大鼠成肌细胞在周期性应力诱导下发生自噬,24 h细胞自噬达到最大值。Western 免疫印迹结果显示,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ随加力时间延长而升高,P62的表达随着加力时间延长而降低。加入自噬抑制剂3-MA后重复试验,发现应力诱导的成肌细胞凋亡被明显抑制。结论 周期性机械应力诱导大鼠成肌细胞发生自噬与caspase通路依赖的细胞凋亡,细胞自噬作为一种代偿机制,保护性地抑制应力诱导的细胞凋亡。     

周期性牵张应力下成肌细胞形态指数、长度变化的初步研究

目的 建立成肌细胞的定量形态学研究体系,研究周期性牵张应力下成肌细胞长度、形态指数的初步变化规律.方法 通过四点加力装置给细胞施与各种时间段的生理性牵张应力,在相差显微镜和扫描电镜下观察并记录成肌细胞长度、形态指数的变化,借助计算机图像处理和分析系统进行定量分析.结果 加力组和对照组的成肌细胞长度、形态指数在加力0.5 h、1 h、2 h后,两者差异不大,加力4 h后两者的差异开始出现,加力8 h后两者的差异变得明显;随着加力时间的延长加力组和对照组间成肌细胞长度、形态指数差异越来越明显.而加力12-12 h时,由于细胞力学刺激的去除,成肌细胞长度、形态指数出现回复趋势.结论 连续加力时成肌细胞长度、形态指数变化明显,而停止加力细胞纵向形态有回复的趋势.成肌细胞在周期性牵张应力作用下具有顺应应力方向改建的特性.     

新型周期性细胞压缩牵张仪的研制与应用

目的设计制作一种新型细胞加载系统,能在相同条件下对细胞施加压缩应力或者牵张应力。方法利用弹性膜片应力应变呈线性关系的原理,进行细胞加力装置和微电脑运动控制器的设计。结果设计的细胞加载系统可精确控制施加应力大小和频率,初步的细胞加载试验表明设计达到预期效果。结论利用此新型周期性细胞压缩牵张仪建立的细胞加载模型,可模拟口腔正畸临床中,牙槽骨一侧细胞受压,一侧细胞受牵张的现象。     

周期性牵张体外培养面颌成肌细胞肌浆网Ca2+-Mg2+ATP酶活性及其mRNA变化的研究

目的　观察牵张引起的成肌细胞内Ca2+-Mg2+ATP酶活性及mRNA变化,探求口腔正畸功能矫形治疗中肌肉改建机理,为正畸临床治疗及防止复发提供理论性指导。方法　采用四点弯曲加力装置,使体外培养的SD大鼠面颌部成肌细胞发生牵张变形后,无机磷-钼酸铵直接比色法测定加力后不同时段Ca2+-Mg2+ATP酶活性,RT- PCR测定肌浆网Ca2+-Mg2+ATP酶mRNA变化。结果　SD大鼠体外培养成肌细胞在加力变形后的4 h内Ca2+- Mg2+ATP酶活性显著降低,8 h到24 h期间明显升高,48 h基本接近对照组水平;此外,RT-PCR结果显示成肌细胞受牵张力后Ca2+-Mg2+ATP酶mRNA水平在各时间段组均较对照组升高,其中以2 h和48 h段组升高最明显。结论　随着受力时间的延长,成肌细胞发生了适应性变化,Ca2+-Mg2+ATP酶活性变化的控制发生在基因翻译前水平,Ca2+-Mg2+ATP酶活性及其mRNA变化会直接影响对细胞内游离Ca2+浓度的调节,继而引起细胞内发生的一系列生物学反应的变化。     

内质网应激关键因子PREK在应力加载下成肌细胞凋亡中的作用及机制

目的 研究周期性张应力对L6大鼠成肌细胞凋亡的影响,探讨蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)在这一过程中的作用及机制。方法 构建L6细胞力学刺激模型,加载参数为细胞拉伸形变率15%,频率10个循环/min,每循环包括3 s拉伸及3 s舒张,加力时间为2、6、12、24 h,以不加力组为对照组。应用DAPI染色观察各组细胞凋亡情况;应用实时荧光定量PCR检测各组PERK、CHOP mRNA的表达;应用Western免疫印迹检测各组PERK、p-PERK的表达变化。加入PERK抑制剂后重复实验,检测各组细胞凋亡情况,PERK、CHOP mRNA 的表达变化及p-PERK的蛋白表达变化。采用SPSS17.0软件包进行统计学分析。结果 DAPI染色显示,L6大鼠成肌细胞在周期性应力诱导下发生凋亡,24 h时达到凋亡最大值。PERK被抑制后,加力组的细胞凋亡程度与对照组无显著差别。RT-PCR 结果显示,随着加力时间的延长,CHOP mRNA 的表达逐渐增加;PERK mRNA 表达无差异。Western免疫印迹结果显示,p-PERK蛋白表达水平随加力时间延长而逐渐升高,总蛋白PERK的表达无明显变化;加入PERK抑制剂后,CHOP的mRNA表达与对照组无显著差异,p-PERK蛋白表达与对照组无显著差异。结论 内质网应激关键因子PERK参与了周期性应力条件下的成肌细胞凋亡,其作用机制可能与PERK磷酸化有关。     

钙调神经磷酸酶-T细胞核因子信号通路在应力诱导成肌细胞凋亡中的作用

目的 探讨钙调神经磷酸酶（CaN）-T细胞核因子（NFAT）信号通路在应力介导的成肌细胞凋亡中的作用。方法 构建成肌细胞体外培养-力学刺激模型,利用多通道应力加载系统对细胞加载不同时间的周期性张应力,加入CaN的特异性抑制剂环孢素（CsA）作为对比。采用Hoechst 33258染色法和流式细胞术检测成肌细胞凋亡情况,实时聚合酶链式反应检测CaN和NFAT mRNA的表达情况,蛋白质印迹法检测NFAT3的蛋白含量。结果 随加力时间的延长,细胞凋亡逐渐增加,CaN亚基CnA、CnB及NFAT3的mRNA表达及NFAT3蛋白含量逐渐升高;加入 CsA后,细胞凋亡减少,CnA、NFAT3的mRNA表达及NFAT3的蛋白含量明显减少。结论 周期性张应力可以诱导成肌细胞发生凋亡;CaN-NFAT信号通路可能参与了周期性张应力诱导的成肌细胞凋亡。     

牵张应力特征和成骨细胞生物学效应的体外研究现状

成骨细胞的体外培养,有助于研究和阐明牵张应力下骨组织适应性改建的机制。牵张力能有效促进成骨细胞的活性,因此是近年来研究的热点。尽管直接施加在骨骼上的力能够测量,但是成骨细胞周围的机械力学微环境却很难估计。迄今为止,已经设计出多种机械装置,能够产生单轴或双轴牵张力。根据实验目的不同,研究者常选择不同的加力参数,如力值大小、波形、频率、周期数及加力时间等。尽管这些体外实验的结果不尽相同,但仍然可以归纳出成骨细胞在牵张应力下的一些生物学特征。本文就牵张应力及其相应的力学装置、牵张力调控成骨细胞增殖分化的机制和牵张应力各施力参数对成骨细胞的影响做一综述。理解这些特性,对于骨再生和骨生物工程的临床应用具有重要指导意义。     

低强度周期性应力对骨骼肌细胞增殖分化调控的机制

目的：探明低强度周期性应力调控骨骼肌细胞增殖分化的分子机制.方法：采用Flexercell Strain Unit系统对C2C12成肌细胞加载5％牵张应力,观察细胞增殖和分化情况,检测成肌细胞分化标志基因myogenin等的表达情况,荧光报告系统检测NFkappa B的活性,microRNA特异性荧光定量PCR检测miR146a在增殖和分化条件下表达差异.结果：在5％周期性牵张应力作用下,成肌细胞分化受到抑制;无论增殖条件还是分化条件下,低强度拉伸均可以导致miR146a升高,但在分化条件下更为明显（P＜0.05）;分化条件下组成性的NFkappa B的活性低于其在增殖条件下的活性（P＜0.05）.结论：低强度应力抑制骨骼肌细胞分化,可能是通过miR146a的升高从而抑制NFkappaB的活性引起的.     

周期性牵张面颌致成肌细胞内Ca2+浓度变化的研究

目的观察牵张引起的成肌细胞内Ca2+浓度变化,探求口腔正畸功能矫形治疗中肌肉改建机制。方法采用四点弯曲加力装置,使体外培养的SD大鼠面颌部成肌细胞发生牵张变形后,测定加力后不同时段及在镜下给予乙酰胆碱(Ach)后成肌细胞内Ca2+荧光强度的变化。结果牵张引起的成肌细胞内Ca2+荧光强度的升高明显高于Ach的作用,并且在经历了体外的牵张加力后,Ach刺激并未使成肌细胞内Ca2+荧光强度出现预先设想的叠加效果,在各个不同的实验组中Ca2+荧光强度反而略有下降。结论牵张引起的骨骼肌细胞内Ca2+浓度升高的机制不同于肌肉兴奋收缩耦联过程中出现的Ca2+浓度升高,Ca2+作为第二信使引发的细胞内各种结构和功能蛋白的改变可能参与了肌肉改建过程。     

功能矫形状态下的翼外肌适应性重建

面颌部肌肉组织在牙颌面畸形的发生、发展、矫治和疗效维持中起着重要的作用,其结构和功能可以随外界刺激的改变而发生适应性重建,这也是正畸医生能通过矫形力调控其重建的基础。其中,翼外肌是面颌部重要的咬肌之一,在功能矫形治疗中对维持颞颌关节的关节盘和髁突稳定的功能位置关系起重要作用。在此过程中,成肌细胞是应力刺激的感受器和应力刺激翼外肌重建的效应器。深入研究成肌细胞的力学信号转导机制对于阐明功能矫形过程中翼外肌重建的机制十分必要,本文就功能矫形状态下翼外肌细胞适应性重建的功能矫形的原理、翼外肌与功能矫形和成肌细胞与功能矫形研究进展作一综述。     

细胞外信号调节蛋白激酶1/2在介导周期性牵张力对牙周膜细胞成骨分化中的作用

目的 研究周期性牵张力刺激下细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）1/2对牙周膜细胞成骨分化的分子调控机制。方法 组织块法培养人牙周膜细胞。采用多通道应力加载系统对细胞施加频率0.5 Hz、振幅10%的周期性牵张力（加力时间1、3、6、12、24 h）,以不加力的细胞作为对照,并分别在加力前应用ERK1/2通路特异性抑制剂U0126以及对细胞转染ERK1/2显性负相变异体（DN-ERK1/2）。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time PCR）及蛋白质印迹法研究人牙周膜细胞的基因蛋白水平变化。结果 加力后人牙周膜细胞的p-ERK1/2蛋白水平及骨钙蛋白（OCN） mRNA、骨涎蛋白（BSP）mRNA水平均显著升高,Runt相关基因（Runx）2 mRNA及蛋白水平在加力3、6 h均显著升高。加入抑制剂U0126或细胞转染DN-ERK1/2后,Runx2、OCN、BSP mRNA水平以及Runx2、p-ERK1/2蛋白水平均降低。结论 ERK1/2是周期性牵张力刺激下牙周膜细胞成骨分化的重要分子途径,力学刺激下激活的ERK1/2可能通过提高Runx2蛋白的表达水平而参与成骨基因OCN和BSP的转录表达。     

Apoptotic gene expression by human periodontal ligament cells following cyclic stretch

Xu C, Hao Y, Wei B, Ma J, Li J, Huang Q, Zhang F. Apoptotic gene expression by human periodontal ligament cells following cyclic stretch. J Periodont Res 2011; 46: 742–748. © 2011 John Wiley & Sons A/S Background and Objective: Periodontal ligament cells play an important role in maintaining homeostasis of periodontal tissue upon mechanical force loading caused by mastication or orthodontic force. Previous studies revealed force‐driven periodontal ligament cell death via apoptosis, but the force‐sensing genes assigned to the apoptotic pathway have not been fully characterized. The present study aimed to identify force‐sensing genes implicated in the apoptotic pathway in periodontal ligament cells. Material and Methods: Human periodontal ligament cells were exposed to 20% stretch strain for 6 or 24 h, and the differential expression of 84 genes implicated in the apoptotic pathway were quantified by real‐time PCR array technology. Results: Ten and 11 genes showed upregulated expression after 6 and 24 h stretches, respectively, and there were two downregulated genes in response to both 6 and 24 h stretches. These genes included those encoding the tumor necrosis factor ligand family (TNFSF8), tumor necrosis factor receptor family (FAS, TNFRSF10B, TNFRSF11B, TNFRSF25 and CD27), the Bcl‐2 family (BAG3, BAK1, BCL2L11 and BCLAF1), the caspase family (CASP5 and CASP7), the inhibitor of apoptosis proteins family (BIRC3, BIRC6 and NAIP), the caspase recruitment domain family (RIPK2 and PYCARD) and the death domain family (DAPK1), as well as an oncogene (BRAF). Conclusion: This study identified several force‐sensing genes implicated in the apoptotic pathway in periodontal ligament cells and should facilitate future studies on force‐driven apoptosis by providing putative target genes.     

雌二醇和白藜芦醇二聚体对颏舌肌成肌细胞HIF-1α的作用及机制

目的: 研究雌二醇（17β-estrodial,E2）和白藜芦醇二聚体（resveratrol dimer,RD）对低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）的作用及其分子生物学机制。方法: 提取小鼠颏舌肌成肌细胞,构建ERα敲降的成肌细胞（KD组）低氧模型,将成肌细胞（NS组）和KD组细胞分别低氧、低氧+E2、低氧+RD或低氧++E2+LY294002处理24 h, 利用Western免疫印迹方法检测信号分子T-Akt和P-Akt的表达,qRT-PCR和 Western免疫印迹检测HIF-lα的表达水平。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 低氧环境下成肌细胞HIF-1α的表达显著高于常氧（P<0.05）,E2或RD处理后,HIF-1α的表达水平显著低于低氧组（P<0.05）;ERα敲降后,低氧也促进HIF-1α的表达（P<0.05）,但是E2或RD+低氧处理组成肌细胞HIF-1α的表达与低氧相比无显著差异（P>0.05）,Western免疫印迹结果与RT-PCR结果趋势一致。PI3K/Akt通路抑制剂与E2共培养则促进HIF-1α的表达（P<0.05）。结论: ERα在E2或RD对小鼠颏舌肌成肌细胞HIF-1α的抑制中起主导作用,其下游PI3K/Akt信号通路在该抑制效应中也发挥重要作用。