奥曲肽上调Smad4表达抑制肝癌细胞生长

目的观察奥曲肽（octreotide,OCT）对Bel7402人肝癌细胞内Smad4调节及其对肝癌细胞的抑制作用。方法以MTr法测量OCT对Bel7402细胞增殖的影响,光镜下观察细胞形态的变化。以细胞迁移实验和粘附实验观察细胞侵袭和粘附能力的影响。以流式细胞仪检测细胞周期和Smad4蛋白的变化。以裸鼠人肝癌种植模型,观察OCT对种植瘤生长的影响,以免疫组化观察种植瘤内Smad4蛋白的表达。以半定量RT—PCR观察体内外Smad4mRNA的表达。结果OCT处理的Bel7402细胞增殖能力和细胞形态无明显改变,细胞的侵袭和粘附能力明显下降,细胞生长静止期（G0／G1）的比例显著增加（48．0％±3．2％vs57．7％±0．9％）,OCT明显抑制裸鼠人肝癌种植瘤的生长,抑瘤率达到67．9％。体外OCT流式细胞仪检测治疗组种植瘤内Smad4蛋白（6．36±1．22）的表达显著高于对照组（3．22±1．20）。体内外Smad4 mRNA的表达,治疗组（0．701±0．035,1．091±0．131）也明显高于对照组（O．531±O．073,0．634±0．222）。结论OCT能显著抑制体内外肝癌细胞的生长,上调肝癌细胞内Smad4的表达可能是其抑瘤的重要机制。     

奥曲肽抑制裸鼠肝癌原位种植瘤生长机制的研究

目的观察奥曲肽(OCT)抑制肝癌生长的效果,对其抑瘤作用的机制进行深入的探讨。方法以裸鼠肝癌原位种植瘤模型,观察OCT对种植瘤生长的影响,以免疫组化观察OCT对种植瘤内生长抑素受体2(SSTR2)、肝细胞生长因子受体(cMet)、转化生长因子β1(TGFβ1)、磷酸化Smad2、Smad4和Smad7蛋白的表达,以半定量逆转录聚合酶链反应观察SSTR2和Smad4mRNA的表达。结果OCT明显抑制裸鼠人肝癌种植瘤的生长[(0.17±0.14)gvs.(0.53±0.06)g],抑瘤率达到67.9%;治疗组种植瘤内SSTR2和Smad4mRNA和蛋白的表达均显著高于对照组;cMet的蛋白表达显著下降;TGFβ1、磷酸化Smad2和Smad7的蛋白表达两组差异无统计学意义;此外,肿瘤内磷酸化Smad2的表达显著低于正常肝脏。结论OCT能显著抑制裸鼠肝癌原位种植瘤的生长,其机制可能与上调SSTR2表达、下调cMet表达以及促进TGFβ抑制信号的传导,恢复TGFβ/Smads系统的抑瘤功能有关。此外,磷酸化Smad2表达的降低可能是Bel7402肝癌细胞的重要特征之一。     

生长抑素通过调节生长抑素受体和Cmet表达抑制肝癌生长

目的 观察生长抑素(SST)对Bel7402肝癌细胞株增殖侵袭黏附能力和对裸鼠种植瘤生长的影响，并对SST抑瘤机制进行一定的探索。方法 以噻唑蓝(MTT)法测量SST、对Be17402细胞增殖的影响，光镜下观察细胞形态的变化。以细胞迁移实验和黏附实验观察细胞侵袭和黏附能力的影响。以流式细胞仪检测细胞表面肝细胞生长因子受体Cmet和生长抑素受体2(SSTR2)的表达和细胞周期的影响。以裸鼠人肝癌转移模型为材料，观察SST对种植瘤生长的影响。以免疫组织化学观察SSTR2和Cmet的表达影响。结果SST处理的7402细胞增殖能力和细胞形态无明显改变，细胞的侵袭和黏附能力明显下降，细胞生长静止期(G0／G1)的比例显著增加，但未见凋亡峰，细胞表面Cmet的表达明显受抑，但SSTR2的表达增加，裸鼠人肝癌种植瘤在SST治疗后生长受到明显抑制，免疫组织化学也可见种植瘤内SS TR2表达增加，而Cmet的表达明显受抑制。结论 SST通过与SSTR起作用抑制肝癌的生长。减少Cmet的表达是SST起作用的重要方式。此外，长期的SST治疗可以上调SSTR2的表达，加大SST抑制肝癌的效果，但短期的处理反而诱导SSTR2的脱敏和抑瘤效果下降。     

奥曲肽抑制肝癌切除术后复发转移的研究

目的　探讨奥曲肽对裸鼠肝癌切除术后复发转移的抑制作用。方法　应用LCI D2 0裸鼠人肝癌转移模型 ,于种植后第 10天行肝癌切除术 ,采用不同剂量的奥曲肽治疗 ,观察肿瘤肝内复发、肝外转移情况。采用LCI D2 0裸鼠角膜微囊移植模型 ,观测奥曲肽对肝癌诱导肿瘤血管形成能力的影响。结果　对照组肺转移率、肝内复发率为 10 0 % ,复发癌灶体积为 ( 1164 .7± 471.3 )mm3;10 0 μg/kg治疗组则分别为 40 %、60 %、( 81.5± 17.1)mm3;2 0 0 μg/kg治疗组则分别为 0、40 %、( 9.0± 6.8)mm3。奥曲肽可明显抑制LCI D2 0肝癌组织诱导的角膜新生血管形成。结论　奥曲肽能抑制高转移性人肝癌切除术后的复发转移 ,并呈量效关系 ;抑制肝癌新生血管形成可能是其作用机制之一。     

奥曲肽抑制转化生长因子α诱导肝癌细胞增殖的实验研究

目的探讨奥曲肽对转化生长因子α（TGF-α）诱导肝癌细胞增殖的抑制作用及其机制。方法用免疫组化法观察奥曲肽对TGF-α诱导肝癌细胞增殖的影响，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测奥曲肽对肝癌细胞TGF-α分泌和表皮生长因子受体（EGFR）表达的影响，用Western-blot法、免疫组化法检测奥曲肽对细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）的影响。结果奥曲肽明显抑制细胞核内TGF-α诱导的增殖细胞核抗原（PCNA）表达，使肝癌细胞TGF-αmRNA指数较对照组降低（P〈0．05），对TGF-α诱导的EGFR mRNA指数的增加具有明显抑制作用。Western-blot显示，奥曲肽明显抑制TGF-α诱导的ERK蛋白表达；免疫组化显示，TGF-α作用后，胞核染色明显加深，奥曲肽与TGF-α同时作用后胞核染色明显减弱。结论奥曲肽可能通过抑制肝癌细胞分泌TGF-α，抑制EGFR表达和阻断EGFR信号传导，从而抑制TGF-α诱导的肝癌细胞增殖。     

瘤内注射奥曲肽对大鼠移植性肝肿瘤PCNA表达的影响

目的：探讨奥曲肽瘤内注射对大鼠移植性肝肿瘤PCNA表达的影响。方法：30只大鼠移植性肝肿瘤模型随机分为奥曲肽组、盐水组、酒精组三组,分别瘤内注射奥曲肽0.02mg、生理盐水0.2mL、无水酒精0.2mL,3d及8d后分别测定肿瘤组织中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达情况。结果：治疗3d后,奥曲肽组的PCNA表达低于无水酒精组和生理盐水组的表达（P〈0.05）。8d后,奥曲肽组的PCNA表达明显低于无水酒精组和生理盐水组的水平（P〈0.05）。结论：瘤内注射奥曲肽可抑制大鼠移植性肝肿瘤的生长。     

奥曲肽与胰岛素对人肝癌细胞影响的实验研究

目的：探讨在体外胰岛素能否促进人肝癌细胞增殖,奥曲肽对其诱导的增殖活动有无抑制作用。方法：将奥曲肽与胰岛素直接作用于体外培养的人原发性肝癌细胞株,运用MTT、直接细胞计数及流仪测定等方法观察奥曲肽与胰岛素对肝癌细胞的活细菌数及其比值,细胞总数、细胞周期及增殖指数（PI）的影响。结果：胰岛素（0－5μg/ml)使人肝癌细胞株BEL0－7402的细胞总数、活细胞数及其比值增加;而奥曲肽（0－2μg/ml）则使细胞基础的及胰岛素刺激的细胞总数、活细胞数及其比值下降,5μg/ml的胰岛素增加细胞的PI值而1μg/ml的奥曲肽降低其PI值（P＜0．05）,并产生S期限滞作用。结论：在体外,胰岛素可诱导人肝癌细胞增殖,奥曲肽不仅直接抑制肝癌细胞的增,对胰岛素诱导的肝癌细胞增殖也有抑制作用。     

StealthTM RNAi沉默人肝癌细胞Bcl-2表达抑制体外移植瘤生长的研究

目的探讨StealthTMRNAi抑制Bcl-2基因表达对体内移植瘤生长的影响。方法通过合成的人肝癌Bcl-2基因干扰序列转染入肝癌细胞内并从皮下移植到裸鼠,免疫组化检测瘤组织中Bcl-2蛋白的表达。结果荧光显微镜下显清晰的绿色荧光为转染成功细胞;RT．PCR检测转染组Bcl-2基因mRNA的表达水平下调（P〈0．01）。转染StealthTMRNA裸鼠皮下移植肿瘤生长缓慢,与对照组瘤体积比较差异有显著性（P〈0．01）;采用免疫组化法检测注射StealthTMRNA组,Bcl-2蛋白的表达下调（P〈0．01）。结论StealthTMRNAi可抑制Bcl-2基因表达,对移植瘤的生长有抑制作用。     

生长激素和生长抑素对人结肠癌裸鼠移植瘤模型的影响

目的观察外源性生长激素（GH）和生长抑素（SS）对人结肠癌细胞株HT-29裸鼠移植瘤模型肿瘤生长和裸鼠血清蛋白水平的影响。方法接种结肠癌细胞株HT-29建立裸鼠移植瘤模型。比较移植肿瘤体积、细胞周期分布、增殖指数（PI）、凋亡率、bcl-2和bax mRNA水平．以及裸鼠血清蛋白水平。结果生长抑素能够明显抑制移植瘤的生长（P〈0．05）、降低移植瘤PI（P〈0．05）、促进移植瘤细胞凋亡（P〈0．01）、降低移植瘤bcl-2mRNA表达（P〈0．05）、提高移植瘤baxmRNA表达（P〈0．05），生长激素则表现出相反的作用。生长激素能够改善移植瘤导致的低蛋白血症（P〈0．05）。结论外源性生长抑素能够显著抑制人结肠癌裸鼠移植瘤生长，外源性生长激素单独或联合生长抑素应用能够改善荷人结肠癌移植瘤裸鼠低蛋白血症，但具有潜在的促进肿瘤生长的作用。     

RASSF1A基因表达对人肝癌细胞株QGY-7703生长的影响

目的观察RASSFlA基因的表达对人肝癌细胞株QGY-7703在体内外生长的影响。方法利用已构建成功的稳定表达RASSFlA基因的肝癌细胞株QGY-7703，通过细胞生长曲线、软琼脂集落形成试验、细胞周期的测定和裸鼠致瘤性试验对各稳定表达株的生物学行为进行检测。结果以未转染的QGY-7703为对照，RASSFlA基因的表达可明显抑制肝癌细胞在体外的生长速度，使肝癌细胞周期阻滞在G1／S期，显著降低肝癌细胞在软琼脂中形成的克隆数目（P〈0．01）和大小，显著减慢裸鼠皮下瘤的生长速度和重量（P〈0．01）。空载体的表达对肝癌细胞的生长影响不明显。结论RASSFlA的重表达抑制肝癌细胞在体内外的生长；RASSFlA基因是一个新的肝癌相关的抑癌基因。     

上调miR-449a表达对肝癌细胞生长和侵袭能力的影响

目的:探讨miR-449a在肝癌(HCC)细胞中的表达及其对HCC细胞生物学行为的影响。方法:用qRT-PCR检测miR-449a在正常肝细胞L02和4种HCC细胞株(HepG2、Hep3B、SMMC-7721和Bel-7402)的表达。用脂质体法将miR-449a模拟物或阴性对照序列转染HCC细胞后,分别用CCK-8法、流式细胞术、Transwell小室实验检测细胞增殖、细胞周期、侵袭能力的变化,并观察以上两种不同转染的HCC细胞在裸鼠体内的成瘤情况。结果:miR-449a在4种HCC细胞株的表达水平均明显低于L02细胞(均P0.05),其中在Bel-7402细胞表达的水平最低。与转染阴性对照序列的Bel-7402细胞比较,转染miR-449a模拟物的Bel-7402细胞增殖活性明显降低、G_1/S期阻滞明显增加、穿室细胞数明显减少(均P0.05);与转染阴性对照序列的Bel-7402细胞比较,转染miR-449a模拟物的Bel-7402细胞在裸鼠体内成瘤后的移植瘤质量与体积均明显减小(0.748 g vs.1.234 g;33.667 mm~3 vs.1 400.500 mm~3,均P0.05)。结论:HCC细胞中miR-449a表达降低,上调miR-449a表达可以抑制HCC细胞在体内外的生长。     

KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因联合survivin基因干扰抑制肝癌细胞生长的体内研究

目的：探讨腺病毒介导的KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因系统（Ad-KDRP-CD/TK）联合survivin基因干扰对肝癌细胞在裸鼠体内生长的抑制作用。
　　方法：将20只裸鼠随机分均为模型组（皮下植入BEL-7402肝癌细胞成瘤,不加任何处理）、双自杀基因转染组（皮下植入转染Ad-KDRP-CD/TK的BEL-7402细胞,成瘤后瘤内注射前药更昔洛韦与5-氟胞嘧啶）、survivinsiRNA转染组（皮下注射BEL-7402肝癌细胞,成瘤后瘤内注射survivinsiRNA/Lip-DMEM转染混合物）、联合转染组（双自杀基因转染+survivinsiRNA转染处理）。治疗2周后处死各组小鼠,称取肿瘤质量,计算肿瘤抑制率,检测瘤组织微血管密度（MVD）及survivinmRNA与蛋白表达。结果：各治疗组的肿瘤质量明显小于模型组（均P<0.05）,且联合转染组的抑瘤率最大（均P<0.05）;肿瘤组织MVD、survivinmRNA与蛋白水平均明显降低,且联合转染组的降低程度最为明显（均P<0.05）。
　　结论：双自杀基因联合survivin干扰是抑制鼠肝癌细胞在体内生长的有效途径。     

腺病毒介导反义基质金属蛋白酶-2抑制肝癌生长和血管生成的研究

目的探讨携带反义二型基质金属蛋白酶（MMP2）基因的重组腺病毒（Ad-MMP2AS）对人肝癌动物模型生长和血管生成的抑制作用。方法用我们构建的Ad-MMP2AS感染人肝癌细胞株（Bel-7402）。Boyden Chamber检测Ad-MMP2AS对Bd-7402细胞降解人工基底膜（Matrigel）的抑制作用；Western blotting和明胶酶谱分析测定Ad-MMP2AS对Bel-7402细胞分泌MMP2的影响；用感染Ad-MMP2AS的Bel-7402细胞接种于裸鼠皮下观察其成瘤能力；Ad-MMP2AS瘤内注射。观察它对肝癌生长的抑制作用；肿瘤组织切片、HE染色观察瘤细胞生长情况；免疫组织化学分析肿瘤组织血管密度。结果Ad-MMP2AS感染的Bel-7402细胞穿过Matrigel的Bel-7402细胞数下降52％、成瘤量下降4.3倍；瘤内注射Ad-MMP2AS使瘤体生长减少63％；肿瘤组织血管密度减少2.6倍。结论Ad-MMP2AS能抑制肝癌的生长和肿瘤血管的生成，对肝癌有治疗潜力。     

绿脓杆菌制剂抑制肝细胞肝癌生长转移的实验研究

目的 观察绿脓杆菌制剂对裸鼠肝癌生长和转移的抑制作用.方法 将具有肺转移潜能的人MHCC97L肝癌组织块种植于BALB/c nu/nu雄性裸鼠肝脏,建立转移性人肝癌裸鼠原位模型.荷瘤裸鼠随机分为对照组、绿脓杆菌制剂腹腔注射组及皮下注射组.各组均于种植后第3天开始用药,于种植后第6周末处死动物,HE染色观察肿瘤组织坏死情况,荧光Tunel法检测肿瘤组织细胞凋亡情况,测量肿瘤体积,计算抑瘤率、肺转移灶数目及肺转移率.结果 对照组、绿脓杆菌制剂皮下注射组和腹腔注射组肿瘤体积分别为(3.12±0.85)cm~3、(1.90±0.87)cm~3(P>0.05)和(0.79±0.36)cm~3(P<0.05),肺转移率分别为66.7%、66.7%(P>0.05)和0(P<0.01),平均肺转移灶数目分别为2.40±1.85,1.2±0.75(P<0.05)和0(P<0.01),凋亡指数分别为(1.4±0.37)%、(4.1±1.7)%(P<0.05)和(10.3±0.40)%(P<0.01).与对照组比较,绿脓杆菌制剂皮下注射组和腹腔注射组的抑瘤率分别为39.1%和74.7%,腹腔注射组肿瘤组织坏死明显.结论 绿脓杆菌制剂腹腔注射可明显促进肝癌组织坏死及凋亡并抑制其生长和转移.     

跨膜丝氨酸蛋白酶4诱导放疗后肝细胞癌转移的机制研究

目的 探讨跨膜丝氨酸蛋白酶4(transmembrane protease serine 4,TMPRSS4)在放疗后残余肝细胞癌转移中的作用及机制.方法 建立具有肺转移潜能的人肝癌裸鼠原位模型,模拟临床分割放射治疗.将放疗后残余肝癌组织切除后再种植于正常裸鼠肝脏.6周后处死,测量放疗后再种植肝癌体积,计算其肝内移灶数目及肺转移率.HE染色观察放疗后肝癌组织学形态.Westernblot及RT-PCR检测放疗前后肝癌组织内上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关基因及TMPRSS4的表达.结果 对照组肝癌切除再种植后42 d,其肿瘤大小及肺转移率分别为(2.25士0.52)cm3和66.7％,而放疗后2d和放疗后30 d残癌切除再种植组,肿瘤大小分别为(1.61±0.51)cm3 (P＜0.05)和(2.60±0.61)cm3 (P＞0.05),肺转移率分别为12.5％ (P＜0.05)和100％ (P＜0.05).对照组及放疗后2d残癌切除再种植组无肝内转移灶,放疗后30 d残癌切除再种植组肝内转移灶数为18±8.05(P＜0.05).放疗后30 d残癌组织EMT相关蛋白N-cadherin、Vim-entin及TMPRSS4、SIP1的表达显著高于对照组及放疗结束后2d残癌组织,而E-cadherin表达则显著降低.结论 放疗后残癌的转移潜能先降低后增强.放疗后残癌TMPRSS4表达增加进而诱导EMT的发生可能是后期转移潜能增强重要原因之一.     

BTB/POZ结构域蛋白7假基因1在肝细胞癌中的表达 及功能的初步研究

目的:探讨BTB/POZ结构域蛋白7(BTBD7)假基因1(BTBD7P1)在肝细胞癌(HCC)中的表达及功能。方法:检测106例配对的HCC组织与癌旁组织标本中BTBD7P1 m RNA的表达,分析BTBD7P1m RNA表达与HCC患者临床病理特征及预后的关系。用BTBD7P1过表达慢病毒载体转染HCC细胞系Bel7404后,检测细胞增殖率以及BTBD7 m RNA与蛋白的表达。结果:HCC组织中BTBD7P1相对表达量明显低于癌旁组织为(0.71 vs.2.14,P0.05);BTBD7P1m RNA低表达与肿瘤大小、卫星灶、分化程度、静脉血管侵犯、出血坏死、HCC分期明显有关(均P0.05);BTBD7P1 m RNA低表达患者的1、3、5年总体生存率及无瘤生存率均明显低于BTBD7P1m RNA高表达患者(均P0.05)。与转染空载体质粒的对照组Bel7404细胞比较,转染BTBD7P1过表达慢病毒载体的Bel7404细胞,细胞增殖能力明显减低,BTBD7 m RNA表达明显下调(均P0.05),但BTBD7蛋白表达无明显变化(P0.05)。结论:BTBD7P1可能在m RNA水平对亲本基因BTBD7表达进行调控,从而参与了HCC发生与发展。     

小剂量阿司匹林协同干扰素-α抑制肝细胞肝癌生长转移的实验研究

目的 探讨小剂量阿司匹林协同干扰素-α(IFN-α)抑制肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)生长转移的作用及机制.方法 培养具有肺转移潜能的人MHCC97L肝癌细胞.将MHCC97L肝癌组织块种植于BALB/c nu/nu雄性裸鼠肝脏,建立人肝癌裸鼠原位模型.以不同剂量组合的阿司匹林和IFN-α作用于荷瘤裸鼠,测量肿瘤体积,计算肺转移灶数目及肺转移率.用MTT及明胶酶谱实验检测阿司匹林对MHCC97L细胞增殖及金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2,MMP-2)活性的影响.用Western Blot及ELISA检测细胞及血清MMP-2及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白水平.结果 对照组肿瘤体积为(3.12±0.85)cm3,肺转移率为66.7％.大剂量阿司匹林[45 mg/(kg· d)]治疗组肿瘤体积为(1.89±0.88)cm3 (P＞0.05),肺转移率为58.3％ (P＞0.05).而大剂量IFN-α[1.5×107/(kg·d)]治疗组、大剂量IFN-α+大剂量阿司匹林治疗组、小剂量IFN-α [7.5×106/(kg·d)]+小剂量阿司匹林15 mg/(kg· d)]治疗组肿瘤体积分别为(0.69±0.40)cm3、(0.55±0.31)cm3、(0.40±0.43)cm3,均显著低于对照组(P＜0.05),肺转移率均为0(P＜0.05).2 mmol/L阿司匹林对MHCC97L细胞增殖无显著影响(P＞0.05),但可抑制其MMP-2的活性及VEGF的水平.小剂量IFN-α+小剂量阿司匹林治疗组裸鼠血清MMP-2及VEGF显著降低(P＜0.05).结论 小剂量阿司匹林可协同IFN-α抑制HCC生长转移,抑制MMP-2和VEGF的活性和表达是其重要作用机制之一.