自体组织工程化软骨组织在体内最佳形成时间的研究

目的研究探讨自体组织工程化软骨在动物自体内最佳形成时间，为临床应用提供理论研究和参数。方法取猪耳廓软骨细胞，与可注射性生物材料PluronicF127混合形成浓度为50×10     

壳聚糖制作组织工程软骨支架的研究

目的：探讨在动物体内,利用新型生物材料壳聚糖制作软骨组织的可行性。方法：在体外,将培养的兔关节软骨细胞,种植于多聚赖氨酸包埋的壳聚糖支架上。体外培养4周,对组织工程软骨进行标本观察,HE染色,检测软骨内DNA含量。结果：制备的复合支架成形良好,交联后的机械强度明显提高。结论：壳聚糖适合细胞的贴附生长,可作为间充质干细胞的载体。     

壳聚糖制作组织工程软骨支架的研究

目的:探讨在动物体内,利用新型生物材料壳聚糖制作软骨组织的可行性。方法:在体外,将培养的兔关节软骨细胞,种植于多聚赖氨酸包埋的壳聚糖支架上。体外培养4周,对组织工程软骨进行标本观察,HE染色,检测软骨内DNA含量。结果:制备的复合支架成形良好,交联后的机械强度明显提高。结论:壳聚糖适合细胞的贴附生长,可作为间充质干细胞的载体。     

自体组织工程化纤维软骨修复半月板缺损的实验研究

目的：应用组织工程方法在具完全免疫功能的哺乳动物体内修复半月板缺损。方法：15只45日龄的长枫杂交仔猪为实验动物,以改良的Klagsbrun酶消化法从左膝半月板获得的自体纤维软骨细胞在体外扩增至一定数量,在右膝内侧副韧带前方的内侧半月板造成长1cm的全层缺损,分别将复合聚羟基乙酸（PGA）－纤维软骨细胞－Pluronic复合物,纤维软骨细胞－Pluronic复合物和单纯PGA植入缺损,以正常半月板和旷置缺损作为对照,分9,16和25周取材,标本采用大体观察,组织学,生物化学和生物力学作为评估指标。结果：PGA－细胞－Pluronic复合物在大体形态,组织学结构和压弹性模量（25周为正常组的59．7％）方面均显示形成了最佳的修复组织,并使对应股骨髁软骨的糖氨聚糖含量（25周为正常组的74．5％）保持相对稳定。结论：自体组织工程化纤维软骨能够修复乃至再造半月板,并且可以防止膝关节的创伤性退变。     

松质骨骨基质明胶复合软骨细胞构建组织工程软骨

目的 观察软骨细胞在同种异体松质骨骨基质明胶(BMG)上的生长、增殖和分化,探讨用松质骨BMG与软骨细胞体外构建组织工程软骨的效果.方法 分离1月龄兔关节软骨细胞,扩增后种植在松质骨BMG上体外构建组织工程软骨.于1、2、4、6周取材进行组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学及透射电镜观察.结果 软骨细胞在BMG上生长良好,分泌蛋白聚糖和胶原.随培养时间延长,细胞增殖,松质骨BMG空隙内细胞数量增多,软骨陷窝形成,基质分泌增强.培养6周时软骨细胞在BMG表面及孔隙内形成软骨样组织,免疫组织化学染色显示细胞周围基质富含Ⅱ型胶原,分布均匀:透射电镜显示软骨细胞超微结构正常,细胞周围有大量基质产生.结论 同种异体松质骨BMG可以促进软骨细胞的生长增殖,维持软骨细胞的分化表型;在体外成功构建了组织工程软骨,它是一种较好的软骨组织工程支架材料.

Abstract：

Objective To evaluate the use of cancellous bone matrix gelatin (BMG) combined with chondrocytes in constructing tissue-engineered cartilage by observing the growth, proliferation and differentiation of chondrocytes on allogeneic cancellous BMG. Methods The articular chondrocytes isolated from a 1-month-old rabbit were multiplied to a monolayer and seeded onto cancellous BMG to construct tissue-engineered cartilage in vitro during a period of 6 weeks. Samples were taken from the construct after 1, 2,4, and 6 weeks of culture and evaluated by histology, immunohistochemistry and transmission electron microscopy (TEM). Results The chondrocytes excreted matrix proteoglycan and collagen on cancellous BMG. With the prolongation of the culture time, the cells proliferated in the construct and the cells in the lacunae increased. Numerous chondrocytes were present the central region of the cancellous BMG and surrounded by extracellular matrix. By 6 weeks of culture, the BMG was covered with 15-20 layers of chondrocytes and cartilaginous tissue occurred in the pores throughout the cancellous BMG. Immunohistochemical staining showed rich and evenly distributed type Ⅱ collagen around the chondrocytes, and TEM revealed an ultrastructure of the chondrocyte similar to that of native chondroctyes, with abundant extracellular matrix produced around the cells. Conclusion Tissue-engineered cartilage can be constructed in vitro using allogeneic cancellous BMG combined with chondrocytes. Allogeneic cancellous BMG serves as a good scaffold material for tissue-engineered cartilage to promote the growth and proliferation of the seeded chondrocytes and allows maintenance of the differentiation phenotype of the cells.     

重组人骨形态发生蛋白2对壳聚糖-明胶多孔复合支架理化性能的影响

目的 以组织工程学技术为基础,制备壳聚糖-明胶/骨形态发生蛋白2(BMP-2)多孔复合支架,讨论壳聚糖与明胶的不同配比及向复合材料中加入BMP-2对支架的微观结构和理化性能的影响.方法 分别用不同配比的壳聚糖和明胶制备复合支架,并向1组配比中加入BMP-2.以扫描电镜观察支架的表面特征,测定支架的孔径值、材料的吸水率及表观密度.结果 壳聚糖-明胶多孔复合支架比表面积大,内孔结构多形性高、且大量连通;壳聚糖与明胶配比为4∶1时的复合支架孔径最小,孔壁最厚;配比为1∶4时孔径最大,孔壁最薄;壳聚糖与明胶配比为1∶1时吸水率及表观密度达到最大,分别为(318±75)%和(0.085±0.013)g/cm3;向复合支架中加入BMP-2对支架的微观结构、吸水率及表现密度无明显影响.结论应用冷冻干燥法可以成功制备壳聚糖-明胶多孔复合支架,支架的微观结构与理化性能与壳聚糖与明胶的配比密切相关,向支架中加入BMP-2对材料的理化性能无明显影响.     

软骨细胞与壳聚糖复合物体内构建软骨组织的研究

目的探讨利用软骨细胞和新型生物材料壳聚糖动物体内构建软骨组织的可行性。方法体外分离培养猪耳软骨细胞,扩增后以5.0×107/ml的终浓度接种于壳聚糖支架并植入猪皮下。标本于8周后取材,行大体观察、组织学及免疫组织化学等相关检测。结果细胞-生物材料复合物在植入猪皮下8周后形成了单一成熟的软骨组织,并保持了支架材料的大小和形状,免疫组织化学染色结果表明其大量表达软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原。结论壳聚糖是一种良好的生物材料,能够提供软骨细胞生长的三维环境并用于体内构建软骨组织。     

灌流-液压式反应器体外构建组织工程化软骨

目的初步探讨应用灌流-液压式反应器体外构建组织工程化软骨的可行性及其效果。方法消化、分离猪耳廓软骨细胞,接种于聚羟基乙酸支架上培养1周,形成细胞-支架复合物。实验分2组(每组8个样本):实验组放入灌流-液压式反应器连续培养3周;反应器主要参数设置:灌流量100μL/m in,顺、逆时针方向各30 m in,灌流时间开/关各8 h/16 h,液压强度100 kPa,频率0.5 Hz,作用时间4 h/d。对照组则继续在培养皿内培养。第4周时取材,分别从大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组化和生物化学等方面对实验组和对照组形成的软骨组织进行检测和比较。结果大体观察见实验组和对照组均形成了软骨样组织,组织湿重检测实验组为(191.03±18.55)mg,对照组为(130.78±10.33)mg(P<0.01)。组织学观察显示,两组软骨组织内软骨细胞分布均匀,包埋于软骨陷窝内,软骨基质分泌旺盛,局部还有未降解的支架材料。免疫组化染色证实两组形成的软骨组织均有Ⅱ型胶原分布,软骨组织厚度实验组为(3.04±0.13)mm,对照组为(2.14±0.16)mm,两组间比较有显著性差异(P<0.01)。生物化学检测证实,实验组蛋白聚糖含量为(12.63±0.62)mg/g,明显高于对照组的(8.23±0.81)mg/g(P<0.01)。结论利用灌流-液压式反应器能够在体外构建组织工程化软骨,并且可以在一定程度上弥补传统构建方法的不足,提高体外构建软骨的质量。     

灌流-液压式反应器体外构建组织工程化软骨

目的 初步探讨应用灌流-液压式反应器体外构建组织工程化软骨的可行性及其效果.方法 消化、分离猪耳廓软骨细胞,接种于聚羟基乙酸支架上培养1周,形成细胞-支架复合物.实验分2组(每组8个样本):实验组放入灌流-液压式反应器连续培养3周;反应器主要参数设置:灌流量100 μL/min,顺、逆时针方向各30 min,灌流时间开/关各8 h/16 h,液压强度100 kPa,频率0.5 Hz,作用时间4 h/d.对照组则继续在培养皿内培养.第4周时取材,分别从大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组化和生物化学等方面对实验组和对照组形成的软骨组织进行检测和比较.结果 大体观察见实验组和对照组均形成了软骨样组织,组织湿重检测实验组为(191.03±18.55)mg,对照组为(130.78±10.33)mg(P＜0.01).组织学观察显示,两组软骨组织内软骨细胞分布均匀,包埋于软骨陷窝内,软骨基质分泌旺盛,局部还有未降解的支架材料.免疫组化染色证实两组形成的软骨组织均有Ⅱ型胶原分布,软骨组织厚度实验组为(3.04±0.13)mm,对照组为(2.14±0.16)mm,两组间比较有显著性差异(P＜0.01).生物化学检测证实,实验组蛋白聚糖含量为(12.63±0.62)mg/g,明显高于对照组的(8.23±0.81)mg/g(P＜0.01).结论 利用灌流-液压式反应器能够在体外构建组织工程化软骨,并且可以在一定程度上弥补传统构建方法的不足,提高体外构建软骨的质量.     

胶原-壳聚糖复合支架的制备和皮下埋植实验

目前,用于组织工程心脏瓣膜支架的材料主要有2类：人工合成的和天然的可降解聚合物。可降解生物支架是较理想的组织工程心脏瓣膜支架,在体内经一定时间可以降解为小分子化合物,这个降解过程与细胞间质的生长过程同步,降解产物随着体内的代谢排出体外,不留任何异物。作者采用天然生物材料制备了胶原,壳聚糖复合支架,并进行皮下埋植实验,报道如下。     

组织工程技术修复犬牙槽骨缺损的实验研究

目的　研究以犬骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells ,BMSC)为种子细胞 ,利用组织工程技术修复水平型牙槽骨缺损的可行性。方法　抽取成年犬骨髓 ,用梯度离心法获取单个核细胞 ,经条件培养液体外诱导培养后 ,进行组织化学、免疫细胞化学、扫描电镜检测 ,并将培养的第 3代细胞与藻酸钙形成复合物。在犬双侧下颌第 3、4前磨牙和第 1磨牙颊侧制备冠根向深 5mm的水平型牙槽骨缺损 ,用以下方法进行治疗 :(1)细胞 藻酸钙复合物修复组 ;(2 )藻酸钙对照组 ;(3)空白对照组。4、12、2 4周后经组织学检查骨缺损修复情况。并比较 12周时实验组与对照组的修复效果。结果在体外经诱导培养的BMSC可表达AKP、cbfa1、Ⅰ型胶原等 ,表现出成骨细胞活性 ;4、12、2 4周细胞 藻酸钙复合物修复部位显示逐渐有骨形成 ;第 12周时 ,实验组牙槽嵴高度可增高 2 4mm± 0 9mm ,达到原来的 4 8 5 9% ,空白对照组增高 0 8mm± 0 8mm ,达到原来的 15 76 % ,材料对照组增高 1 0mm± 0 9mm ,达到原来的 19 74 % ,实验组的牙槽嵴增高度和修复率与两对照组均有显著性差异(P <0 0 1)。结论　能以BMSC为种子细胞 ,以藻酸钙为支架材料 ,利用组织工程技术部分修复水平型牙槽骨缺损。     

以改良方法制作软骨细胞外基质构建高质量组织工程软骨

目的：探讨应用改良方法制作的软骨细胞外基质（extracellular matrix,ECM）能否构建高质量组织工程软骨。方法：应用传统匀浆?脱细胞方法制作软骨ECM粉末,在此基础上通过物理研磨颗粒筛选获得细腻的软骨细胞外基质粉末（fine extracellular matrix,FECM）。将两种粉末通过冷冻干燥法制成ECM支架和FECM支架作为对照组和实验组。以软骨组织工程中成熟应用的聚乳酸聚羟基乙酸聚合物［poly（lactic?co?glycolic acid）,PLGA］支架为阳性对照组。取等量大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）种植于ECM支架和FECM支架,同时将BMSCs诱导分化为软骨细胞后种植于PLGA支架,然后将3种细胞?支架复合物移植入裸鼠皮下,28 d后取出样本并进行相关检测。结果：FECM支架孔径均一,结构规整,其构建的组织工程软骨在大小、色泽、糖胺多糖（sGAG）分泌以及胶原沉积等方面均远优于对照组构建的组织工程软骨,与阳性对照组无明显差异。结论：由改良方法制作的FECM支架在无外源性转化生长因子?β1（transforming growth factor?β1,TGF?β1）情况下可构建出高质量的组织工程软骨,具有潜在的临床应用价值。     

软骨脱细胞基质多孔支架与骨髓基质干细胞体外构建组织工程软骨的研究

目的 探讨关节软骨脱细胞基质多孔支架(CEDIS)与骨髓基质干细胞(BMSCs)体外培养组织工程软骨的可行性.方法 粉碎人关节软骨,脱细胞处理后差速离心法收集细胞外基质悬液,采用冷冻干燥技术制备三维多孔支架.扫描电镜观察其微观结构,并进行组织学观察,生化成分定量检测其胶原、氨基葡聚糖(GAG)、DNA含量,牛物力学方法测量其干性及覆水状态下压缩弹性模量;分离培养犬骨髓基质干细胞,TGF-β1成软骨诱导,PKH26标记,接种到支架上体外继续诱导培养,荧光显微镜及扫描电镜观察培养3 d后细胞在支架内的黏附、分布情况.结果 制备的CEDPS支架无细胞碎片残留,软骨细胞外基质特异性染色阳性,具有相互贯通的三维孔隙结构;支架生化成分定量检测:总胶原含量为(708.2±44.7)μg/mg,GAG含量为(254.7±25.9)μg/mg,DNA含量为(0.021±0.007)μg/mg;支架纵向压缩弹性模量E=(1.226 ±0.288)MPa,覆水后压缩弹性模量E=(0.052±0.007)MPa.荧光显微镜、电镜检查结果表明细胞广泛均匀的分布在支架内部,呈圆形或椭圆形,在支架上增殖显著,细胞基质分泌明显.结论 CEDPS支架在生化组成和结构上与软骨细胞外基质成分类似,去细胞彻底,具有良好生物力学特性,是一种较为理想的软骨组织工程支架载体;成软骨诱导的BMSCs与CEDPS支架在体外可初步构建类软骨样组织.

Abstract：

Objective To develop a novel cartilage ECM-derived porous scaffold(cEDPs)and investigate the attachment,proliferation and distribution of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) cultured in vitro within the scaffolds.Methods Cartilage microfilaments were prepared after pulverization and gradient centrifugation and prepared into suspension after acellularization treatment.The scaffolds were examined by histological staining,scanning electron microscope(SEM),biochemical and biomechanical analysis.After labeling with PKH26,the canine BMSCs were seeded onto the scaffolds.The attachment,proliferation and differentiafion of cells were observed by inveaed fluorescent microscope and SEM.Results On histology,most extracellular matrices were retained in the scaffold after the removal of cell fragments.Safranin O staining and immunfluorescence examination with collagen Ⅱ antibodies provided positive results.Biochemical analysis showed that the collagen content was(708.2 4±44.7)μg/mg,glycosaminoglycan(254.7 ±25.9)μg/mg and DNA(0.021±0.007)μg/mg.Mechanical testing showed the compression moduli(E)were(1.226±0.288)and(0.052±0.007)MPa ander dry and wet conditions respectively.Inverted fluorescent microscope and SEM showed moderate cell adhesion.chondrocyte-like morphology and matrix synthesis around cells. Conclusion The CEDPS retains most extracellular matrices after a thorough decellularization so as to possess an excellent microstructure with ideal biomechanical characteristics and a good biocompatibility. Thus it is a suitable candidate as an alternative cell-carrier for cartilage tissue engineering. Chondrogenic BMSCs and CEDPS may be used to construct cartilage-like tissue in vitro.     

可注射性同种异体工程化软骨的构建

目的　研究在有免疫力的动物体内形成同种异体工程化软骨的可行性 ;并验证本实验使用的生物材料聚氧化乙烯丙烯凝胶 (Copolymer gel of ethylene and propylene oxide)在组织工程研究中应用的可行性 .方法　无菌条件下取新生兔关节软骨 ,经 型胶原酶消化 ,将软骨细胞和生物材料复合成细胞浓度为 5× 10 7m l- 1的复合物并移植于兔皮下 ,同时设立单独注射细胞和材料两个对照组 .分别于 4,6 ,8,12 wk取材行大体观察 ,石蜡切片 HE染色 ,Safranin O染色 ,Masson's三色染色 ,了解软骨形成情况 .结果　 2 wk后即可于皮下触及新生结节 ,4wk后取材即有基质分泌及胶原形成 .于 6 wk左右软骨接近成熟 ,生物材料基本吸收 .8,12 wk软骨基本接近正常软骨 .实验中未见明显的免疫排斥反应 .而对照组未见软骨形成 .结论　该实验使用的生物材料具有良好的生物相容性 ,可降解性 ,无细胞毒 ,是较理想的组织工程生物材料 ;应用该实验的方法可在有免疫力的动物体内形成同种异体工程化软骨 ,这为临床某些美容和重建手术提供了一种微创而可塑型的可能的手段 .     

软骨组织工程支架材料的研究进展

软骨组织工程支架材料要求具有特定的生化、物理性质,如极强的生物相容性、合适的生物降解性、可控的孔径大小、足够的孔隙率等。随着软骨组织工程的发展,如何选取理想的支架材料已成为这一课题的关键。文中就近年来软骨组织工程的支架材料研究进展进行综述。     

两种组织工程支架性能的实验研究

目的对两种组织工程支架的性能进行研究,为寻求更符合组织工程的支架提供实验依据.方法采用二次冻干技术制备CS-SF-TCP及CS支架,采用液体替代法等方法对两种支架的一般性能进行测定,将制备成一定体积的两种支架植入Wistar大鼠的背部,于2、4、6、周取出植入物行组织学染色观察.结果制备的两种支架成白色海绵状物质,孔隙率为70%-80%,孔径值为100-150μm.埋植支架周围皮下组织无充血、化脓等现象,无组织坏死发生,植入部位早期有轻度的炎症反应,后较快消退.植入物表变均被致密的薄层纤维膜包绕.组织染色结果可见支架的表面有细胞附着,两种支架内部孔隙失去连接,有断裂吸收现象.结论单纯CS支架在体内降解过快,CS-SF-TCP支架具有良好的降解性与组织相容性,是一种很有潜力的组织工程支架材料.     

可注射型骺板软骨水凝胶的制作及特性研究

目的 构建具有良好可塑性和生物特性的组织工程化骺软骨。 方法 制备胎牛骺软骨细胞外基质（cattlearticular cartilage extracellular matrix,CACECM）,复合藻酸钙（ 加10% 葡萄糖酸钙） 制备成可注射性水凝胶材料,行DNA 及糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG） 定量检测。再与体外扩增的2 周龄新西兰白兔第二代骺软骨细胞复合培养,并植于实验兔背部脊柱两旁皮下,8 周后取材进行形态学观察及组织学检测。 结果 制备的可注射型水凝胶材料有较好的生物性能,培养出的组织工程化骺软骨组织细胞生长良好,具有分泌软骨基质功能。 结论 将异体脱细胞骺软骨细胞外基质与藻酸钙及葡萄糖酸钙结合,可以作为良好的可注射型水凝胶材料应用于组织工程化骺软骨的构建。     

体外构建可注射性组织工程软骨的初步研究

目的利用关节软骨细胞复合壳聚糖-磷酸甘油(chitosan/glycerophosphate, C/GP)凝胶,体外构建可注射性组织工程软骨,为微创方式治疗关节软骨缺损提供依据.方法以体外培养扩增的兔关节软骨细胞为种子细胞,以自制温固化可注射C/GP凝胶为支架,按5×107/ml细胞浓度复合体外培养.于倒置显微镜下观察细胞形态与分布,四甲基偶氮唑盐(MTT)法计算培养1周时种子细胞存活率,培养4周时样本进行组织学及扫描电镜观察.结果软骨细胞在7:1(体积分数)C/GP凝胶中保持球形,细胞存活率95%以上;HE染色可见软骨较为典型的陷窝样结构、软骨囊及同源细胞群等现象;甲苯胺蓝异染及免疫组化Ⅱ型胶原染色呈强阳性.结论软骨细胞在C/GP凝胶中可存活并保持分泌软骨基质的功能,形成类软骨组织.温固化可注射性C/GP凝胶能作为软骨组织工程的载体材料.     

软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外软骨形成的实验研究

目的探讨软骨细胞与骨髓基质细胞(BMSC)共培养体外构建软骨的可行性,以阐明软骨细胞能否诱导BMSC向软骨细胞分化并形成软骨组织. 方法分别培养猪的BMSC与耳软骨细胞,将2种细胞按82(BMSC软骨细胞)比例混匀,以5.0×107/ml的终浓度接种于聚羟基乙酸/聚乳酸支架(PGA/PLA,直径9 mm,高3 mm)作为共培养组,相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSC分别接种于相同支架作为阳性对照及阴性对照,1.0×107/ml(相当于共培养组中软骨细胞数)的单纯软骨细胞接种作为低浓度软骨细胞对照.每组各接种6例标本,每例接种细胞悬液200 μl.全部标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察、湿重测定、蛋白多糖含量测定、组织学及免疫组织化学等相关检测对新生软骨进行评价. 结果各组细胞均与材料支架黏附良好.共培养组及阳性对照组(软骨细胞组)体外培养8周后均形成了成熟的软骨组织,并基本保持了复合物初始的大小和形状,2组新生软骨外观及组织学特征基本相同,免疫组织化学也显示2组均表达软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原.定量测定结果表明,共培养组的平均湿重和蛋白多糖含量均达到阳性对照组的80%以上.阴性对照组(单纯BMSC组)在体外培养过程中逐渐皱缩变形,仅在组织块边缘的局部区域形成了极少量软骨样组织.低浓度软骨细胞组在体外培养过程中也出现了明显的皱缩变形,新生软骨平均湿重仅达到阳性对照组的40%左右,组织学显示只在局部形成了不连续的软骨组织. 结论软骨微环境在BMSC成软骨分化及体外软骨形成中具有重要作用,软骨细胞能有效地诱导BMSC向软骨细胞分化并促进BMSC体外软骨形成.