溶瘤病毒CNHK300-mIFN-γ表达mIFN-γ及体外胃肠道肿瘤杀伤实验

目的 研究携带鼠干扰素-γ(mIFN-γ)基因的溶瘤病毒CNHK300-mIFN-γ(简称CNHK300-Mγ)对胃肠道肿瘤细胞的体外杀伤作用和mIFN-γ的表达情况.方法 采用CNHK300-Mγ、CNHK300、ONYX-015和AdEasy-mIFN-γ(简称AdEasy-Mγ)感染胃癌细胞株SGC-7901、大肠癌细胞株HT-29和正常成纤维细胞株MRC-5,通过TCID50法、CPE和四唑盐比色试验(MTT)检测CNHK300-Mγ、CNHK300和ONYX-015在上述肿瘤细胞和正常细胞中的增殖能力和杀伤作用,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测CNHK300-Mγ和AdEasy     

基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin治疗肝癌的实验研究

目的　探讨一种新的基因 病毒治疗系统CNHK30 0 murineendostatin(简称CNHK30 0 mE)对肝癌的治疗作用。方法　利用基因重组技术构建一种用人端粒酶逆转录酶 (hTERT)启动子控制腺病毒E1A基因表达并携带内皮抑素基因的基因 病毒治疗系统 ;通过 5 0 %组织培养感染剂量 (TCID5 0 )方法和细胞活性检测法四氮唑盐比色试验 (MTT法 )观察CNHK30 0 mE在 2种肝癌细胞株 (HepGII及Hep3B)及 1株正常的成纤维细胞株 (MRC 5 )中的病毒增殖能力和对细胞的杀灭能力 ;通过肝癌SMMC772 1细胞裸鼠皮下移植瘤模型观察该病毒对肝癌生长和对肿瘤血管生成的抑制作用 ;利用Western印迹法和酶联免疫吸附实验 (ELISA)法检测内皮抑素基因在体内和体外的表达。结果分别感染肝癌细胞株和正常细胞株 96h后病毒的增殖倍数相差 32 96倍 ,其达到半数杀伤量 (ED50 )时的感染复数 (MOI)值相差 2 5倍 ,差异有显著意义 ,且两者均明显优于ONYX 0 15 ;CNHK30 0 mE能明显抑制肝癌皮下移植瘤内血管的生成 ,对肿瘤生长的抑制作用与携带同一治疗基因的非增殖型腺病毒和不携带治疗基因的增殖型腺病毒ONYX 0 15相比均增强 (P均 <0 0 1) ;其所介导的内皮抑素基因在体内和体外的表达量均与携带该基因的非增殖型腺病毒载体相比均增高 (P <0 0 5和     

基因-病毒治疗系统CNHK200-hA的构建及对结肠癌治疗作用的体内研究

目的:构建一种结合抗肿瘤新生血管生成的基因治疗与病毒治疗优势的新型肿瘤基因-病毒治疗系统CNHK200-hA,初步研究其在体内对结肠癌的治疗作用. 方法: 克隆人抗血管生成基因Angiostatin(k1-5),命名为hA. 利用病毒重组技术将hA插入肿瘤特异性增殖型腺病毒和非增殖型腺病毒的病毒基因组中,通过动物试验观察其对结肠癌的体内治疗作用. 结果: 构建了一种新型的基因-病毒治疗系统CNHK200-hA. 动物体内试验显示基因-病毒治疗系统CNHK200-hA能在结肠癌HT-29内高效表达K1-5蛋白,使肿瘤内血管明显减少,对结肠癌的疗效明显好于非增殖型腺病毒Ad-hA及肿瘤增殖型病毒ONYX-015. 结论: 插入了抗肿瘤新生血管生成基因hA的基因-病毒治疗系统CNHK200-hA在体内对结肠癌的治疗作用较非增殖病毒Ad-hA及肿瘤增殖病毒ONYX-015进一步提高.     

端粒酶逆转录酶启动子调控的肿瘤增殖腺病毒CNHK300对肝癌细胞的杀伤作用

目的观察端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控的肿瘤增殖腺病毒CNHK300对肝癌细胞的杀伤作用。方法采用Western印迹检测了腺病毒E1A在细胞中的表达;通过病毒增殖实验和细胞生长抑制实验,验证CNHK300选择性复制和杀伤能力,并与ONYX-015(E1B55000蛋白缺失的2型和5型嵌和型腺病毒)和wtAd5(野生型腺病毒)进行比较;用携带绿色荧光蛋白的CNHK300-EGFP感染BJ和Hep3B,直观的观察其增殖过程。结果CNHK300病毒48h在Hep3B和HepGⅡ中的增殖倍数分别为40625和65326倍,与wtAd5增殖能力相近,较ONYX-015强几倍至十几倍。在BJ正常成纤维细胞中CNHK300病毒增殖能力减弱,CNHK300病毒48h增殖倍数为180倍,而wtAd5增殖能力仍可高达4000倍。CNHK300在MOI 0．5集落形成单位／细胞以下就可以有效地杀伤肝癌细胞,MOI 0．002集落形成单位／细胞时就可以杀伤半数Uep3B细胞,较ONYX-015具有更强的肿瘤杀伤能力。CNHK300对正常成纤维细胞的杀伤力明显弱于wtAd5,CNHK300在MOI100集落形成单位／细胞时BJ细胞存活率近50％。结论肿瘤选择性增殖腺病毒CNHK300可选择性地在端粒酶阳性的肝癌细胞中复制,并产生溶瘤作用,在正常细胞中复制能力和杀伤能力明显减弱,且无论选择性和杀伤能力均优于ONYX-015。     

IFN-γ转基因治疗与肿瘤内注射重组IFN-γ对荷瘤小鼠疗效的比较

目的;评价IFN-γ转基因方法与肿瘤内注射重组IFN-γ对荷瘤小鼠的治疗作用。方法:用小鼠结肠癌细胞CT26接种于Balb/c小鼠皮下,建立小鼠皮下种植模型;小鼠成瘤后分成5组(每组9只),分别进行不同的干预。①组1 以阳离子脂质体为载体将真核表达质粒pcDNA3-IFN-γ导入结肠癌肿块细胞;②组2 肿瘤内注射重组IFN-γ,每日1次,连续4周;③组3 肿瘤内注射重组IFN-γ,每周3次,连续4周;④组4 为生理盐水对照组;⑤组5 为空载质粒对照组。结果:与生理盐水对照组比较,转基因治疗组和外源IEN-γ给药组抑瘤效应明显;组1、2、3荷瘤小鼠平均生存期分别为(67.3±4.7)天、(65.8±4.3)天及(57.5±4.4)天,明显长于组4(42.3±2.4)天与组5(41.0±2.1)天。结论:IFN-γ转基因治疗对荷瘤小鼠的肿瘤生长有抑制效应,转基因治疗组与重组IFN-γ每日给药组抑瘤效果相当,而优于重组IFN-γ间断给药组。     

γ-干扰素基因治疗大肠癌及其肝转移的实验研究

目的:探讨利用γ鄄干扰素(IFN鄄γ)基因治疗对大肠癌及肝转移的预防和治疗作用,并初步探讨其作用机制。方法:利用BALB/C小鼠成瘤的小鼠结肠癌CT26细胞株制备小鼠结肠癌腹腔转移瘤模型,用携带鼠IFN鄄γ基因的重组缺陷型腺病毒AdIFN鄄γ进行治疗,同时利用携带LacZ基因的腺病毒AdLacZ和PBS作空白对照,检测经基因治疗后小鼠体内IFN鄄γ基因的表达情况、脾脏的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性变化、肿瘤局部的淋巴细胞浸润情况、肝转移的发生及荷瘤小鼠的生存期。结果:经IFN鄄γ基因治疗后,与对照组相比,治疗组小鼠血清中IFN鄄γ表达量明显增加(P<0.01),脾脏的CTL活性明显增强(P<0.01),肿瘤生长受到抑制,肝转移的发生率明显下降,荷瘤小鼠的存活期明显延长。结论:利用IFN鄄γ基因治疗大肠癌具有明显的疗效,并对大肠癌肝转移具有一定的预防和治疗作用。     

逆转录病毒介导IFN-γ基因对胆管癌细胞株的影响

目的：研究人ＩＦＮ－γ基因对胆管癌细胞株免疫原性的影响。方法：构建携带人ＩＦＮ－γ ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体ｐＺＩＰ－ＩＦＮ－γ,导入人胆管癌细胞系ＱＢＣ９３９,运用Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法分析ＭＨＣ Ｉ类分子的表达,体外混合淋巴细胞、肿瘤细胞培养（ＭＬＴＲ）和淋巴细胞杀伤试验研究导入ＩＦＮ－γ基因的ＱＢＣ９３９细胞免疫原性的变化。结果：Ｇ４１８阳性ＱＢＣ９３９－ＩＦＮ－γ细胞分泌ＩＦＮ－γ活性     

胞嘧啶脱氨酶基因联合干扰素-酌基因治疗大肠癌的实验研究

目的:研究胞嘧啶脱氨酶基因(EC鄄CD)联合干扰素-酌(INF鄄酌)基因对大肠癌的治疗作用。方法:以重组腺病毒载体AdCMVCD转导EC鄄CD基因;AdCMVINF鄄γ转导鼠INF鄄γ基因。采用体外培养和小鼠移植瘤实验,研究EC鄄CD基因联合INF鄄γ基因对CT26大肠癌细胞的杀伤作用。结果:AdCMVIFN鄄γ感染对CT26细胞生长有明显的抑制作用。AdCMVCD/5鄄FC联合AdCMVINF鄄γ可以增强对CT26细胞的杀伤作用,IC50明显变小(P<0.01),肿瘤生长明显抑制(P<0.01)。组织学检查显示,EC鄄CD基因与INF鄄γ基因联合治疗后肿瘤内有大量淋巴细胞浸润。结论:EC鄄CD基因联合INF鄄γ基因可以明显增强抗肿瘤效应,局部淋巴细胞浸润增加可能起到一定作用。     

MDA-7基因的腺病毒载体构建及对肿瘤细胞凋亡的影响

目的:构建一种端粒酶启动子调控目的基因MDA-7/hIL24表达的复制缺陷型腺病毒,并初步探索其抗肿瘤活性。方法:通过基因操作技术将启动子(hTERTp) 目的基因(MDA-7)插入到5型腺病毒E1A区域,构建复制缺陷型腺病毒AdTP-mda7;同时构建对照病毒AdTP-EGFP。TCID50法测定病毒滴度。应用蛋白质印迹法检测MDA-7在肿瘤细胞株中的表达状态;通过结晶紫染色实验检测两种病毒对肿瘤细胞的杀伤差异。结果:成功构建携带目的基因的腺病毒载体,PCR鉴定正确;蛋白质印迹结果表明MDA-7选择性地在多种肿瘤细胞株中表达,诱导肿瘤细胞凋亡,如A549,SGC-7901等,在以相同MOI值感染原代成纤维细胞时,原代细胞中没有检测到MDA-7表达;结晶紫染色试验结果表明AdTP-mda7对肿瘤细胞株的杀伤能力明显高于对照病毒AdTP-EGFP。结论:成功构建复制缺陷型腺病毒AdTP-mda7,并证实MDA-7蛋白在肿瘤细胞中过表达诱导多种肿瘤细胞株发生凋亡。     

IFN-γ转基因治疗结肠癌小鼠肝转移的抑制效应

目的:评价IFN-γ转基因方法与肿瘤内注射重组IFN-γ对荷瘤小鼠肝转移的抑制作用。方法:手术显露脾脏后,经脾注入1×107/ml浓度的小鼠结肠癌细胞株CT26单细胞悬液0.1ml,建立小鼠结肠癌肝转移模型;小鼠分成4组(每组12只),术后第2日起分别进行不同的干预。结果:与生理盐水和空载质粒对照组比较,转基因治疗组和外源IFN-γ给药组对抑制肝转移结节的效应明显(P<0.05);转基因治疗组和外源IFN-γ给药组荷瘤小鼠平均生存期分别为(39.5±5.6)天和(40.8±4.7)天,明显长于生理盐水组(29.0±3.5)天和空载质粒组(31.1±4.7)天。结论:IFN-γ转基因治疗对荷瘤小鼠的肝转移有抑制效应,转基因治疗组能够与重组IFN-γ每日给药组取得相似的抑瘤效果。     

人γ-干扰素基因导入人大肠癌细胞中的方法及鉴定

目的：为将人γ-干扰素（huIFN-γ）huIFN-γ基因尽快用于临床基因治疗，寻求基因导入的有效方法。方法：利用导离子脂质体Lipofectamine将huIFN-γ基因导入人大肠癌细胞株，利用PCR、RT－PCR以该基因的整合和表达进行鉴定，并对细胞培养上清中γ-干扰素的活性进行了检测。结果：该基因已经有效地进入细胞内并实现了表达。结论：利用脂质体可以有效地将huIFN-γ基因导入肿瘤细胞内，基因表达的持续时间可以满足肿瘤基因治疗的需要，不同细胞株基上清中huIFN-γ的分泌量不同。     

腺病毒介导基因导入心包的实验研究

本实验以腺病毒为载体,以ＬａｃＺ基因为标识基因,经心包导基因入心肌,获得了较好效果。一、材料与方法１．重组腺病毒的制作：重组腺病毒的制作方法详见文献［１３］。将细菌ＬａｃＺ基因插入粘性末端质粒载体的ＳＲａ启动子与ＳＶ４０多聚腺苷酸［ｐｏｌｙ（Ａ）］...     

腺病毒介导外源基因转染大鼠胰岛移植物的实验研究

目的探讨携带外源基因的腺病毒在体外有效感染大鼠胰岛及外源基因在胰岛中的表达。方法用携带人血红素氧合酶-1基因(hHO-1)及绿色荧光蛋白基因(GFP)的腺病毒在体外以不同MOI感染大鼠胰岛,荧光显微镜观察GFP的表达及Western检测hHO-1蛋白来确定转染结果,并观察外源基因表达持续的时间。结果腺病毒载体在体外能将外源基因有效转入到大鼠胰岛细胞,转染的基因能稳定表达。结论腺病毒载体在体外可以有效感染大鼠胰岛,为基因修饰胰岛移植物以提高胰岛移植效果奠定了实验基础。     

腺病毒介导的反义血管内皮生长因子基因转染治疗胰腺癌的实验研究

目的：构建并鉴定反向插入VEGF165cDNA的重组腺病毒,探讨腺病毒介导的VEGF165反义核酸治疗胰腺癌的可行性。方法：应用基因重组技术,将513bp的人VEGF165cDNA反向克隆入腺病毒粘粒载体pAxCAwt。重组粘粒与腺病毒DNA－TPC混合后以磷酸钙共沉淀法转染293细胞制备重组腺病毒。建立胰腺癌裸鼠皮下种植瘤模型,瘤体内直接注射重组腺病毒,观察肿瘤的生长及血管生长情况。结果：成功构建了反向插入VEGF165cDNA的腺病毒粘粒载体pAxCAwt-αVEGF并制备出高滴度的重组腺病毒。实验第5周时肿瘤生长速度Ad-αVEGF治疗组比PBS和Ad-LacZ对照组均明显减慢（P＜0．01）;肿瘤微血管密度Pd-αVEGF治疗组比两个对照组均明显减少（P＜0．01）。结论：腺病毒介导的VEGF165反义核酸可以抑制胰腺癌的血管生成和肿瘤的生长,为抗血管生成的基因治疗提供了实验依据。     

构建携带人/鼠IFN-γ重组腺病毒体外转染人脐带间充质干细胞的实验研究

目的 构建人/鼠干扰素（IFN-γ）的重组腺病毒,体外转染人脐带间充质干细胞（human umbilical mesenchymal stem cells, HUMSCs）,为研究IFN-γ在预防和治疗移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)中的作用提供实验依据。方法 采用PCR法从含有人/鼠IFN-γ基因的质粒中扩增出目的基因片段IFN-γ,然后定向克隆到穿梭质粒载体pDC316中,构建pDC316-IFN-γ,经酶切、PCR及测序鉴定后,再将IFN-γ定向克隆至腺病毒骨架载体,从而构建携带IFN-γ的重组腺病毒载体,并转染人胚肾细胞系293细胞,进行重组腺病毒(Ad-IFN-γ)的包装、生产和纯化;用半数组织培养感染量（50% tissue culture infective dose, TCID50）法检测重组腺病毒滴度。将Ad-IFN-γ及空病毒（Ad-null,作为载体阴性对照）分别转染HUMSCs,在荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达,采用Western blot与ELISA法鉴定IFN-γ蛋白的表达。结果 成功构建了携带IFN-γ的重组腺病毒,鼠IFN-γ（Ad-mIFN-γ）的滴度为1.0×10¹⁰ IU/mL,人IFN-γ(Ad-hIFN-γ)的滴度为1.6×10¹⁰ IU/mL, Ad-GFP的滴度为1.0×10⁹IU/mL。Ad-IFN-γ转染HUMSCs后24 h开始观察到绿色荧光,72 h时该荧光表达更强;Western blot和ELISA法均证实HUMSCs表达IFN-γ蛋白。结论 成功构建了携带人/鼠IFN-γ基因的重组腺病毒载体,并证实其可有效转染HUMSCs。     

γ-干扰素治疗免疫性大鼠肝纤维化的实验研究

目的观察γ-干扰素对猪血清诱导的大鼠免疫性肝纤维化的抑制作用.方法用猪血清腹腔注射复制免疫损伤性肝纤维化模型,9周后给大鼠每天肌肉注射γ-干扰素10万国际标准单位,共21天,以正常和模型组作为对照,第12周处死动物,测定体重、HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C并进行肝纤维化分级.结果γ-干扰素治疗组大鼠的肝纤维化生化指标HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C放免测定值较模型组明显下降(P＜0.01)而接近正常对照组(P＞0.05),肝纤维化的分级程度较模型组减轻(P＜0.01),大鼠体重较正常组和模型组稍有下降(P＞0.05).结论γ-干扰素能有效抑制猪血清诱导的大鼠免疫性肝纤维化,其作用表现为IFN-γ不仅能够抑制 胶原纤维进一步形成,更有强劲的促进胶原降解的作用.     

腺病毒介导外源基因转染大鼠胰岛移植物的实验研究术

目的 探讨携带外源基因的腺病毒在体外有效感染大鼠胰岛及外源基因在胰岛中的表达.方法 用携带人血红素氧合酶-1基因(hHO-1)及绿色荧光蛋白基因(GFP)的腺病毒在体外以不同MOI感染大鼠胰岛,荧光显微镜观察GFP的表达及Western检测hHO-1蛋白来确定转染结果,并观察外源基因表达持续的时间.结果 腺病毒载体在体外能将外源基因有效转入到大鼠胰岛细胞,转染的基因能稳定表达.结论 腺病毒载体在体外可以有效感染大鼠胰岛,为基因修饰胰岛移植物以提高胰岛移植效果奠定了实验基础.     

腺病毒介导胸苷激酶基因联合α-IFN治疗肾癌的实验研究

目的:探讨腺病毒介导的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(TK)基因联合α-IFN对肾癌生长的抑制作用.方法:含TK基因的重组腺病毒感染人肾癌细胞株786-0,加用无环鸟苷(GCV) 或联用α-IFN,用噻唑蓝(MTT)方法观察杀伤效应.建立786-0裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射腺病毒及腹腔注射GCV (50 mg/kg),联合α-IFN时行瘤内注射,用药后观察肿瘤生长情况.结果:在对感染腺病毒的786-0细胞的体外杀伤实验中,TK GCV组的细胞存活率为(68.57±1.41)%,α-IFN组的细胞存活率为(68.65±1.45)%,TK GCV α-IFN组细胞存活率为(35.07±1.43)%( P=0.000),两者之间有协同效应.在786-0裸鼠移植瘤模型中,TK GCV联合α-IFN能够显著抑制肿瘤的生长.结论:腺病毒为载体的自杀基因TK加前体药GCV联合α-IFN应用对人肾癌细胞的体内、外治疗效果明显.     

干扰素γ对实验大鼠肺纤维化的治疗作用及机制的初步研究

目的观察干扰素γ(IFN-γ)对实验大鼠肺纤维化的治疗作用,初步探讨其抗纤维化的作用机制.方法大鼠分为正常对照组、博莱霉素(BLM)组、IFN-γ治疗组.气管内注入博莱霉素造模后,于当天开始每日给药,分别于第1、3、7、14、28天处死,测量PO2,取肺组织和血清,行电镜观察及HE染色,免疫组化测定肺组织转化生长因子β1(TGF-β1)、纤维连接蛋白(FN)含量,ELISA测定血清IL-4含量及Western Blotting测定表面活性蛋白A(SP-A)含量.结果 IFN-γ组与BLM组比较,前者肺纤维化程度明显减轻,PO2显著升高(P<0.01),TGF-β1、FN表达减少,血清IL-4、SP-A含量显著减低(P<0.01).结论 IFN-γ对博莱霉素所引起的肺纤维化具有明显的治疗作用,可能通过降低TGF-β1、FN等前纤维化因子、调节失衡的T细胞亚群及减轻肺组织损伤发挥作用.