大肠杆菌表达耐热DNA聚合酶的纯化和鉴定

探讨工程菌表达的耐热ＤＮＡ聚合酶的纯化方法。（２）方法收集ＩＰＴＧ诱导带有耐热ＤＮＡ聚合酶（ＴＤ聚合酶）基因表达质粒的工程菌株ＤＮ－ＴＤ４，用溶菌酶裂解，６０℃处理后，上清液用硫酸铵沉淀，根据溶解度差异进行粗分级，然后进行离子交欣慰以析细分级，并经聚合酶链式反应鉴定其活性。     

大肠杆菌表达rhIL—8的纯化和生物学活性鉴定

应用钙盐沉淀法将ｈＩＬ－８重组质粒ｐＨＮＰ１０１转化感觉态大肠杆菌ＨＢ１０１，转化菌经扩增培养，其包涵体及胞浆内均发现有重组蛋白的表达（约１０：１），表达蛋白经初步分离，肝素柱，离子交换柱和凝胶柱进一步纯化，获得了高纯度的ｒｈＩＬ－８（〉９５％），纯化的ｒｈＩＬ－８在新西兰兔体内白细胞动员试验中显示了较高的生物学活性。     

K562细胞DNA聚合酶α—DNA引物酶复合物的纯化

用磷酸纤维素、DEAE纤维素、单链DNA纤维素和AMP-Sepharcse的顺序柱层析法从人慢性骨髓细胞性白血病K562细胞中纯化了DNA聚酶α与DNA引物酶的复合物。纯化过程经多次重复,结果稳定。DNA聚合酶纯化了117倍,DNA引物酶纯化了4583倍。共纯度足以满足研究化疗药物对这两种酶的抑制作用的需要。     

大肠杆菌表达rhIL—8的纯化和生物学活性鉴定

高志昕应用钙盐沉淀法将ｈＩＬ一８重组质粒ＰＨＮＰ１０１转化感受态大肠杆菌ＨＢ１０１，转化菌经扩增培养，其包涵体及胞浆内均发现有重组蛋日的表达（约１０：１）。表达蛋白经初步分离，肝素柱、离子交换柱和凝胶柱进一步纯化，获得了高纯度的ｒｈＩＬ—８（＞９５％）。纯化的中ＩＬ—８在新西兰免体内白细胞动员试验中显示了较高的生物学活性硕士研究生＊导师脉采血，计数其外周血白细胞总数。对照组静脉注射等体积灭菌生理盐木，并于相同的时间点干血检查。２结果２．１重组质拉ｐＨＮＰ１０１转化ＨＢ１０１细菌：转化菌可在含１００ｍｇ／Ｌ氨苄青霉素的琼脂平板上生长并形成定落．空日质粒转化细菌则不能生长。２．２纯化ｒｈＩＬ——８的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ：成熟ｈＩＬ——８是一低分子蛋曰，分子量约为１０ｋｕ．初步分离的ｒｈＩＬ——８经纯化后其纯度逐步提高（＞９５％），于电泳图谱上１０ｋｕ处显示单一条带（附图）。２．３纯化ｒｈＩＬ——８的ＥＬＩＳＡ检测；ｈＩＬ——８ＥＬＩＳＡ检测结果显示上述纯化后的蛋白为特异性ｒｈＩＬ——８，其含量约为２５ｍｇ／Ｌ。２．４ｒｈＩＬ——８快速募集白细胞进人外周血循环：在静注，ｒｈＩＬ——８（１０μｇ／ｋｇ）５ｍｉｎ后，兔外     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的纯化及生物学活性鉴定

目的：纯化rLTB并对其生物学功能进行初步研究。方法：重组基因工程菌发酵后，以包涵体形式表达的rLTB经过洗涤、变性溶解后，分别采用Q　Sepharose^TM High Performance阴离子交换层析和Phenyl FF(high sub）疏水层析对其进行纯化并透析复性，然后采用SDS－PAGE和HPLC检测纯度，并选用ELISA、动物实验和Western-blotting实验对纯化蛋白的生物学活性进行鉴定。结果：得到纯度达97．85％的rLTB,复性的rLTB经检测具有良好的生物学活性。结论：得到纯度较高、生物学活性较好的rLTB，可用于进一步的研究。     

人重组白细胞介素—10在大肠杆菌中的表达纯化与鉴定

目的：为人白细胞介素－１０（ｒＩＬ－１０）的理论研究得档应用研究提供材料。方法：利用基础工程技术，将ｈＩＬ－１０ｃＤＮＡ克隆在大肠杆菌表达载体中，在大肠杆菌中高效表达含凝血酶识别序列的ｈＩＬ－１０的融合蛋白。表达蛋白经凝血酶消化后，可去除ＭＳ２细菌蛋白。结果：获得高纯度的非融合型ｒｈＩＬ－１０。结论：活性分析表明ｒｈＩＬ－１０具有抑制ＬＰＳ刺激的外周血单个核细胞产生ＩＬ－６的能力。     

基因工程耐热碱性磷酸酯酶的表达与分离纯化

目的 获得可用于控针的非放射性标记的耐热碱性磷酸酯酶。方法 把耐热碱性磷酸酯酶的基因克隆入质粒ｐＪＬＡ５０３上，在Ｅ．ｃｏｌｉ Ｍｐｈ４４中表达。表达的酶用聚乙烯亚胺沉淀核酸，热变性，硫酸铵沉淀，层析等方法纯化。结果 经表达纯化后每克细菌可获得１．５ｍｇ的酶，酶的纯度为９０％，比活为７８．４Ｕ／ｍｇ。结论 耐热碱性磷酸酯酶可在Ｅ．ｃｏｌｉ Ｍｐｈ４４中表达，表达的酶可用热变性和其它蛋白质纯化方法来     

人NKp46基因克隆及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的：对人NKp46进行基因克隆并探讨其在大肠杆菌中重组表达和纯化。方法：用RT PCR法自人外周血单个核细胞总RNA扩增hNKp46片段（约900?bp）,克隆至质粒载体pMD18 T,并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制酶EcoRⅠ和NcoⅠ消化pMD18 T hNKp46重组质粒,分离hNKp46片段,并插入原核表达载体pET30a(+)的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载pET30a(+) hNKp46。转化菌株BL21(DE3)经IPTG诱导,用SDS PAGE和Western Blotting鉴定表达的重组蛋白。采用His·Bind Purification Kit对重组蛋白进行纯化。结果：RT PCR扩增的DNA片段与hNKp46 cDNA大小一致。重组质粒pMD18 T hNKp46的DNA序列分析显示,克隆的DNA序列与文献报道的hNKp46的cDNA序列一致。SDS PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为38.5?kD,其表达量达菌体总蛋白的40％左右。Western Blotting分析显示,重组蛋白能特异地与抗His·Tag抗体结合。纯化得到纯度为95.5％的重组蛋白,纯化回收率达40％。结论：成功构建了人NKp46表达载体,并获得了稳定表达的工程菌株,纯化了重组蛋白。     

PTI-1表达载体构建及在大肠杆菌中的高效表达和纯化

目的：构建表达人前列腺癌诱导基因1（PTI－1）蛋白的重组质粒，在大肠杆菌中诱导高效表达并纯化。方法：应用亚克隆PTI－1基因的pUC19/PTI-1质粒，重新构建表达载体PTI－1／pGEX4T-1，酶谱分析鉴定出正确的重组质粒，诱导表达，进行SDS－PAGE分析，应用GSH树脂纯化表达产物。结果：筛选出5个与pGEX4T-1正向重组质粒，其中一株表达一个Mr为69000的新蛋白，并以包涵体的形式存在，蛋白在宿主菌中高效表达，表达量为43．2％，纯化蛋白得到纯度为79．72％的GST／PTI－1融合表达高效表达及纯化的成功使简便获得前列腺癌诱导蛋白成为可能。     

大肠杆菌多核苷酸磷酸化酶的快速高效纯化

利用快速蛋白质液相层析仪从大肠杆菌纯化到2500倍的多核苷酸磷酸化酶,回收率45.5％,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示为单一组分,经测定未检出RNA酶、磷酸单酯酶和5’-核苷酸酶活性。     

人重组白细胞介素-10在大肠杆菌中的表达纯化与鉴定

为人白细胞介素-10（hIL-10）的理论研究和临床应用研究提供材料。方法：利用基因工程技术，将hIL-10cDNA克隆在大肠杆菌表达载体中，在大肠杆菌中高效表达含凝血酶识别序列的hIL-10的融合蛋白。表达蛋白经凝酶消化后，可去除MS2细菌蛋白。结果：获得高纯度的非融合型rhIL-10。结论：活性分析表明rhIL-10具有抑制LPS刺激的外周血单个核细胞产生IL-6的能力。     

小鼠金属硫蛋白-I在大肠杆菌中的 表达与分离纯化

在大肠杆菌中表达小鼠金属硫蛋白-I,并研究其分子结构和生物学功能。方法将小鼠金属硫蛋白-I基因克隆入融合表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,得到含重组表达质粒pGMA的工程菌。结果经IPTG诱导,表达出分子量约为33KD的融合蛋白。然后经Glutathione-Sepharose4B亲和纯化后,用凝血酶切除GST部分。经SephacrylS-100过滤纯化,得到结合有Cd2+的小鼠金属硫蛋白-I。产率约为3mg/L培养液。结论成功制备了表达MT的工程菌。     

人雌激素受体BCD区段在大肠杆菌的高效表达及其抗体于乳腺癌石蜡切片免疫组化应用

目的：获取人雌激素受体（ＥＲ）及其抗体。方法：扩增编码ＥＲＢＣＤ区的基因，在大肠杆菌中表达ＭＳ２－ＥＲ融合蛋白。免疫动物，得抗ＥＲ血清，以此检测５０余例乳腺良、恶性肿瘤的ＥＲ表达，并与经典检测ＥＲ的ＤＣＣ法及进口抗ＥＲ单克隆抗体Ｃ－３１４结果相比较。结果：ＭＳ２－ＥＲ融合蛋白有天然ＥＲ。结构，其抗血清特异针对野生型ＥＲ，其ＩＨＣ结果与ＤＣＣ及Ｃ－３１４抗ＥＲ单克隆抗体有高符合率，既具备ＩＨＣ方法的特点，又免去需微波处理这一步骤。结论：自制抗ＥＲ血清可用来检测ＥＲ表达，为进一步获取其单克隆抗体及推广奠定基础。     

大肠杆菌表达的rhIL－8的分离纯化

目的：探索人重组白细胞介素－８（ｒｈＩＬ－８）的分离纯化的路线。方法：用Ｓｅｐｈａｃｒｙ１－Ｓ－２００凝胶过滤和Ｑｓｅｐｈａｒｏｓｅｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｑｓｅｐｈａｒｏｓｅｂｉｇｈｅａｄｘ两步连续阴离子交换层析纯化。结果：两种方法纯化的ｒｈＩＬ－８纯度分别达９５．６％、９８．６％。氨基酸组份分析推算值基本与理论值相符。纯化的ｒｈＩＬ－８对小鼠和人中性粒细胞具有明显的体内体外趋化作用。结论：本法为ｒｈｌＬ－８提供了快速高效的纯化路线。     

尿路感染大肠杆菌耐药性与1类整合子的关系分析

目的 分析尿路感染大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC)1类整合子对其耐药性的影响.方法 留取临床泌尿系感染患者中段尿分离株,常规方法鉴定为大肠杆菌感染者;K-B法做耐药菌株的药敏实验;PCR扩增检测intI1基因.结果 58株菌中有26株(44.8%)1类整合子检测阳性,有500、750、1 000、1 800、20 000 bp等5种不同大小的整合子结构,且绝大多数(92.3%)的整合子在500bp以上,其中10株含有2种整合子结构;整合子阳性菌株对20种抗菌药物的耐药率多数都在50%以上,尤其是对头孢噻肟、头孢哌酮、头孢曲松、氟喹诺酮类和庆大霉素的耐药率显著高于整合子阴性的菌株,经χ2检验差异有统计学意义.结论 1类整合子广泛分布于UPEC中,整合子阳性菌株对部分第三代头孢菌素、氨基糖甙类、氟喹诺酮类等抗生素的耐药率明显高于阴性菌株,说明整合子对UPEC耐药性的播散有一定的作用.     

ICU产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药性分析

目的探讨医院重症监护病房产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐药性。方法采用BD Phoenix100全自动微生物分析仪对莒县中医医院重症监护病房产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌进行细菌鉴定和药物敏感试验。结果产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌均呈现多重耐药,大肠埃希菌对亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦和阿米卡星的耐药率分别为1.8%、5.5%和20.0%,其余14种抗生素的耐药率在54.6%~100.0%;肺炎克雷伯菌对亚胺培南无耐药现象,其余16种抗生素的耐药率在56.0%~100.0%。结论重症监护病房分离的产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌多重耐药严重;同样是产ESBLs菌株,大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对相同抗生素的敏感率明显不同。     

双黄连冻干粉对大肠埃希菌直接抑制作用的实验研究

目的：探讨双黄连冻干粉对大肠埃希菌的直接抑制作用。方法：采用微量肉汤稀释法,依据不同浊度液体内细菌含量不同的原理,绘制时间-浊度曲线（生长曲线）,并对结果进行分析。结果：不同浓度双黄连作用下,细菌的生长曲线不同。双黄连浓度为12.5mg/mL时细菌生长最为特殊,浓度为50mg/mL时细菌不生长。结论：生长曲线可以反映药物的直接抑菌作用;一定浓度范围内的双黄连冻干粉对大肠埃希菌标准株ATCC25922的生长有促进作用。     

ICU产ESBLs大肠埃希菌耐药性及基因型分析

目的了解医院重症监护病房(ICU)产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌的耐药性及β-内酰胺酶基因型分布特点。方法采用BD Phoenix 100全自动微生物分析仪进行细菌鉴定和药物敏感试验,聚合酶链反应检测β-内酰胺类耐药相关基因,包括TEM、CTX-M-1群、DHA、SHV、oprD2、GES、OXA和VIM。结果 51株产ESBLs大肠埃希菌呈现多重耐药,对亚胺培南、哌拉西林-他唑巴坦和阿米卡星的耐药率分别为2.0%、8.0%和11.8%,其余14种抗生素的耐药率为54.9%~100.0%。51株产ESBLs大肠埃希菌共检出TEM、CTX-M-1群、SHV和oprD2等4种β-内酰胺酶基因,其阳性率分别为76.50%、37.3%、5.9%和31.4%。结论 ICU分离的产ESBLs大肠埃希菌多重耐药严重,携带的β-内酰胺酶基因以TEM为主。     

赖氨酸脱羧酶单管试验在诊断EIEC中的效用

从Falkow法(常规法)抽去基础培养基蛋白胨,代以氯化钠称单管法。56株EIEC血清型大肠菌用单管法和常规法对比赖氨酸脱羧酶试验(赖酶试验)。并以140-Md质粒(140-Md)检测和豚鼠角膜结膜炎试验(Sereny试验)分析三者关系。结果发现:凡140-Md(+)菌株,单管法赖酶试验均(-)。25株140-Md(-)株,两法均在24小时内脱羧。但常规法中8株140-Md(+)株3～4天内脱羧,其中5株Sereny试验(+)。作者根据EIEC血清型大肠菌140-Md(+)与单管法赖酶试验(-)一致性的结果,对少数140-Md(+)而Sereny试验(-)株应纳入EIEC范畴进行了诊断依据的讨论。