HPV58型衣壳蛋白L1和L2基因的克隆表达及病毒样颗粒的装配

目的大量表达和纯化HPV58衣壳蛋白,形成病毒相似颗粒。方法制备携带HPV58L1和L2基因的重组杆状病毒,转染昆虫细胞,在真核细胞中大量表达HPV58L1和L2蛋白并进行纯化。电镜观察病毒相似颗粒的形成情况。免疫小鼠制备特异性抗血清。结果 HPV58L1和L2蛋白在真核细胞中被高效表达,电镜下见表达纯化的病毒衣壳蛋白L1与L2共同组装形成病毒相似颗粒(VLPs),用其免疫小鼠能产生针对HPV58L1蛋白的高滴度的特异性抗体。结论在真核细胞中大量表达HPV58L1和L2蛋白,纯化后能形成病毒相似颗粒,并具备很强的免疫原性,有望用其制作宫颈癌预防性疫苗。     

人戊型肝炎病毒IgG、IgM及IgA抗体ELISA检测方法的建立与初步应用

目的 建立用于检测戊型肝炎病毒(HEV)IgG、IgM及IgA抗体的间接ELISA方法.方法 用重组HEV杆状病毒感染Tn-5细胞表达HEV病毒样颗粒(VLP),用作包被抗原,建立间接ELISA检测方法,进行方法学评估,分析云南省西双版纳地区献血者HEV抗体流行率.结果 收集纯化的VLP能具有HEV抗原性.西双版纳州献...     

HPV6晚期表达基因L1的克隆并在杆状病毒表达系统的表达及其抗血清制备

目的 获得具有正确序列的人乳头瘤病毒HPV6型晚期表达基因L1，并获得其高活性表达L1基因特异性抗血清，为进一步研究及临床检验应用奠定物质基础。方法 用PCR法从感染人乳头瘤病毒患者尖锐湿疣组织中获得HPV6晚期表达基因L1，测序验证后，将正确的HPV6晚期表达基因L1序列，插入Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，转洒昆虫细胞Sf9，表达外壳蛋白L1，并以之作为抗原免疫兔，获得特异性抗血清。结果 获得了正确序列HPV6晚期表达基因L1，在Bac-to-Bac杆状病毒系统活性表达并获得其特异性抗血清。结论 获得HPV6晚期表达基因L1，及有抗原活性的表达和相应抗血清。     

宫颈病变患者外周血免疫球蛋白及阴道灌洗液中免疫细胞因子水平变化及临床意义

目的研究宫颈病变患者外周血免疫球蛋白及阴道灌洗液中免疫细胞因子水平变化及临床意义。方法回顾性分析2017年03月-2019年03月本院收治的210例宫颈病变患者的临床资料,作为观察组,根据宫颈病变类型分为慢性宫颈炎组(n=60)、宫颈上皮内瘤变组(n=72)和宫颈癌组(n=78),并根据人乳头瘤病毒(HPV)感染情况分为HPV高危组(n=120)和HPV低危组(n=90),同时选取同期于本院进行体检的60例健康女性作为对照组,检测免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)水平及阴道灌洗液中白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)水平,并分析IgM、IgG、IgA和IL-2、IL-4、IFN-γ的相关性。结果宫颈癌组外周血IgM、IgG、IgA水平低于对照组,慢性宫颈炎组和宫颈上皮内瘤变组外周血IgM、IgG、IgA水平高于对照组(P0.05);三组阴道灌洗液中IL-2、IFN-γ水平低于对照组,IL-4高于对照组(P0.05)。宫颈癌组外周血IgM、IgG、IgA水平和阴道灌洗液中IL-2、IFN-γ水平低于慢性宫颈炎组和宫颈上皮内瘤变组,IL-4高于慢性宫颈炎组和宫颈上皮内瘤变组(P0.05);宫颈上皮内瘤变组外周血IgM、IgG、IgA水平和阴道灌洗液中IL-2、IFN-γ水平低于慢性宫颈炎组,IL-4高于慢性宫颈炎组(P0.05);HPV高危组外周血IgM、IgG、IgA水平和阴道灌洗液中IL-2、IFN-γ水平低于HPV低危组,IL-4高于HPV低危组(P0.05);Spearman相关分析显示,IgM、IgG、IgA水平与IL-2、IFN-γ水平呈正相关性,与IL-4呈负相关(P0.05)。结论宫颈病变患者外周血IgM、IgG、IgA水平和阴道灌洗液中IL-2、IL-4、IFN-γ水平表达异常,并与宫颈[]病变严重性和HPV感染危险程度密切相关。     

HPV16E7基因定向突变及表达产物免疫原性研究

目的对人乳头瘤病毒(HPV)16E7基因中与宿主Rb蛋白结合区域进行突变获得HPV16E7突变体(HPV16mE7)序列,原核表达获得HPV16mE7蛋白。方法采用分子克隆技术扩增野生型HPV 16E7基因,设计特异性引物对目的基因进行定点突变并构建表达质粒,转化进入原核表达体系并通过IPTG诱导表达,表达产物大小及纯度经十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,免疫原性经蛋白免疫印迹法(Western blot)鉴定。结果准确按照设计突变目的基因特定位点,SDS-PAGE显示获得高纯度目的蛋白,Western blot结果显示目的蛋白具有良好的免疫原性。结论成功对HPV16E7进行定点突变并获得纯度较高免疫原性良好的突变表达蛋白。     

HPV-16 E6E7抗原表位嵌合体DNA疫苗黏膜免疫抑制宫颈癌的效果研究

目的 评价泛素及热休克蛋白70(HSP 70)C融合人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7表位嵌合体DNA疫苗鼻内黏膜免疫对宫颈癌移植瘤的预防和治疗效果。方法 建立TC-1小鼠肿瘤模型,以壳聚糖为发送载体,通过滴鼻免疫给药免疫C57BL/6小鼠。MTT法和淋巴毒性T细胞(CTL)反应检测小鼠脾脏T淋巴细胞增殖、流式细胞术检测细胞因子表达水平、肿瘤生长曲线和荷瘤小鼠存活时间评价壳聚糖包裹的HPV-16 E6E7嵌合体DNA疫苗鼻内黏膜免疫后对HPV-16型相关宫颈癌移植瘤的预防和治疗效果。结果 与对照组pcD-UH相比,实验组pcD-UE和pcD-UEH均具有显著的CTL反应,延缓HPV-16型相关宫颈癌移植瘤生长,但对已生成肿瘤无影响。鼻内黏膜途径发送壳聚糖包裹HPV-16 E6E7抗原表位嵌合体DNA疫苗仅能产生较弱的细胞免疫应答。结论 HPV-16 E6E7抗原表位嵌合体DNA疫苗通过鼻腔免疫,具有一定的肿瘤治疗和显著的肿瘤预防效果,为新型HPV疫苗的研制奠定了基础。     

丙肝核心抗原-CD40L胞外段真核表达载体的构建及其免疫原性分析

目的构建丙肝核心抗原-CD40L胞外段融合蛋白真核表达载体,并探讨其免疫原性。方法应用基因重组技术在原有载体的基础上构建真核表达载体pcDNA3.1-core-CD40L并加以鉴定。该表达质粒肌肉内注射免疫小鼠,ELISA法检测小鼠外周血中抗丙肝核心抗体,流式细胞仪检测小鼠外周血T淋巴细胞亚型,real time PCR法检测外周血单个核细胞内细胞因子,CTL杀伤实验检测小鼠脾淋巴细胞的杀伤活性。结果构建了真核表达载体pcD-NA3.1-core-CD40L,该载体能诱发小鼠产生高滴度的抗丙肝核心抗原的抗体,流式和real time结果证实该质粒能诱使小鼠T淋巴细胞由T0期向Th1和Th2转换,并以Th1为主,CTL杀伤结果显示该表达质粒能诱使小鼠产生高水平的细胞杀伤能力。结论成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-core-CD40L,该质粒能够在小鼠体内正确表达,并能诱发高水平的细胞杀伤活性。     

IL-2、IFN-γ和GM-CSF基因佐剂对pcDNA3/MDC-VP1 DNA疫苗免疫作用的影响

目的:观察IL-2、IFN-γ和GM-CSF重组质粒对pcDNA3/MDC-VP1 DNA疫苗免疫的免疫增强效果。方法:将50只4～6周龄雄性BALB/c小鼠随机分成pcDNA3组、pcDNA3/MDC-VP1组、pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/hIL-2组、pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/m IFN-γ组、pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组,每组10只。均每3周接种1次,共3次。每次接种的第20d内眦静脉采血,用微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)检测血清中和抗体效价。第3次免疫后3周,每组取3只小鼠脾脏制备淋巴细胞悬液,检测淋巴细胞增殖活性与特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。结果:各组血清中和抗体滴度随免疫次数增加而提高(P0.05);第3次免疫后pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组的血清中和抗体滴度、脾脏淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性均高于其他组(P0.05)。结论:三种细胞因子基因佐剂均能增强pcDNA3/MDC-VP1的免疫效果,GM-CSF基因佐剂的免疫效果优于IL-2和IFN-γ。     

布氏菌病双价DNA疫苗免疫保护效果的研究

【目的】构建布氏杆菌pcDNA3．1（＋）-L7／L12-BCSP31双价DNA疫苗，观察其免疫保护效果。【方法】分别克隆L7／L12、BCSP31基因，构建pcDNA3．1（＋）-L7／L12-BCSP31双价DNA疫苗。转染COS-7细胞，免疫细胞化学检测目的蛋白的表达。DNA疫苗免疫Balb／c小鼠，观察体液免疫和细胞免疫效果。布氏杆菌强毒株腹腔攻毒，观察双价DNA疫苗的免疫保护效果。【结果】构建的pcDNA3．1（＋）-L7／L12-BCSP31双价DNA疫苗在COS-7细胞有目的蛋白的表达。双价DNA疫苗免疫小鼠，ELISA检测双价DNA疫苗产生了高水平的特异性IgG抗体，且抗体亚型以IgG2a为主。FCM检测双价DNA疫苗的CD4^＋／CD8^＋比值明显下降。ELISPOT检测到疫苗免疫后小鼠分泌IFN-γ的T细胞增多。攻毒实验证明双价DNA疫苗能够产生有效的保护效果；部分数据及攻毒结果表明双价DNA疫苗的效果优于单价。【结论】研制的pcDNA3．1（＋）-L7／L12-BCSP31双价DNA疫苗免疫Balb／c小鼠能产生有效的免疫保护效果，且双价DNA疫苗效果优于单价。     

bcr-abl融合基因真核表达载体诱导小鼠特异性免疫应答

目的在小鼠体内外研究bcr-abl融合基因真核表达载体诱导的特异性免疫应答,探索肿瘤免疫治疗的新途径。方法构建表达bcr-abl融合基因cDNA片段的真核细胞质粒pVbcr-abl,将 pVbcr-abl质粒用纳米颗粒聚乙烯亚胺包裹后给BALB／c小鼠肌内注射,检测小鼠血清中bcr-abl特异性抗体水平。小鼠免疫后20 d皮下接种具有相同遗传背景的SP2／0／ber-abl细胞(H-2~d),观察小鼠生存情况、移植肿瘤的生长情况和肿瘤细胞浸润情况。利用免疫组织化学方法观察肿瘤组织中T淋巴细胞浸润情况;流式细胞术分析免疫小鼠脾脏T细胞亚群的变化;LDH释放法检测脾脏细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。结果成功构建真核表达载体pVbcr-abl,bcr-abl融合基因cDNA片段在真核细胞中可得到高效表达。pVbcr-abl免疫BALB／c小鼠能激活机体免疫系统,诱导产生特异性抗体和特异性CTL活性,并形成特异性免疫保护力。免疫小鼠的移植肿瘤形成时间、表面出现破溃时间、生长速度明显降低,荷瘤生存时间明显延长。免疫小鼠移植肿瘤组织中有大量CD3~+T细胞浸润。免疫小鼠的脾细胞杀伤SP2／0／bcr-abl细胞的细胞毒活性明显升高。小鼠脾脏T细胞亚群发生改变,CIM~+／ CD8~+细胞比值升高到1．54±0．29。结论pVbcr-abl真核表达载体除能在小鼠体内诱导产生特异性抗体以外,还能诱导高水平特异性CTL活性,直接杀伤肿瘤细胞,抑制肿瘤细胞的生长速度。     

新生儿脐血T细胞亚群、免疫球蛋白与HBV宫内感染的相关性研究

目的分析T淋巴细胞亚群、免疫球蛋白IgM、IgG、IgA的表达水平与新生儿免疫状态之间的关系。方法依据新生儿脐血中HBV-DNA(Hepatitis B Virus-DNA)及乙肝五项的结果,将研究对象中感染HBV(Hepatitis B Virus)的17例作为宫内感染组,未感染的58例作为宫内未感染组,并选择同期正常孕妇分娩的新生儿43例作为对照组,并采用流式细胞术检测3组新生儿脐血中T细胞亚群及免疫球蛋白IgM、IgG、IgA的表达水平。分析3组脐血T淋巴细胞亚群及免疫球蛋白IgM、IgG、IgA的百分比,并进行统计学分析。结果 HBV宫内感染组新生儿脐血中的CD3+、CD4+阳性率低于宫内未感染组及对照组(P 0.05);CD8+阳性率显著高于HBV宫内未感染组及对照组(P 0.05);HBV宫内感染组新生儿脐血中的IgM阳性率高于宫内未感染组及对照组(P 0.05);IgA、IgG各组间差异无统计学意义(P0.05)。结论宫内感染HBV的新生儿存在T淋巴细胞亚群比例失调,使机体的免疫功能降低,不能很好的清除病原;新生儿宫内感染HBV后,IgM较前升高,提示机体受到抗原刺激后,会产生抗体来进行自我保护;IgA、IgG各组间无明显差异,则提示新生儿免疫功能低下。     

新生儿脐血T细胞亚群、免疫球蛋白与HBV宫内感染的相关性研究

目的分析T淋巴细胞亚群、免疫球蛋白IgM、IgG、IgA的表达水平与新生儿免疫状态之间的关系。方法依据新生儿脐血中HBV-DNA(Hepatitis B Virus-DNA)及乙肝五项的结果,将研究组中乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)的17例作为宫内感染组,未感染的58例作为宫内未感染组,并选择同期正常孕妇分娩的新生儿43例作为对照组,并采用流式细胞术检测三组新生儿脐血中T细胞亚群及免疫球蛋白IgM、IgG、IgA的表达水平。分析三组脐血T淋巴细胞亚群及免疫球蛋白IgM、IgG、IgA的百分比,并进行统计学分析。结果 HBV宫内感染组新生儿脐血中的CD3+、CD4+阳性率低于宫内未感染组及对照组(P <0.05);CD8+阳性率显著高于HBV宫内未感染组及对照组(P <0.05);HBV宫内感染组新生儿脐血中的IgM阳性率高于宫内未感染组及对照组(P <0.05);IgA、IgG各组间无明显差距(P>0.05)。结论宫内感染HBV的新生儿存在T淋巴细胞亚群比例失调,使机体的免疫功能降低,不能很好的清除病原;新生儿宫内感染HBV后,IgM较前升高,提示机体受到抗原刺激后,会产生抗体来进行自我保护;IgA、IgG各组间无明显差距,则提示新生儿免疫功能低下。     

人乳头瘤病毒11型E7蛋白在原核细胞的表达及其诊断尖锐湿疣的价值

目的 研究人乳头瘤病毒(HPV)11型E7蛋白在原核细胞的表达及其在尖锐湿疣(CA)血清学诊断中的应用价值.方法 用PCR从CA患者组织中扩增HPV11 E7全长基因,构建重组质粒pET32a(+)/HPV11 E7,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后表达,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法(WB)分析鉴定;经镍螯合亲和层析胶体(Ni-NTA Agarose)纯化HPV11 E7融合蛋白后作抗原,用间接ELISA法对93例CA患者、43例宫颈癌患者和58名健康对照者血清标本进行IgG抗体检测.结果 HPV11 E7融合蛋白在原核表达系统中呈较高效表达(浓度为40μg/ml).CA组、宫颈癌组和健康对照组血清IgG抗体均值分别为1.545±0.131、0.586±0.155和0.674±0.150,阳性率分别为76.3%(71/93)、11.6%(5/43)和5.2%(3/58);CA组血清IgG抗体均值及阳性率均高于宫颈癌组和对照组(均P＜0.01).结论 HPV11 E7融合蛋白具较强的抗原性,用于CA血清学诊断试剂的研制具有临床应用价值.     

福氏志贺菌ipaB基因的克隆表达及免疫原性研究

构建福氏志贺菌ipaB基因的原核表达载体,诱导表达并纯化.探讨重组蛋白IpaB经口服免疫小鼠后,机体产生的免疫应答.方法:用PCR扩增ipaB目的基因,克隆至pQE-30表达载体中,转化宿主菌DH5α,经IPTG诱导表达蛋白IpaB;Western blot分析其抗原性.纯化后灌胃免疫小鼠,ELISA法检测血清IgG、IgA、小肠黏液sIgA和粪便sIgA.结果:ipaB基因全长1 743 bp.经SDS-PAGE分析相对分子量(Mr)约为64 000.Western blot分析能与福氏志贺菌全菌抗血清反应.免疫小鼠后,血清IgA、IgG,粪sIgA,肠黏液sIgA明显高于对照组(P＜0.01).结论:成功构建了ipaB基因的原核表达载体并能高效表达,纯化后口服免疫可有效诱导黏膜免疫应答,产生高水平的sIgA,发挥局部黏膜免疫作用,为进一步研究细菌性痢疾的疫苗和发病机制奠定基础.     

IL-2基因修饰增强树突状细胞抗原提呈功能及其机制

目的　研究IL 2基因修饰增强小鼠骨髓来源的树突状细胞 (DC)对肿瘤抗原提呈的功能和对MHCⅠ类限制性抗原多肽体内诱导的细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)的激活作用及其相关的免疫机制。方法　用重组腺病毒介导IL 2基因修饰小鼠骨髓来源的DC ,ELISA法检测DC培养上清中IL 1 2和CTL上清中IFN γ的分泌水平 ,用流式细胞仪 (FACS)分析IL 2基因修饰对DC表面共刺激分子B7表达的调节和内吞卵清蛋白抗原八肽 (OVA)的作用 ,3H TdR掺入法检测DC对小鼠Lewis肺癌细胞株3LL肿瘤抗原的提呈能力 ;51 Cr释放法检测用 3LL细胞MHCⅠ类抗原多肽Mut1致敏IL 2基因修饰的DC对小鼠体内特异性CTL的诱导作用。结果　经IL 2基因修饰后 ,DC 48h能分泌高水平的IL 1 2(78.4± 6 .6)pg·(1× 1 0 6 细胞 ) - 1 ·ml- 1 ,DC表面的共刺激分子B7表达增加 ,DC内吞OVA多肽的作用也增强。经Mut1致敏后与同系 3LL细胞荷瘤的小鼠T淋巴细胞混合培养 ,3H TdR掺入量显著增高 ,用Mut1致敏IL 2基因修饰的DC免疫小鼠后 ,能在体内诱导出分泌高浓度IFN γ[(1 1 68.0± 58.4)pg/ml]的CTL活性。结论　IL 2基因修饰可活化DC抗原提呈的第二信号 ,增强DC对抗原多肽的捕获和提呈功能 ,经MHCⅠ类抗原多肽致敏后 ,在小鼠体内能更有效地诱导出CTL特异性抗肿瘤免疫应答。     

结核分枝杆菌Rv1009结构域多肽的免疫学特性研究

目的 研究结核分枝杆菌Rv1009结构域多肽的免疫学特性.方法 用原核表达的Rv1009结构域多肽免疫BALB/c小鼠3次.每次间隔2周.用ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗体滴度.分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,体外用抗原再刺激后,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖指数.ELISA方法检测淋巴细胞悬液中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-10和IL-12的产生水平.另一部分免疫的小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4周后,计数脾脏细菌负荷数.结果 Rv1009结构域多肽免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1:12 800.淋巴细胞增殖指数为2.40±0.18,明显高于生理盐水对照组的0.90±0.21.ELISA方法检测Rv1009结构域多肽免疫组IFN-γ、IL-10和IL-12水平为(1432±30)ng/L、(503±11)ng/L和(311±11)ng/L,显著高于生理盐水对照组的(256±20)ng/L、(76±6)ng/L和(56±8)ng/L(P<0.01).与生理盐水免疫组(细菌负荷6.64±0.13)相比较,Rv1009结构域多肽免疫组小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷为4.86±0.14,P<0.05),但不及BCG免疫组的3.81±0.16.结论 Rv1009结构域多肽有可能作为新型结核疫苗的候选组分.     

B7-1与CD40L在淋巴瘤免疫治疗中的协同作用

为了研究B7-1与CD40L共刺激途径在淋巴瘤的免疫治疗中的作用，探讨治疗淋巴瘤疫苗有效的作用方式，将A20淋巴瘤细胞株接种在BALB／C小鼠身上以构建荷瘤小鼠模型，将B7-1与CD40L表达载体单独或联合导入肿瘤内，以PBS和空载体作为对照，观察肿瘤生长的情况；应用肿瘤病理切片和HE染色技术观察肿瘤组织形态及淋巴细胞浸润情况，采用CCK-8试剂盒检测荷瘤小鼠脾CTL杀伤效应。结果显示，瘤内注射B7-1或CD40L表达载体可导致肿瘤生长延缓或体积缩小，两者联合注射较对照组和单独注射组的肿瘤消退效应明显增强。肿瘤形态学观察表明，治疗小鼠肿瘤局部有炎性细胞浸润并伴有大面积的坏死，肿瘤局限化；CCK8试剂盒检测显示小鼠脾CTL杀伤能力增强。结论：B7-1与CD40L疫苗对淋巴瘤具有治疗效应，两者联合治疗的效果优于单一治疗。质粒载体瘤内注射可作为一种安全有效的肿瘤疫苗作用方式。     

儿童过敏性紫癜CD40-CD40L的表达

目的　探讨儿童过敏性紫癜(HSP)CD4 0- CD4 0L的表达与免疫紊乱的关系。方法　采用流式细胞术检测30例HSP患儿外周血淋巴细胞CD4 0 - CD4 0L的表达以及免疫功能,同时以30名健康儿童作为对照组。结果　(1)HSP组CD4 0的表达与对照组比较差异无显著性(P >0 .0 5 ) ,而CD4 0L的表达较对照组增高(P <0 .0 1)。(2 )HSP患儿TH2类细胞因子中的IL 4 ,IL 5及IL 6明显增高,TH2的特异性膜蛋白分子CD30表达也显著高于正常水平,TH1类细胞因子IL- 2及IFN γ分泌减少。(3)HSP存在选择性的IgG的异常增高,血浆中仅IgA、IgE水平高于对照,IgG、IgM无差别。结论　HSP儿童存在CD4 0 CD4 0L表达异常与免疫功能紊乱,且二者有内在的联系。     

增强型Trop2-CD40L病毒样颗粒疫苗的制备、纯化及活性研究

目的 获得嵌合免疫增强佐剂CD40配体(CD40L)的Trop2-CD40L病毒样颗粒(VLPs)疫苗,为后续探究VLPs在肿瘤治疗中的免疫原性及免疫保护作用奠定基础。方法 通过重叠延伸PCR方法扩增以Trop2为靶点、嵌合免疫佐剂CD40L的Trop2-CD40L融合基因,构建杆状病毒表达载体pFastbac^TM /Trop2-CD40L,并转化大肠埃希菌E.coli DH10bac,提取杆粒并经PCR鉴定成功命名为Trop2-CD40L Bacmid,后者转染Tn5昆虫细胞获得重组病毒Trop2-CD40L rBV,与Gag rBV共感染昆虫细胞制备重组病毒样颗粒,透析浓缩后蔗糖密度梯度离心纯化,Western Blot鉴定VLPs目的蛋白表达、电镜观察所制备VLPs形态,Cytokine ELISA方法检测Trop2-CD40L VLPs体外生物学活性。结果 成功扩增了Trop2-CD40L融合基因,通过杆状病毒表达系统、借助SIV Gag衣壳蛋白装配特点成功制备了增强型Trop2-CD40L 病毒样颗粒,与Trop2 VLPs比较具有更好的生物学活性,差异具有统计学意义(t=7.266,,P<0.05)。结论 制备出具有一定生物学活性的增强型Trop2-CD40L病毒样颗粒,证实了CD40L作为免疫佐剂使用有免疫增强效应。     

负载肝癌肿瘤抗原的B淋巴细胞诱导特异性抗肿瘤免疫的实验研究

目的:探讨体外经小鼠肝癌细胞不同抗原致敏的CD40配体活化的B淋巴细胞诱导的特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)抗肿瘤免疫的能力.方法:分离、纯化T、B混合淋巴细胞,并在CD40L、rmIL-4联合作用下培养.然后分离T、B淋巴细胞以备用.将凋亡的肝癌细胞及其冻融裂解物作为实验组,1640培养基作为空白对照组分别与B淋巴细胞共同培养,检测培养后各组B细胞表面抗原呈递细胞标记(CD40、CD80、CD86)及主要组织相容性抗原的表达情况.利用混合淋巴细胞增殖实验检测T细胞增殖情况.以负载肿瘤抗原的B淋巴细胞诱导的CTL作为效应细胞,肝癌细胞Hepal-6为靶细胞,LDH释放实验检测杀伤活性.结果:负载肿瘤抗原的B淋巴细胞具有刺激T细胞增殖的能力,实验组的B淋巴细胞,其组织相容性分子及其刺激分子表达明显高于空白对照组,其对靶细胞的杀伤率与空白对照组比较经统计学分析差异有显著性.结论:负载肝癌肿瘤抗原的B淋巴细胞作为抗原呈递细胞诱导的CTL可有效产生特异性抗肝癌免疫作用.