人肝癌特异性EB病毒载体—p^EBAF介导hGM—CSF基因的转移及表达

目的：探索人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF)基因在肝癌细胞中特异性表达的新途径。方法：构建p^EBAF/hGM-CSF基因克隆,用脂质体转染法将它分别导入分泌甲胎蛋白（AFP）的肝癌细胞株HepG2和不分泌APF的细胞株SMMC7721,构建两围基因的细胞克隆HepG2/hGM-CSF,SMMC7721/hGM-CSF,用MTT比色法测定细胞上清中hGM-CSF活性。结果：HepG2/hGM-CSF细胞上清hGM-CSF活性平均为46．5ng/ml/10^6/24h,SMMC7721细胞上清中无明显hGM-CSF活性。结：载体p^EBAF介导的hGM-CSF基因能在分泌AFP的肝细胞中获得特异性表达。     

辐射诱导性自杀基因在胰腺癌细胞中的表达

目的 利用辐射敏感的早期生长反应基因1(Egr-1)启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK),观察其在胰腺癌细胞中的表达效果.方法 以细菌内同源重组法构建含绿色荧光蛋白(GFP)做标志基因的TK基因的腺病毒载体pAdEgr-1-TK,转染人胰腺癌细胞系PC-3 60Co-γ射线照射后,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量分析各不同照射剂量组TK基因的mRNA表达.Western印迹法分析60Co-γ射线照射后转染pAdEgr-1-TK细胞中TK蛋白质的表达量.结果 重组腺病毒载体pAdEgr-1-TK转染胰腺癌细胞系PC-3,不同剂量60Co-γ射线照射后,经RT-PCR半定量分析,TK mRNA表达结果分别为0 Gy(67.3±2.1)%、5 Gy为(89.3±1.0)%、7.5 Gy为(114.7±5.7)%、10 Gy为(140.5±3.1)%、15 Gy为(134.5±4.0)%、20 Gy为(117.4±3.4)%,各照射组TKmRNA表达均明显高于对照组0 Gy(均P<0.01),尤以剂量为10.0 Gy时最为显著.Western印迹分析结果分别为0 Gy为(5.4±0.7)%,5 Gy为(7.6±0.9)%,7.5 Gy为(21.5±1.5)%,10 Gy为(35.7±1.4)%,15 Gy为(32.1±1.2)%,20 Gy为(28.8±1.5)%,60Co-γ射线照射可明显提高转染pAdEgr-1-TK细胞中TK的蛋白质表达量,且蛋白质表达量与辐射剂量呈正相关性.结论 放射敏感性启动子Egr-1基因可驱动TK自杀基因在胰腺癌细胞中高效表达.     

电离辐射对人HepG2肝癌细胞caspase-3蛋白表达的影响

目的:观察电离辐射对人HepG2肝癌细胞Caspase-3蛋白表达的影响.方法:采用6MV-X射线照射人HepG2肝癌细胞,Western blotting蛋白印迹法检测细胞凋亡蛋白Caspase-3的表达.结果:6MV-X照射后48小时,2Gy、4Gy、6Gy剂量组HepG2细胞Caspase-3蛋白的表达明显高于假照射对照组(0Gy)(P＜0.05,P＜0.01).结论:电离辐射可诱导HepG2细胞Caspase-3蛋白表达增高.     

纳米载体介导热诱导启动子调控内皮抑素基因治疗肝细胞癌

目的 探讨加热诱导调控下纳米载体介导内皮抑素(Endo)基因治疗对肝癌细胞HepG2的体内外杀伤作用.方法 双酶切法构建热诱导启动子(HSPTOB)调控Endo基因的重组质粒cDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP.溶剂挥发法制备载DNA的葡聚糖接枝聚乳酸纳米粒,透射电镜观察载DNA纳米粒的形态,并介导转染HepG2细胞,转染24 h后予以37 ℃、39℃、41℃、43℃、45℃加热诱导30 min,荧光显微镜和流式细胞术检测不同温度下EGFP表达,ELISA检测转染细胞上清Endo蛋白浓度,MTT法检测热诱导后Endo对HepG2和ECV304细胞牛长的影响,动物实验观察热诱导后Endo对肝癌移植瘤的抑制作用.结果 载DNA纳米粒呈圆形或椭圆形,粒径约90～120 nm.转染效率约30.65%.低温加热可增强HepG2细胞中Endo/EGFP表达,43℃组EGFP表达强度达37℃组的3.3倍.43℃热诱导后转染细胞上清中Endo浓度为(177±28)μg/L,高于不加热组(41 ±10)μg/L.Endo抑制ECV304的生长,72 h时热诱导后细胞抑制率为96.3%,对HepG2细胞的生长却无影响.体内实验显示热诱导后Endo显著抑制肝癌移植瘤的生长,肿瘤抑制率为58.5%,高于不加热组(34.9%).结论 纳米载体可介导Endo基因转染HepG2细胞,低温加热可增强HepG2细胞内Endo基因的表达和分泌,抑制肝痛移植瘤的生长.     

腺病毒介导的LacZ基因在人肝癌细胞HepG2中的表达

目的观察腺病毒介导的LacZ基因在人肝癌细胞HepG2中的转染表达效率。方法常规重组腺病毒Ad-LacZ扩增、滴度测定及转染HepG2细胞,并检测细胞表达LacZ的情况。结果当病毒感染繁殖数(MOI)为100时,24小时后接近100%的HepG2细胞被感染并表达LacZ。感染后HepG2细胞的增殖能力无明显异常。结论腺病毒介导的LacZ基因在HepG2细胞中能获得较高的转染效率和有效表达。     

携绿色荧光蛋白和调控元件的人胰岛素原基因在HepG2细胞的表达

目的 研究含绿色荧光蛋白(GFP)和人胰岛素原基因的逆转录病毒表达载体在HepG2细胞中的表达. 方法 将IRES-EGFP片段克隆到含调控元件的人胰岛素原基因逆转录病毒表达载体(pLXSN-GI-Ins)中,构建得到表达质粒pLXSN-GI-Ins-EGFP,经脂质体介导转染HepG2细胞后,各孔分别加入含有不同浓度葡萄糖的培养液继续培养24 h,在荧光显微镜下观察GFP基因的表达,检测细胞上清液中的胰岛素值及考察细胞中胰岛素mRNA的表达量. 结果 成功构建逆转录病毒表达质粒pLXSN-GI-Ins-EGFP.转染HepG2细胞后48 h,葡萄糖浓度为4.0,12.0,24.0 mmol/L,表达GFP基因的细胞数目占总细胞数目的 比值分别为(4.00±0.15)%,(10.00±0.07)%,(25.00±0.10)%;胰岛素分泌量分别为(4.05±0.82),(8.67±0.62),(30.70±1.55)mU/L,不同葡萄糖浓度诱导的胰岛素mRNA表达量明显不同. 结论 含GFP和调控元件的人胰岛素原基因逆转录病毒表达载体能够在HepG2细胞中成功表达,并且GFP基因的表达量反映了人胰岛素的分泌量.     

靶向Notch1基因的siRNA对裸鼠人肝细胞癌移植瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨Notch1基因在人肝细胞癌HepG2细胞裸鼠移植瘤中的作用。方法于裸鼠腋下接种0.2×108/mL的HepG2细胞悬液,建立人肝细胞癌裸鼠移植瘤模型,将其分为3组:未处理组(接种PBS悬浮的未转染细胞)、空载体转染组(接种空载体转染的细胞)和Notch1转染组(接种靶向Notch1基因的siRNA转染的细胞)。连续2周观察转染荷瘤裸鼠的生长情况,采用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)研究肿瘤组织中的细胞凋亡,利用R T-PCR和蛋白质印迹技术检测肿瘤组织中Notch1、bcl-2和bax mR NA和蛋白的表达。结果 Notch1 siRNA转染组中肿瘤的生长明显受到抑制,其肿瘤的重量为(0.685±0.138)g,显著低于未处理组(2.896±0.513)g和空载体转染组(2.776±0.623)g(F=29.672,均P<0.01)。TUNEL结果表明,Notch1 siR NA转染组每500个细胞中凋亡的细胞数为(91±3),明显高于未处理组(10±3)和空载体转染组(11±2)中细胞凋亡的数目(P<0.05);此外,RT-PCR和Western印迹结果表明Notch1 siRNA转染组中裸鼠肿瘤组织Notch1和bcl-2 mRNA和蛋白表达均显著下降,而bax的表达显著上升,3组间比较差异具有统计学意义(均P<0.05)。结论降低Notch1基因的表达能抑制人肝细胞癌细胞HepG2裸鼠皮下移植瘤的生长,诱导HepG2细胞凋亡,后者可能与bax表达的上升和bcl-2表达的下调相关。     

纳米磁流体介导的重组质粒PEGFP-AFP-hTN Fα对肝癌细胞HepG2的体外杀伤作用

目的探讨纳米磁流体作为肝癌基因治疗载体的可行性及AFP增强子能否使外来基因在AFP阳性细胞内高表达。方法构建重组质粒PEGFP-AFP-hTNFα并通过纳米磁流体分别转染入AFP表达阳性的肝癌细胞HepG2及AFP表达阴性的宫颈癌细胞Hela。转染12h后，于荧光显微镜下动态观察；48h后，RT-PCR和Westemblot分析HepG2细胞中hTNFα基因的表达情况，用MTT法检测HepG2细胞的存活，用流式细胞分析HepG2细胞的凋亡。结果纳米磁流体能将重组质粒PEGFP-AFP-hTNFα转入HepG2细胞，并且其转染效率高于脂质体；RT-PCR及Westemblot证明转染的HepG2细胞有hTNFα基因的表达；MTT及流式细胞分析说明hTNFα基因发挥杀伤细胞作用。结论纳米磁流体能将重组质粒PEGFP-AFP-hTNFα转染HepG2细胞并获得表达，可作为肝癌基因治疗的基因载体。采用AFP增强子可使目的基因在HepG2细胞中定向而特异性表达。     

电离辐射诱导pEgr-hPTEN 表达增强其体外抗肿瘤作用

目的：研究辐射诱导表达载体pEgr-hPTEN体外稳定转染联合X射线照射对恶性胶质瘤细胞SHG-44增殖和诱导细胞凋亡的作用。 方法：以脂质体介导携有外源野生型PTEN基因的表达载体pEgr-hPTEN转染人胶质瘤SHG-44细胞,筛选稳定转染细胞克隆并扩增培养,以Western blotting法检测PTEN基因的辐射诱导表达情况,应用流式细胞仪及生长曲线测定稳定转染联合0~10 Gy X射线照射对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响。 结果：SHG-44-hPTEN稳定转染细胞PTEN蛋白的相对表达量可被辐射诱导增强,5 Gy以内呈剂量依赖性增加。稳定转染联合辐射可明显抑制肿瘤细胞的恶性增殖并诱导肿瘤细胞凋亡,照射后第8天稳定转染不同剂量组细胞数仅为稳定转染0 Gy假照组的30.0%~50.0%和未转染0 Gy假照组的7.7%~13.0%;稳定转染不同剂量照射组早期凋亡细胞百分数分别为稳定转染0 Gy假照组的1.5~2.3倍、未转染照射组的1.9~4.4倍及未转染0 Gy假照组的3.4~5.1倍。 结论：体外基因-放射联合作用可诱导肿瘤细胞凋亡明显增多,具有显著的肿瘤抑制作用。     

聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体制备及体外实验研究

目的 制备聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体并研究其理化性质的表征参数和体外转染效率.方法 通过化学还原法制备聚乙烯亚胺修饰的纳米金基因载体,用绿色荧光蛋白质粒(pAcGFP-N1)做报告基因,纳米基因载体可通过静电吸附的方式结合质粒DNA.用紫外分光光度计检测其吸收光谱,用透射电镜观察其形态特征,激光粒度分析仪测定其粒度分布、表面电位(Zeta电位),1％琼脂糖凝胶电泳检测该基因载体与质粒DNA的结合稳定性,CCK-8实验检测聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体及DNA-纳米金复合物对HEK293细胞的细胞毒性作用,通过荧光显微镜观察聚乙烯亚胺纳米基因载体介导pAcGFP-N1在体外培养的HEK293细胞中的表达,并分析其转染效率.结果 聚乙烯亚胺还原氯金酸可以得到带正电荷的纳米颗粒,呈单分散球形分布,其粒径为(12.3 ±3.3)nm.在pH =7.2时,Zeta电位为+(29.7±5.1)mV.1％琼脂糖凝胶电泳结果表明,当纳米金/质粒DNA≥0.5时,质粒DNA可完全结合到纳米金表面.体外转染实验表明,聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体能介导pAcGFP-N1转染HEK293细胞并在细胞中表达绿色荧光蛋白,其转染效率可达25％.结论 聚乙烯亚胺修饰纳米金是一种新型非病毒基因载体,具有转染效率高、对细胞毒性小等优势.     

重组GSTP1真核表达质粒的构建及稳定转染NCI-H520细胞系的建立

目的构建pcD N A3.1(+)/G STP1真核表达载体并将其稳定转染到肺鳞癌细胞N C I-H 520中,建立稳定转染的N C I-H 520细胞系,为后续研究奠定基础。方法以pD N R-LIB-G STP1为模板,用PC R扩增G STP1 cD N A的编码区,并将扩增的cD N A片段与载体连接后亚克隆到真核表达载体pcD N A3.1(+)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肺鳞癌细胞系N C I-H 520,经G 418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用W estern blotting检测转染前后该细胞株G STP1基因在蛋白水平的表达。结果 pcD N A3.1(+)/G STP1经酶切鉴定及D N A测序证实序列完全正确,真核表达载体构建成功;经W estern blotting检测,重组质粒转染株中G STP1基因的蛋白表达水平明显高于对照组,证实G STP1基因已稳定转染到N C I-H 520细胞中并得到表达。结论成功构建了pcD N A3.1(+)/G STP1真核表达质粒,建立了稳定表达G STP1的N C I-H 520细胞系,为进一步研究G STP1的生物学功能奠定了基础。     

人血管内皮生长因子165慢病毒载体的构建及其抗放射所致细胞凋亡的作用

 【目的】 构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPhVEGF165,并转染至HT22 细胞,并进一步观察其对放射线损伤所致的细胞凋亡的保护作用。【方法】 PCR扩增hVEGF165基因,克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体;通过酶切电泳,菌落PCR初步筛选和测序鉴定构建的pCDH-CMV-MCS-EF-GFP1-hVEGF165重组载体;采用磷酸钙共转染法转染293T细胞包装制备慢病毒液,并感染HT22细胞,采用实时RT-PCR及Western Blot检测hVEGF165基因在HT22细胞中的表达情况。进一步对单纯HT22细胞、空质粒转染组以及hVEGF165转染组HT22细胞进行0、5、10 Gy的X线照射,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】 hVEGF165基因片段重组到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体,酶切后电泳结果显示均能得到与理论大小相符的片段,测序结果与GenBank序列完全一致,转染HT22后hVEGF mRNA及蛋白表达水平明显增高。而且同各对照组相比,hVEGF165可以降低细胞放疗后的凋亡率。【结论】 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-hVEGF165 慢病毒表达载体构建成功,其转染HT22细胞后可获得高水平hVEGF165 mRNA和蛋白的表达,hVEGF165具有抗放射所致细胞凋亡的作用。     

小干扰RNA沉默组织因子基因对肝癌侵袭转移能力的影响

目的 应用RNA干扰(RNAi)技术抑制人类肝癌细胞内组织因子(TF)基因表达,从而探讨对其侵袭转移能力的影响。方法 本实验以人类肝癌细胞系HepG2细胞株为实验对象,将携带有针对TF小干扰RNA( siRNA)序列的质粒pGPU6/GFP/Neo-TF siRNA,转染HepG2细胞株,以适当浓度的G418筛选获得阳性克隆,通过RT-PCR和蛋白质印迹法比较转染TF siRNA(+)质粒、转染TF siRNA( -)质粒以及未转染任何质粒的HepG2细胞内源性TF在基因及蛋白质表达水平的差异,进而应用Transwell体外侵袭实验检测三者的侵袭转移能力,探讨TF对肿瘤细胞侵袭转移能力的影响。结果 (1) RT-PCR结果 显示,转染TF siRNA(+)质粒的HepG2细胞其内源性TF表达水平低于转染TF siRNA（-）质粒和未转染质粒的表达水平。(2)蛋白质Western印迹法结果 显示,转染TFsiRNA(+)质粒的HepG2细胞其内源性TF蛋白表达水平低于转染TF siRNA( -)质粒和未转染质粒的表达水平。(3) Transwell体外侵袭实验结果 显示,转染TF siRNA(+)质粒的HepG2穿膜细胞数[(14±10)个]少于转染TF siRNA（-）质粒的HepG2穿膜细胞数[(128±18)个],经t检验比较,两组差异有统计学意义（P＜0.05）。这提示应用RNA干扰技术抑制肿瘤细胞TF表达可以使HepG2细胞侵袭转移能力显著下降。结论 TF与肝癌细胞的侵袭转移能力密切相关,应用RNA干扰技术抑制其表达可以明显降低细胞HepG2体外侵袭转移能力。     

分割剂量射线照射富集宫颈癌肿瘤干细胞的研究

【目的】 研究分割剂量射线照射的宫颈癌Hela细胞表达肿瘤干细胞相关蛋白情况及裸鼠体内成瘤能力,探讨经此法富集宫颈癌肿瘤干细胞的可行性。【方法】 Hela细胞分组接受分割剂量分别为2、4、6、8、10及12 Gy的射线照射,总照射剂量24 ~ 42 Gy。流式细胞术检测各照射组及对照组细胞的ABCG2、CD44及CD133表达率;各组细胞接种裸鼠皮下,检测其体内成瘤能力。【结果】 各照射组细胞的ABCG2表达率均明显上调,以Hela-R2组(4 Gy×10次)细胞的表达率最高[(46.89±1.20)%],且随着照射次数的增加而升高(P < 0.05);各组细胞的CD44及CD133表达率变化均无明显趋势;Hela-R2组细胞的裸鼠体内成瘤能力最高,其次为Hela-R5组(10 Gy×3次)。【结论】 分割剂量射线照射可在体外富集宫颈癌肿瘤干细胞,以分割剂量为4 Gy组富集效果最好,诱导Hela细胞株表达ABCG2显著上调,及提高其裸鼠体内成瘤能力。     

Snail基因慢病毒载体的构建及其促进结肠癌细胞上皮间质化的研究

【目的】 构建Snail基因慢病毒载体,研究Snail基因的表达与结肠癌细胞上皮间质化的关系。【方法】 利用Gateway Technology法构建Snail基因表达质粒和空白对照质粒,行慢病毒包装,成功构建Snail基因慢病毒载体后,在结肠癌细胞系caco2中转染Snail基因质粒及空白载体对照,构建稳转细胞株caco2- Snail和caco2-vc,并在LoVo细胞中瞬时转染上述质粒,对Snail及E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达进行检测,并用划痕、Tanswell实验对细胞的迁移侵袭能力进行研究。【结果】 成功构建Snail基因慢病毒载体并经测序证实：在转染Snail的细胞株中有明显的Snail基因及蛋白表达,其上皮标记E-cadherin的表达比转染空载体的对照组细胞明显下调,且其迁移侵袭能力要强于对照组细胞。【结论】 Snail基因慢病毒载体在宿主细胞中表达稳定可靠,可以作为研究上皮间质化很好的工具,Snail基因有明显促进结肠癌细胞上皮间质化的作用。     

miR-26a对人肝癌HepG2蛋白表达的影响

目的 分析mircoRNA-26a(miR-26a)转染对人肝癌HepG2细胞表达蛋白质组的影响,以确定miR-26a与肝癌发生发展的相关性.方法 常规培养人肝癌HepG2细胞株,经miR-26a转染72h后裂解并提取蛋白,双向电泳分离,匹配对比各蛋白斑点的表达量,筛选主要差异表达蛋白进行质谱鉴定.结果 HepG2细胞经miR-26a转染后表达蛋白谱呈现普遍下调的趋势,差异表达超过2倍及以上的蛋白斑点有10个.其中,有3个蛋白斑点为表达上调,有7个蛋白斑点为表达下调.质谱鉴定为:膜联蛋白A1、过氧化物酶4、增殖细胞核抗原、载脂蛋白A1、细胞色素C氧化酶5a、磷酸核糖焦磷酸激酶3、周期素依赖性蛋白激酶1和磷脂酰乙醇胺结合蛋白.结论 miR-26a可能通过调节HepG2肝癌细胞上述蛋白分子的表达,直接或间接发挥其抑癌作用.通过对这些差异表达蛋白分子机制的深入研究,将为阐明miR-26a的抗癌作用提供进一步的线索和依据.     

四环素基因表达调控系统调控β-半乳糖苷酶基因在肝癌细胞中的表达

目的：构建调控β-半乳糖苷酶（β-gal）基因表达的四环素基因表达调控载体,验证其在肝癌细胞内调控β-半乳糖苷酶基因的表达,为进一步利用该调控系统调控治疗基因治疗肝癌奠定实验基础。方法：根据2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因与pcDNA3.1载体的基因核苷酸序列,设计引物,以pcDNA3.1载体为模板进行PCR。将具有串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因的PCR产物连接入pcDNA3.1载体CMV启动子下游,构建成pcDNA3.1-TetO2载体,应用ABI 3130 测序仪利用pcDNA3.1-TetO2载体对TetO2 PCR产物进行测序分析。再将β-gal克隆入pcDNA3.1-TetO2载体,构建成受四环素调控表达的β-半乳糖苷酶基因的表达载体pcDNA3.1-TetO2-β-gal。利用脂质体将携带四环素调控子基因（TR）的pcDNA6/TR载体转染到肝癌细胞HepG2中,利用杀稻瘟菌素进行细胞转染的稳定筛选,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TR基因在HepG2细胞内的表达。将pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体转染到稳定表达pcDNA6/TR的HepG2细胞中,转染3～4 d后,给予强力霉素（4 mg•L^-1）,利用β半乳糖苷酶原位染色试剂盒染色,检测β-半乳糖苷酶基因的表达。结果：构建的pcDNA3.1-TetO2载体测序结果表明,串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因片段插入到pcDNA3.1载体CMV启动子基因下游。pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体酶切鉴定结果表明,β-gal成功地克隆入pcDNA3.1-TetO2载体。RT-PCR结果显示,TR基因在pcDNA6/TR转染的经杀稻瘟菌素筛选的HepG2细胞内得到稳定表达。给予强力霉素后,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞 内得以表达;而未给予强力霉素,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞内表达受到抑制。结论：成功地构建了调控β-半乳糖苷酶基因表达的四环素基因表达调控载体,利用该载体成功地调控了β-半乳糖苷酶基因在HepG2细胞内的表达。     

转录因子CTCF对人肝癌干细胞及细胞增殖的影响

目的 探讨CCCTC结合因子 （CTCF）蛋白对人肝癌细胞 （HepG2）的肿瘤干细胞的影响以及对HepG2和CNE1 （鼻咽癌细胞系）细胞生存能力的影响。方法 构建pEGFP-N1/CTCF、CTCF shRNA和GFP-shRNA质粒,转染至HepG2和CNE1细胞后,以RT-PCR及Western blot 检测CTCF mRNA和蛋白的表达。采用流式细胞术检测转染CTCF-shRNA质粒后48 h的HepG2细胞中携带表面抗原CD90肿瘤干细胞的比例,以转染GFP-shRNA的HepG2细胞和野生型HepG2细胞为对照。采用MTT方法分别检测转染CTCF过表达重组质粒及CTCF-shRNA质粒后24、48、72 h HepG2和CNE1细胞的生存能力。 结果 pEGFP-N1/CTCF转染后增加HepG2和CNE1细胞中CTCF mRNA和蛋白的表达（与pEGFP-N1相比,P<0.05）,CTCF-shRNA转染则降低表达（GFP-shRNA相比,P<0.05）。流式细胞仪检测结果显示,CD90 +细胞的检出率在转染CTCF-shRNA质粒细胞 〔(1.733 0±0.417 7)%〕高于野生型HepG2细胞 〔(0.575 0±0.062 9)%〕及转染对照GFP-shRNA质粒细胞 〔(0.350 0±0.086 6)%〕 （P<0.05）;MTT实验结果显示CTCF的表达改变对HepG2和CNE1 细胞的生存能力的影响不明显 （P>0.05）。结论 CTCF可抑制人肝癌干细胞生成,对HepG2和CNE1细胞生长无明显影响。     

E2F3基因沉默载体pRNAT-U6.1-siE2F3/Neo的构建及表达

【目的】构建针对E2F3基因的shRNA表达载体,通过脂质体进行膀胱癌细胞内转染,监测转染效率。【方法】通过软件设计针对E2F3基因的寡核苷酸链,化学合成一对编码短发夹RNA序列,长度为64个碱基。核苷酸链经退火,克隆到经BamHI、HindⅢ双酶切的pRNAT-U6.1/Neo载体上,构建针对E2F3基因的RNA干扰质粒。通过双酶切、PCR鉴定及基因片段序列分析验证构建效果。通过不同浓度的Lipofectamin 2000及干扰质粒混合物进行膀胱癌细胞系5637细胞转染,通过绿色荧光的表达程度摸索出细胞最佳转染浓度及转染时间。【结果】重组构建的pRNAT-U6.1-siE2F3/Neo载体经PCR分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。Lipofectamin 2000能够有效的进行pRNAT-U6.1-siE2F3/Neo质粒的转染。【结论】载体的成功构建及膀胱癌细胞系的高效转染,为进一步研究E2F3基因在膀胱肿瘤中的功能奠定基础。