基因治疗中反转录病毒的细胞导向性基因转移

成功的基因治疗要求将治疗基因高效、细胞特异性地传递到靶组织并稳定表达。因此需要发展细胞导向性转移基因的基因治疗载体。反转录病毒(Retrovirus,RV)是目前最常用、也是成功率最高的基因治疗载体,但普遍缺乏细胞导向性。RV 载体靶向转移基因可以通过两种水平来实现:1.基因传递水平,利用天然或修饰 RV 包膜糖蛋白与细胞特异性表面蛋白的相互作用使基因定向传递到靶组织;2.基因传递水平,利用组织特异性启动子控制基因在特定组织表达。本文主要讨论 RV 载体在基因传递水平靶向转移基因方面的研     

基因治疗中的靶向转移载体研究

自 1990年美国ＮＩＨ批准开始第一例临床基因治疗试验以来 ,全世界已有 2 10 0多例患者因各种各样的疾病 ,如病毒感染、单个基因缺乏等进行基因治疗。在基因治疗过程中 ,为使基因能在患者体内有良好的表达并产生满意的治疗效果 ,就必须有一个合适的基因治疗系统 ,其组成除含治疗基因外 ,还需靶向转移载体系统 (即基因传递系统 )及基因表达系统。靶向转移载体系统可将基因定向传递到特定的靶细胞中。目前 ,基因的靶向转移载体可分为病毒性及非病毒性两大类。1　病毒性靶向转移载体病毒性靶向转移载体是目前临床应用十分广泛的一类载体 ,其特…     

不同启动子调控的PNP基因载体的构建和表达差异性分析

目的分别构建巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)通用启动子和甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)组织特异性启动子调控的PNP基因表达载体并分析二者表达的差异性。方法将AF0．3启动子插入载体pcDNA3．0，构建肝癌细胞特异表达载体pAF0．3；将PNP基因分别插入到pcDNA3．0和pAF0．3中，构建不同启动子调控下的PNP基因表达载体pcDNA3．0／PNP和pAF0．3／PNP；通过酶切、PCR及测序鉴定各重组体。采用脂质体介导法将两种PNP基因表达载体转染不同的细胞株，RT—PCR检测PNP基因在各细胞株中的表达，分析二者表达的不同。结果各目的片段均成功插入相应的载体中，CMV启动子调控下的PNP基因在各株细胞中均实现了表达，而AF0．3启动子调控下的PNP基因则在AFP阳性肝癌细胞中实现了组织特异性表达。结论两PNP基因表达载体是肝癌基因治疗中新型、高效的治疗载体，且pAF0．3／PNP还实现了在AFP阳性肝癌细胞中的靶向性表达。     

中国人脑胶质瘤中表皮生长因子受体的表达

目的：研究中国人脑胶质瘤中表皮生长因子受体（EGFR）的表达及其在脑胶质瘤靶向性基因治疗中的意义。方法：应用免疫组化法检测人脑胶质瘤组织及瘤周组织EGFR的表达水平，检测人脑胶质瘤细胞株U87MG、U251MG和大鼠脑胶质瘤株C6表面EGFR的表达，筛选EGGR高表达胶质瘤细胞株作为靶向性非病毒载体基因转移系统的靶细胞。结果：肿瘤组织与瘤周组织的EGFR表达水平有显区别，肿瘤组织EGFR表达水平明显高于瘤周组织（P＜0．01）；肿瘤组织EGFR表达水平与肿瘤级别有显相关性，肿瘤级别越高，EGFR表达水平越高（P＜0．05）；人脑胶质瘤细胞株U251MG为EGFR相对高表达细胞株，其平均表达水平明显高于U87MG和C6细胞株。结论：中国人脑胶质瘤中存在表皮生长因子受体的过度表达，不同胶质瘤细胞株表皮生长因子受体的表达相差悬殊，EGFR可作为靶受体应用于脑胶质瘤的靶向性基因治疗。     

大鼠骨形成蛋白4基因重组腺病毒的构建

目的 利用Cre-loxP特异性位点基因重组技术构建大鼠骨形成蛋白BMP4的重组腺病毒.方法 高保真PCR得到大鼠BMP4 cDNA,克隆到质粒pCR-Blunt Ⅱ-TOPO中,然后将目的基因片段连接到中间载体质粒pDNR-CMV,测序后在Cre重组酶作用下,将BMP4 cDNA转移到腺病毒载体pLP-Ade-no-X-CMV.在HEK 293细胞中扩增重组腺病毒,并检测BMP4基因重组腺病毒在细胞中的表达和功能.结果 PCR法和限制性内切酶Xhol I消化法均证实BMP4重组腺病毒的成功构建,RT-PCR和Western Blot检测证实该重组腺病毒显著性增强了CFSC-2G细胞中BMP4的mRNA和蛋白表达水平.结论 Cre-loxP特异性位点基因重组技术是一种快速、高效构建基因重组腺病毒的方法,大鼠BMP4基因重组腺病毒的成功构建为进一步研究BMP4的细胞调控功能和BMP4基因治疗提供了良好的工具.     

癌胚抗原启动子调控融合自杀基因yCDglyTK载体的构建及其应用研究

目的构建靶向性基因治疗载体pcDNA3．1（-）CryCDglyTK，研究癌胚抗原（CEA）启动子是否能控制新型融合自杀基因yCDglyTK在CEA阳性结肠癌细胞中专一性表达和杀伤作用。方法采用PCR、RT—PCR、融合PCR、酶切、连接等技术构建由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因pcDNA3．1（-）cvvCDglyTK表达载体和分别由CEA启动子和巨细胞病毒（CMV）增强子驱动的融合自杀基因pcDNA3．1（-）CEAyCDglyTK、pcDNA3．1（-）CMVyCDglyTK表达载体，以磷酸钙纳米为载体分别转染CEA阳性的人结肠癌细胞株LOVO细胞和CEA阴性的Hela细胞，采用RT—PCR、免疫荧光法检测感染细胞中yCDglyTK基因的表达，并用MIT法检测感染后细胞对5-氟胞嘧啶（5-FC）的敏感性。结果LOVO细胞在感染以上三种质粒表达载体后均有yCDglyTKmRNA表达，且对5-FC的敏感性明显增强，Hela细胞在纳米-pcDNA3．1（-）CMVyCDglyTK复合物感染后有yCDglyTKmRNA表达，对5-FC的敏感性增强，而在纳米-pcDNA3．1（-）CEAyCDglyTK及纳米-pcDNA3．1（-）CVyCDglyTK复合物感染后则没有yCDglyTKmRNA表达，5-FC对其亦无杀伤作用。结论该实验构建的由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因yCDglyTK靶向性基因治疗载体。能使融合自杀基因在CEA阳性细胞中专一性表达，从而达到靶向治疗肿瘤的目的。     

Akt shRNA载体的构建及其对结肠癌细胞株Lovo Akt基因表达的抑制作用

目的构建靶向人Akt基因的shRNA真核表达载体,通过RNAi下调Akt基因在结肠癌Lovo细胞系中的表达,观察对结肠癌细胞生长的影响。方法将靶向人Akt基因的两条shRNA(Akt1-U6-1#;Akt1-U6-2#)表达序列克隆到入门载体pENTRTM/U6的黏性末端,测序鉴定后与目的表达载体Plentio/Block-iT DEST Vector进行LR位点特异性重组;分别将入门载体与目的表达载体转染入Lovo细胞,对细胞株行RT-PCR和Western blotting检测,观察siRNA对靶基因Akt的抑制效果。结果 DNA测序证实pENTRTM/U6-TF-shRNA入门载体和Plentio/Block-iT DEST目的表达载体为阳性克隆,转染Lovo细胞后,Akt基因在mRNA和蛋白水平的表达量受到明显抑制。结论成功构建了靶向人Akt的shRNA表达载体,且该载体在体外能有效抑制Lovo细胞Akt基因表达,为进一步研究Akt的功能和肿瘤的基因治疗奠定了实验基础。     

改性壳聚糖作为基因递送载体的研究进展

基因治疗在替代功能障碍基因和肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。基因治疗有3个基本要素:目的基因、表达载体和递送载体,其中递送载体的构建和改进,一直是基因治疗研究的重点。递送载体有病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体的转染效率较高,但也存在一些明显缺点,如免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、靶向特异性差、制备较复杂及费用较高等[1],因此人们愈来愈重视非病毒载体的研究。其中壳聚糖及其衍生物是研究的热点之一。1壳聚糖壳聚糖是甲壳类动物的甲壳质脱乙酰化后得到的阳离子多糖类物质。壳聚糖安全无毒,在体内可降解成水和二氧化…     

超声微泡造影剂与靶向治疗

基因治疗是近年来生命科学研究的热点，但迄今为止缺乏安全、高效的基因载体及基因转移方法，目前常用的病毒载体存在免疫原性和致突变性，而裸质粒等非病毒载体又存在转染率低、靶向性差等缺陷。因此，发展安全、高效、可控、简便实用的基因载体及基因转移方法己成为基因治疗研究的重点。超声医学在长期发展中，从诊断超声、治疗超声走向两个新的应用领域：药物输送和基因治疗。微泡（microbubble）的使用已被证明可以大大提高超声效应即基因或药物转染效率。     

肝干细胞作为肝癌靶向基因治疗载体的体内实验研究

肝癌基因治疗作为现代分子药物治疗，为肝癌的治疗带来了新的前景，但目前肝癌基因治疗的研究结果尚不能令人满意，缺乏良好的基因转移载体是其重要原因，改进现有思路，提供一个靶向肝癌细胞的新的基因转移策略十分必要。     

靶向性非病毒载体GE7系统的构建及对人脑胶质瘤体外转移效率分析

目的：组建表皮生长因子受体介导的靶向性非病毒载体GE7系统，研究GE7系统对U251人恶性胶质瘤细胞株的体外转导效率。方法：应用上海市肿瘤研究所组建的EGF-R配体16肽GE7、流感病毒血凝素N端20肽HA20与多聚赖氨酸P.L.组成非病毒载体基因转移系统，分别与β-gal报道基因、p21WAF-1/CIP1基因组成多肽/DNA载体四元复合物。β-gal报道基因体外转导U251细胞，分析GE7系统体外导入效率。结果：载体DNA复合物组转染后24h即可观察到少量外源基因的表达，72h外源基因表达达到高峰，然后逐渐下降，转染后168h基本消失。单纯质粒DNA组仅见微弱外源基因的转入；对照组未见外源基因的转入。结论：GE7基因转移系统具有较高的基因转移效率和靶向性，为脑胶质瘤基因治疗提供了一种新的途径。     

pcDNA3.1-mAFP真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建真核表达载体pcDNA3．1-mAFP，观察其在293肿瘤细胞中的表达情况。方法从Hepal-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR法扩增小鼠甲胎蛋白（mAFP）基因编码区全长序列，测序确认后，插入到pcDNA3．1真核表达载体中，双酶切鉴定。用Lipofectamine脂质体将构建的重组载体转染293肿瘤细胞，检测AFP蛋白在293细胞中的表达情况。结果成功克隆了mAFP基因编码区全长序列，构建出重组真核表达载体pcDNA3．1-mAFP，脂质体转染后可检测到mAFP基因在293细胞中的表达。结论该研究成功构建了重组pcDNA3．1-mAFP真核表达载体，为进一步开展原发性肝癌的靶向性基因治疗奠定了基础。     

MDR1启动子调控的双自杀基因真核表达载体的构建及其在K562/A02细胞中的表达

目的：构建多药耐药基因（MDR1）启动子调控的CD-TK双自杀基因真核表达载体用于耐药白血病的靶向性基因治疗。方法：采用PCR方法从K562/A02细胞基因组DNA中扩增MDR1启动子，将其连接到双自杀基因CD TK的上游，构建pcDNA3 MDR1 Promoter CD-TK真核表达载体，用脂质体介导法将构建好的载体转染入K562、K562/A02细胞，PCR鉴定CD、TK基因的整合，RT-PCR鉴定CD、TK基因的表达。结果：PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确，通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。转染入细胞后PCR结果显示，CD、TK基因均整合入K562、K562/A02细胞中，RT-PCR结果显示,562/A02/CD TK细胞CD、TK基因有特异性条带表达，而K562/CD TK细胞无特异性条带。结论： MDR1启动子调控的CD TK双自杀基因真核表达载体的成功构建及其在K562/A02细胞中的特异性表达为耐药白血病的靶向性基因治疗提供了实验基础。     

PSMAe/p驱动shRNA靶向干扰核干因子治疗前列腺癌的研究

目的 探讨前列腺特异性膜抗原增强子、启动子(PSMAe/p)驱动shRNA靶向干扰核干因子(NS)治疗前列腺癌的有效性和应用前景.方法 免疫组织化学染色观察NS基因在前列腺癌LNCaP细胞和PC-3细胞中的表达 ;利用构建的以poly(A)为终止信号的NS特异性shRNA表达载体pPSMAe/p-shNS-poly(A)转染LNCaP细胞和PC-3细胞 ;观察RNA干扰后细胞体外增殖的变化,检测NS基因水平、细胞周期、细胞凋亡的变化.结果 NS在LNCaP和PC-3细胞中高表达 ;pPSMA-shNS-poly (A)在转染高表达PSMA的LNCaP细胞后NS表达受到抑制,细胞周期受到阻滞,并抑制了细胞的增殖,同时导致细胞发生凋亡 ;而在不表达PSMA的PC-3细胞中NS表达无明显抑制,细胞周期未受到阻滞,细胞凋亡无明显变化.结论 PSMAe/p驱动shRNA靶向干扰NS基因具有细胞特异性 ;NS基因在LNCaP细胞恶性增殖中发挥重要作用,NS可能是前列腺癌基因治疗的理想靶基因之一.     

靶向小鼠整合素β_1的shRNA表达载体构建及鉴定

目的构建小鼠整合素β1的shRNA表达载体,用RNA干扰下调整合素β1基因在小鼠支气管平滑肌细胞中的表达。方法设计并合成靶向小鼠整合素β1基因的shRNA表达载体,转染入哮喘小鼠的支气管平滑肌细胞,检测shRNA表达载体对靶基因的抑制效果。结果 shRNA表达载体能稳定转染小鼠支气管平滑肌细胞,转染后的整合素β1mRNA及蛋白质水平均显著下调。结论成功构建了靶向小鼠整合素β1高效、持久的shRNA表达载体,转染细胞后可下调整合素β1表达,为进一步研究整合素β1在哮喘气道重塑中的作用及其基因治疗奠定了基础。     

肝脏靶向性基因治疗的研究进展

基因治疗是一种通过载体系统将目的基因导入机体发挥治疗作用的新型药物。肝脏靶向性基因治疗不仅可以针对肝脏本身疾病发挥作用，还可利用肝脏作为机体的生物反应器，通过表达的基因产物对全身性或其他器官的疾病发挥治疗作用。由于肝脏具有对进入体内物质的代谢和解毒特性，大多数基因载体都会进入肝脏。因此肝脏靶向性是基因治疗领域的一个重要研究方向。早期由于特异性、疗效、毒性和免疫限制，肝脏靶向性基因治疗的实际临床价值受到限制。随着载体技术和监测技术的不断进步，肝脏靶向性基因治疗现已成为治疗各种肝脏和非肝脏相关疾病的一种具有潜力的方法。本研究在梳理肝脏靶向性基因治疗分类、病毒和非病毒载体系统的基础上，概述肝脏靶向性基因治疗技术进展过程和发展现状，探讨肝脏靶向性基因治疗在肝癌、遗传性系统性疾病、遗传性代谢性肝病、脂代谢紊乱性疾病等方面应用，总结分析当前肝脏靶向性基因治疗存在问题以及潜在解决方案，进一步展望肝脏靶向性基因治疗的未来前景，以期为肝脏靶向性基因治疗的研究和应用提供借鉴和参考，进而促进我国基因治疗的创新发展。     

含Ⅰ型单纯疱疹病毒包装信号序列片段的分离及扩增子质粒双表达载体的构建

利用基因工程技术分离出含有Ⅰ型单纯疱疹病毒（HSV－1）包装信号序列和HSV－1基因组复制起点序列的片段，表达外源基因所必需的启动子序列以及其下游作为报告基因的lacZ基因片段，构建成质粒型HSV－1载体pHSVL。用脂质体介导的方法可将该质粒转染入经辅助病毒HSV－1tsK株超感染的Vero细胞，并将其包装成HSV－1假型病毒颗粒，可如天然病毒一样再感染传代细胞和神经细胞并在其中进行基因表达。在pHSVL的基础上，我们还构建了一种可同时表达两种外源基因的质粒型疱疹病毒载体pHLCL，即在pHSVL中插入第二个转录单位：HCMVIE启动子和其下游的荧光素酶基因（lucgene），由此获得的pHLCL病毒接种传代细胞证明它可在其中同时表达两种报告基因．本研究成功地构建了两种质粒型HSV－1载体，其独特的基因转移方式使之在神经生理、病理及神经系统疾病的基因治疗的实验研究中都具有广阔的应用前景。     

间充质干细胞的肿瘤归巢特性及其肿瘤靶向治疗应用研究进展

间充质干细胞（MSC）具有受肿瘤组织或肿瘤微环境释放的多种趋化因子吸引而向肿瘤组织靶向归巢的天然属性,因此有望成为一种新型的活细胞传递载体用于抗肿瘤药物/基因的靶向递送。外源性MSC静脉注射后会首先在肺部被大量截留,经肺清除后向肿瘤组织归巢,可以通过增强趋化因子与MSC上受体的相互作用或改变注射方式减少MSC截留等方法改善MSC的肿瘤归巢效率。基于MSC的传递系统可用于靶向递送阿霉素、紫杉醇和吉西他滨等化疗药物,帮助解决化疗药物半衰期较短、肿瘤靶向性较差等问题。其次,MSC可以通过基因重组的方式有效保护和靶向递送肿瘤细胞杀伤基因、免疫系统调节基因等治疗基因,通过在肿瘤部位特异性表达治疗基因实现肿瘤抑制或杀伤作用。此外,MSC还可以作为细胞传递载体靶向递送诊疗药物,发挥肿瘤诊疗一体化的治疗作用。总之,基于MSC的细胞载体递送系统可实现化疗药物、治疗基因和诊疗药物的靶向递送并在多种类型的肿瘤靶向治疗中取得良好的疗效。相信随着这一细胞载体递送策略的不断改良和优化,基于MSC的靶向传递系统将为肿瘤靶向治疗提供一种新的传递策略和治疗选择。     

PSA增强子启动子调控Smac基因表达载体的构建

目的 构建携带Smac基因、人前列腺特异性抗原(PSA)增强子(PSAE)/PSA启动子(PSAP)调控的前列腺特异性真核表达载体.方法 切除含Smac基因的真核表达载体pcDNA 3.1-Smac内部的人巨细胞病毒/T7启动子序列,替换为在前列腺组织特异性表达的PSAE、PSAP调控序列.构建的质粒经双酶切凝胶电泳及测序鉴定.结果 成功构建携带Smac基因人PSAE-PSAP调控的前列腺特异性真核表达载体pcDNA3-PSAE-PSAP-Smac质粒.结论 新构建的载体为前列腺癌的靶向基因治疗奠定了基础.     

放射诱导HSV-TK基因在肺癌细胞中靶向、高效性表达的研究

目的 构建放射诱导的同步放大基因电路,通过基因电路调控HSV-TK基因在肺癌细胞中靶向、高效性表达,以提高放射-基因治疗的有效性和靶向性.方法 利用分子克隆的方法将HSV-TK基因插入到同步放大基因电路载体的下游,并采用脂质体介导重组载体和对照载体转染肺癌细胞A549;G418筛选阳性克隆,转染细胞给予2Gy X线照射后,检测照射前后不同时相点细胞内TK表达情况,及不同浓度前药GCV对转染重组载体和对照载体的肺癌细胞的生长抑制率.结果 照射后转染同步放大重组载体的细胞内TK的表达明显强于对照组,且随时间的推移而逐渐增强,以照射后16h最为明显.同一浓度的GCV对转染同步放大载体的A549细胞的抑制率明显高于对照组和未转染组,IC50也明显低于对照组和未转染组.结论 同步放大基因电路明显增强了靶细胞内HSV-TK基因的表达,进一步完善了放射-基因治疗这一新的肿瘤治疗模式.