多重PCR快速检测鉴别牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的研究与应用

目的利用多重PCR方法建立一种同时快速检测鉴别牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的方法。方法根据牛布鲁氏菌具有种特异性的BCSP-31K基因和牛分枝杆菌23SrRNA，设计并合成了两对分别扩增牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的特异性引物，建立了多重PCR同时快速检测鉴别以上两种病原体的方法。其扩增片段大小牛布鲁氏菌为311bp、牛分枝杆菌为838bp。对所建立的多重PCR方法进行特异性试验和敏感性试验。并应用所建立的方法对临床样品进行检测。结果该多重PCR方法对所有供试的牛布鲁氏菌都能扩增出311bp，结核分枝杆菌都能扩增出838bp目的片段，对其它参试牛的菌株则无311bp和838bp条带，该多重PCR方法对牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的DNA最低检出量为10pg。305份临床样品中10份牛奶样品为牛布鲁氏菌阳性，41份包括36份PPD阳性鼻粘液样品、3份PPD可疑鼻粘液样品和2份PPD阳性牛奶样品为牛分枝杆菌阳性，其余样品均为阴性。     

基于GroEL基因的实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体方法的建立及评价

目的 建立一种敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,用于检测临床标本中的恙虫病东方体。方法 根据恙虫病东方体GroEL蛋白基因序列设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。并从灵敏度、特异度、重复性及临床标本的检测能力等方面对本方法进行综合评价。结果 建立的实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性,可检测出恙虫病东方体Gilliam、Karp、Kato和Kawasaki株。建立的标准曲线循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈现良好的线性关系(r=0.99),灵敏度分析显示样品最低检出浓度为21.8拷贝/μL。批内及批间重复性实验变异系数均小于1.5%,显示本方法具有良好的重复性。对本实验室保存的82份临床标本进行检测,并与常规巢式PCR方法比较,本方法检测出26份阳性标本中的25份,检出率为96.15%。结论 本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有较高的敏感性、特异性和稳定性,可用于临床病人及暴发疫情的实验室快速检测。     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测

目的建立一种鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测方法。方法根据已发表的结核分枝杆菌23SrRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成了两对可扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,建立二重PCR快速检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法,测定其特异性和敏感性,并对238份牛临床样品的DNA分别进行了检测。结果该方法对牛分枝杆菌能扩增出838bp和631bp的特异性基因片段,结核分枝杆菌只扩增出838bp基因片段而扩增不出631bp的特异性基因片段,对参试的其它牛菌株的DNA扩增结果均为阴性。敏感度检测可达到50pg的DNA含量。临床样品检测结核分枝杆菌阳性有21份,牛分枝杆菌阳性有1份,其它临床样品扩增结果全部为阴性。结论本方法可作为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。     

基于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法的建立

目的 本文建立一种基于样品检测的特异性好、灵敏性高的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法。方法 以哺乳动物beta-actin基因和外源重组质粒为内参,针对布鲁氏菌属特异性基因IS711,建立用于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法,并验证其敏感性、特异性及稳定性,绘制标准曲线。将该方法用于哺乳动物样品检测,并与细菌分离培养检测结果比较。结果 荧光定量PCR方法对布鲁氏菌检测有良好的特异性,3对引物对阴性对照菌均无非特异性扩增;该方法用于样品检测的最低检测限为17拷贝;内外源内参同时存在条件下,布鲁氏菌荧光定量PCR的标准曲线相关系数为R²=0.997(Y=-3.12X+40.9)。将该方法直接用于181份动物样本的检测,并与分离培养结果相比,荧光定量PCR检测阳性率为11.4%,细菌分离培养检测阳性率为9.9%,且细菌分离培养阳性样品与荧光定量PCR阳性样品中编号基本一致。结论 本文建立的荧光定量PCR检测方法灵敏性高、特异性及稳定性好,可直接应用于样品的检测,检测结果受内参基因质控。     

实时荧光定量PCR法分析结核分枝杆菌对异烟肼耐药的分析

目的利用实时荧光定量PCR技术快速检测异烟肼耐药结核分枝杆菌。方法收集到医院就诊的结核病疑似患者痰液样本,提取痰液样本的总DNA,利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术对结核分枝杆菌感染进行快速筛查,并与传统药敏试验进行比较,对两者的灵敏度、特异性、一致性进行比较分析。结果检测346例结核病人临床分离培养样本,药敏试验检出257例异烟肼敏感标本,101例异烟肼耐药标本;实时荧光定量PCR法共检测出异烟肼敏感和耐药标本225例98例,灵敏度为86.64%,特异性为93.92%,一致率为93.12%。结论跟传统药物敏感性实验相比,实时荧光定量PCR法检测速度快速、特异性强、灵敏度较高,可用于结核分枝杆菌耐异烟肼突变的快速检测,适于耐多药结核病的快速筛查。     

基于PCR蜱体内巴贝虫检测方法的评价

目的分别对4种牛体表蜱体内巴贝虫和两种犬体表蜱体内巴贝虫基于PCR的检测方法进行评价。方法在广西壮族自治区6个市的62个村,现场采集犬和牛体表蜱。巢式PCR特异性扩增巴贝虫18s rDNA,纯化阳性样本的PCR产物、测序、比对,以确定感染的病原体。应用双重PCR、双重巢式PCR、双重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测牛体表蜱内病原体双芽巴贝虫(Babesia bigemina)和牛巴贝虫(B.bovis)的感染情况。应用多重PCR检测犬体表蜱的犬巴贝虫(B.canis canis)、佛氏巴贝虫(B.canis vogeli)和罗氏巴贝虫(B.canis rossi)的感染情况。将各方法的检测结果进行比较,对检测方法进行评价。结果采集牛体表蜱102只。巢式PCR、双重PCR、双重巢式PCR检测牛体表蜱内双芽巴贝虫和牛巴贝虫均为阴性,双重LAMP的浊度仪检测结果为5例阳性,颜色观测结果阳性样本为29例,该29例包含浊度仪检测的5例阳性。采集犬体表蜱184只。巢式PCR检测出犬体表蜱佛氏巴贝虫阳性样本9例。其中4例被多重PCR检测出佛氏巴贝虫阳性。同时多重PCR检测检出罗氏巴贝虫阳性样本4例,经测序均为罗氏巴贝虫阴性。结论双重PCR、双重巢式PCR检测牛体表蜱体内巴贝虫未出现假阳性情况,巢式PCR检测微小巴贝虫,双重PCR、双重巢式PCR未发生交叉反应,说明其具有一定特异性,但因无阳性样本,敏感度需要进一步评价。双重LAMP颜色观测结果阳性率15.76%,浊度仪测出阳性率2.72%,其中双重LAMP颜色观测法2例阳性样本为巢式PCR微小泰勒虫阳性(Theieria microti)。双重LAMP法直观快捷,但对其检测的阳性样本需进行进一步确认,同时由于该方法的高度敏感性,需注重预防实验污染。犬体表蜱多重PCR可一次鉴别3种犬巴贝虫,鉴于在本研究中的假阳性和假阴性情况,多重PCR不适用,建议将病原体独立检测。     

TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌

目的利用新一代TaqMan MGB探针技术,建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于布鲁氏菌的快速检测。方法针对布鲁氏菌基因组中16SrRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套基于TaqMan MGB探针技术的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性,对2008-2010年期间采集的773份动物样本中的布鲁氏菌进行检测,并与普通PCR方法进行比较分析。结果建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法对布鲁氏菌的检测具有高度的特异性,对小肠结肠耶尔森菌、假结核耶尔森菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌、泰泽氏菌均无交叉反应。生成的标准曲线的相关系数为0.999,斜率为-3.301,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR效率为100.872%。TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能够准确地从布鲁氏菌阳性样本中检测到布鲁氏菌DNA,最低能够检测到的布鲁氏菌数量为9.3拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高100倍。对773份动物样本进行检测,结果TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能检出53份布鲁氏菌阳性样本,而常规PCR只检出37份阳性。结果显示,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法比常规PCR方法更敏感,能够直接从动物样本中检出布鲁氏菌DNA,检测时间仅为2h。结论本研究首次建立了直接用于检测动物样本中布鲁氏菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,该技术适用于传染性病原体的快速检测与鉴定。     

嗜水气单胞菌双重荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立快速准确检测致病性嗜水气单胞菌的双重荧光定量PCR方法。方法针对嗜水气单胞菌的16S rDNA和气溶素基因aerA的序列设计特异性引物及TaqMan探针,优化双重荧光定量PCR反应条件,并结合常规PCR方法及分离培养鉴定对临床样品进行检测和对比验证。结果荧光定量PCR反应体系对质粒标准品的敏感性为10拷贝/反应,是常规PCR检测方法的100倍;该方法检测12种其他种属细菌时未出现假阳性;对实际样品的检测结果其敏感性同样高于普通PCR,定量检测目的基因的拷贝数与样品中目的菌的分离率成正比。结论本方法敏感性高,特异性好,可用于致病性嗜水气单胞菌感染的诊断、疾病防控及流行病学研究。     

Real-Time PCR探针法定量检测沙门菌方法的建立及应用

目的建立快速、特异性好、灵敏度高的Real-Time PCR方法定量检测沙门菌。方法根据编码沙门菌肠毒素基因stn的核苷酸序列,设计荧光探针和一对引物,通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立定量检测沙门菌的方法。结果建立的Real-Ti me PCR方法有很好的特异性与敏感性,所检测沙门菌结果均为阳性,而非沙门菌均为阴性;标准曲线相关系数为R2=0.993,其敏感性为5CFU。运用该方法对108份鸡粪便、50份鸡肉以及58份水样进行检测,阳性率分别为3.7%(6/108)、4%(2/50)和3.4%(2/58),与传统细菌分离检测结果相符。结论结果表明该方法具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点,此研究为环境及疾病诊断中沙门菌快速检测提供了新方法。     

荧光定量PCR检测嗜吞噬细胞无形体

目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR)方法。方法依据gltA基因序列设计嗜吞噬细胞无形体特异引物和探针,以克隆的嗜吞噬细胞无形体gltA基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI7900HT)上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.996);与套式PCR相比较,荧光定量PCR检测的灵敏度是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体和细菌DNA样本,检出结果几乎为0;对荧光定量PCR检测重复性进行分析,变异系数(CV)批内和批间误差在0~2.1%之间,证明该荧光定量PCR具有种特异性和良好的重复性。用荧光定量PCR检测体疑染嗜吞噬细胞无形体的10份蜱和30份小鼠脾脏标本,结果与套式PCR检测结果有密切相关性,但是定量PCR检测敏感性和准确率均高于套式PCR。结论本研究建立的检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,特别适合检出样本中微量嗜吞噬细胞无形体。     

新疆某牛场牛结核病的综合诊断与病原分离鉴定

目的 用多种方法检测新疆某牛场的结核病并分离病原。方法 选择皮内变态反应、牛型PPD点眼试验、IFN-γ试验及ELISA抗体检测试验4种免疫学诊断方法对新疆某牛场进行牛结核病的综合诊断,锁定疑似阳性牛后进行扑杀、剖检并采集病料进行病原的分离,用已建立的PCR方法对培养的细菌进行分型鉴定。结果 共检测了奶牛755头,其中4种方法综合锁定结核疑似阳性牛26头(3.4%)。从中随机选择5头牛进行剖检均发现有明显的结核病变,采样后在罗氏培养基上进行培养,结果均为阳性。挑取菌落经PCR鉴定结果均为牛分枝杆菌。结论 牛结核病的诊断存在其他分枝杆菌的干扰,单一诊断方法因特异性不足导致结果存在误差。合理选择诊断方法的组合有利于牛结核病的确诊。     

荧光定量PCR技术在肺结核诊断中的临床应用研究

目的评价荧光定量PCR技术在肺结核病诊断中的应用价值。方法采用荧光定量PCR、金胺O染色荧光镜检和培养法同时检测860例肺结核患者的痰标本,对检测结果进行比较。结果荧光定量PCR检测灵敏度可达10~100 cfu/ml,重复性好,对其他呼吸道病原体检测结果均为阴性。肺结核患者痰标本荧光定量PCR检测阳性率要高于金胺O染色荧光镜检和培养法的阳性率,差异有统计学意义(P0.01)。结论应用荧光定量PCR方法检测结核杆菌,具有特异、灵敏、简便、快速的特点,可作为结核病诊断的方法之一。     

BOVIGAM: an in vitro cellular diagnostic test for bovine tuberculosis.

BOVIGAM which is based on the detection of gamma interferon (IFN- gamma) is a rapid, laboratory assay of a cell mediated immune response that may be used for the detection of tuberculosis (TB) infection in animals. Whole blood is first incubated overnight with bovine PPD, avian PPD or negative control antigens, and IFN- gamma in the supernatant plasma is then measured by EIA. TB infection is indicated by a predominant IFN- gamma response to bovine PPD. Since 1988, BOVIGAM has been extensively trialed on more than 200 000 cattle in Australia, Brazil, Ireland, Northern Ireland, Italy, New Zealand, Romania, Spain and the USA. Sensitivity has varied between 81.8% and 100% for culture-confirmed bovine TB and specificity between 94% and 100%. The IFN- gamma assay detects M. bovis infection earlier than the skin test and in New Zealand is applied to detect skin-test negative cattle with TB, where after slaughter a significant number of IFN- gamma reactors have TB. BOVIGAM is also approved in New Zealand for serial testing skin test positive cattle when non-specificity is suspected. Cattle are tested 7-30 days after a positive caudal fold test. The boosting effect of the skin test on T-cell activity allows blood to be cultured with PPD up to 30 h after collection without effecting accuracy.The BOVIGAM results are not affected by poor nutritional condition and are only mildly and briefly affected by dexamethasone treatment and parturition. IFN- gamma responses of cattle vaccinated with BCG are dose-dependent and short-lived. The BOVIGAM kit is now used routinely in many countries for the detection of M. bovis infected cattle, buffalo and goats.     

荧光定量PCR法在丙型肝炎病毒核糖核酸检测中的应用

目的：通过与荧光半定量PCR及传统逆转录PCR（RT-PCR）比较,探讨荧光定量PCR（FQ-PCR）在丙型肝炎病毒核糖核酸（HCV RNA）检测中的应用价值。方法：采用FQ-PCR、荧光半定量PCR及RT-PCR三种方法同步检测180例丙型肝炎患者HCV RNA含量,所得结果采用χ^2检验。结果：FQ-PCR在血浆中及单个核细胞中的阳性检出例数最多,分别占78.3%和83.7%。无论是在血浆中或单个核细胞测定,FQ-PCR阳性检出率均明显高于同步检测的荧光半定量PCR及RT-PCR（P〈0.01）。以RT-PCR为标准,当HCV RNA水平在10^3～5copies/ml时,FQ-PCR和荧光半定量PCR阳性检出水平相一致（P〉0.05）,明显高于RT-PCR（P〈0.01）。当HCV RNA水平在10^6～7cop-ies/ml时,3种检测方法的阳性检出率基本相同（P〉0.05）。结论：FQ-PCR检测HCV RNA具有高灵敏度、高特异性,且二次污染的可能性小。     

石蜡包埋组织实时荧光定量聚合酶链反应检测在结核病诊断中的价值

目的探讨石蜡包埋组织实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测结核分枝杆菌DNA在结核病诊断中的价值。方法275例组织标本行常规组织病理学检查、抗酸染色,并对石蜡包埋组织应用实时荧光定量聚合酶链反应检测结核分枝杆菌DNA。结果275例FQ-PCR检测结核分枝杆菌DNA阳性211例(76.7%),病理诊断为结核183例(66.5%),抗酸染色阳性23例(8.4%)。病理诊断为结核者FQ-PCR阳性率为93.4%,抗酸染色阳性者FQ-PCR阳性率95.7%。结论实时荧光聚合酶链反应技术敏感性高、其与组织病理学相结合可以提高诊断率。     

巢式实时荧光定量聚合酶链反应检测结核分枝杆菌DNA的临床应用

目的探讨巢式实时荧光定量PCR（QNRT-PCR）检测结核分枝杆菌（MTB）DNA的临床价值。方法应用SYBR Green I建立检测结核分枝杆菌MTP64基因的QNRT—PCR方法,分别检测24份肺结核患者痰液,27份结核性胸膜炎患者胸水,以及对照组75份痰液和胸水的MTBDNA含量。结果以培养为金标准,QNRT—PCR敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）分别为95．83％、61．54％、69．70％和94．12％,结核性胸膜炎的阳性率为70．37％。三种PCR方法阳性率比较,差异具有统计学意义（P〈0．05）,QNRT—PCR与实时荧光定量PCR拷贝数配对检验差异没有统计学意义（P〉0．05）,QNRT—PCR与实时荧光定量PCR的Cr值配对检验差异具有统计学意义（P〈0．01）。结论QNRT—PCR方法可检测痰液和胸水MTB DNA,对含微量MTB DNA样本的高敏感性在结核病的早期诊断中有重要参考价值。     

猪巨细胞病毒TaqMan荧光定量PCR检测的建立

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR方法。方法 根据GenBank已登录的猪巨细胞病毒(Porcine Cytomegalovirus,PCMV)DNA序列设计合成特异性引物对和TaqMan荧光探针,经优化反应条件,建立了猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法(fluorescent quantitative real-time PCR, FQ-PCR),进行了FQ-PCR检测方法的敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PCMV 感染临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了比对;对FQ-PCR检测结果为PCMV 阳性猪的不同内脏器官进行病毒含量比较检测。结果 成功建立了PCMV 的FQ-PCR方法,标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.998;检测灵敏度可达1 拷贝/μL,是常规PCR的100倍;特异性高,对pGEM-T/PCMV重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对6个对照病原的扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEM-T/PCMV重组质粒分别重复扩增6次,重复结果良好;对15份临床疑似PCMV感染的组织病料进行应用检测表明,其中有9份样品为阳性,与常规PCR方法检测的阳性符合率为100%。猪的内脏器管中PCMV含量最高为扁桃体,最低的为小肠。结论 成功建立了PCMV FQ-PCR方法,可用于临床上PCMV感染猪的确诊和隐性感染猪的早期检测,对PCMV的快速诊断、综合防控及净化等具有重要意义。     

用酶免疫法检测牛结核分枝杆菌的IgG抗体

目的　建立一种酶免疫法检测牛血清中牛结核分枝杆菌的IgG抗体。方法　从牛结核分枝杆菌中分离牛结核菌糖脂抗原 ,并固相在聚苯乙烯微量反应板上 ,将抗牛IgG单克隆抗体标记在辣根过氧化物酶。 结果　皮肤试验阳性 46头牛中 ,酶标阳性 30头牛。皮肤试验阴性 750头牛中 ,酶标阴性为 70 7头牛。结论　本法可作为皮肤试验的辅助试验     

百日咳鲍特菌BP283基因的实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的探讨检测百日咳鲍特菌BP283基因片段的有效方法。方法以百日咳鲍特菌BP283序列为目的基因,设计探针和引物,构建质粒标准品;建立FQ-PCR体系,优化反应条件,并进行方法学评价。结果成功构建了重组质粒pCR2.1-BP283;建立了检测BP283基因片段的FQ-PCR方法:标准曲线相关系数为0.998,最低检测浓度为102copies/μL,对临床其他常见呼吸道病原体不出现特异性扩增曲线,批内及批间变异系数均<4%。结论FQ-PCR方法可成功检测百日咳鲍特菌BP283基因,该方法具有敏感性好、特异性高及重复性好等优点。