金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR方法的建立与初步应用

目的建立金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR检测方法,为实验动物细菌检测提供快速、灵敏、简便的方法。方法根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌Las I基因、肺炎克雷伯杆菌Pho E基因和细菌通用16S rRNA基因设计出特异性引物;经过多重PCR引物浓度和退火温度的优化,特异性和敏感性的检测,建立多重PCR体系。应用该PCR体系对人工感染标本、实验动物粪便样本进行验证检测,与传统检测方法对比。结果多重PCR分别扩增出金黄色葡萄球菌(153 bp)、绿脓杆菌(600 bp)、肺炎克雷伯杆菌(368 bp)和通用(520 bp)的目的条带。多重敏感性为10 pg,特异性检测未从其他细菌中检测出目的条带。应用建立的多重PCR体系检测出不同组合的人工感染标本,从76只粪便检测出绿脓杆菌阳性1例,与传统检测方法结果一致。结论本文建立的多重PCR方法具有特异、灵敏、简便、快速等优点,为实验动物微生物的快速检测提供了可靠的方法。     

多重PCR检测支气管肺泡灌洗液中细菌性病原体的研究

目的评价呼吸道感染患者肺泡灌洗标本进行多重PCR检测的准确性。方法选取2006～2009年本院住院的158例儿童为研究对象,同时选用需要接受纤维支气管镜检查的30例同龄非感染患儿作为对照。所有儿童24h内接受标准的纤维支气管镜介导的支气管肺泡灌洗。用多重PCR检测灌洗液中肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体和肺炎嗜衣原体。并用细菌培养等常规方法对这些患者的肺泡灌洗液进行分析。结果常规细菌学诊断方法显示,肺炎链球菌,流感嗜血杆菌,肺炎支原体,肺炎嗜衣原体在下呼吸道感染病人中分别占14％,21％,3．2％,和0％。而应用肺泡灌洗液多重PCR这种诊断方法,这些病原体在这些病人中分别占了28％,47％,4％和1％,其敏感性分别为87％。90％,100％和0％,特异性分别为81％,64％,100％和99％。在104位检查前服用了抗生素的支气管镜检患者中,肺炎链球菌通过细菌培养来确诊占2．9％,而通过多重PCR则为31％。在对照组中多重PCR鉴别肺炎链球菌的比例为17％．流感嗜血杆菌为40％。结论在下呼吸道感染病人中,支气管肺泡灌洗液结合多重PCR能够有效的用来鉴别肺炎链球菌,流感嗜血杆菌,肺炎支原体,肺炎嗜衣原体,这在已经用抗生素治疗的病人中尤为有效。     

实验动物皮肤病原真菌多重PCR检测方法的建立与初步应用

目的 建立石膏样毛癣菌(Tm)、石膏样小孢子菌(Mg)、犬小孢子菌(Mc)和猴类毛癣菌(Am)的多重PCR检测方法,用于实验动物皮肤病原真菌的快速检测。方法 根据Genbank公布的四种皮肤病原真菌的18S-28S rRNA序列设计特异性引物,通过引物、dNTP、TaqDNA聚合酶浓度及退火温度和时间的优化,建立四种皮肤病原真菌的多重PCR体系。经特异性和敏感性检验后,对15份人工感染真菌大鼠毛和260份实验动物毛发样本进行检测。结果 所建多重PCR方法能够有效区分四种皮肤病原真菌,产生192 bp(Tm)、460 bp(Mg)、290 bp(Mc)和602 bp(As)的目的片段,最低检测限分别为5.9 pg/μL、6.6 pg/μL、9.5 pg/μL和5.1 pg/μL。被检的15份人工感染样本扩增结果准确,260份毛发样本中未检测出四种真菌。结论 所建立的多重PCR方法能够同时对实验动物中的四种皮肤病原真菌进行快速的检测,具有较高的应用价值。     

多重PCR结合毛细管电泳检测儿童呼吸道病原体方法的建立及应用

目的：建立肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae,MP）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.au）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae,KP）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,P.Ae）、阴沟杆菌（Enterobacter cloacae,Ecl）、白色假丝酵母菌（Candida albicans,Cal）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii,Aba）7种儿童呼吸道病原体多重PCR结合毛细管电泳法检测体系。方法：随机收集南京市儿童医院2020年11—12月266例儿童呼吸道病原体样本,针对MP、S.au、KP、P.Ae、Ecl、Cal、Aba保守序列设计特异性引物,设计并优化多重PCR结合毛细管电泳检测体系;将该检测结果与细菌培养以及荧光定量PCR比对,评估该方法的检测性能（灵敏度、特异度）。结果：所设计引物可以特异性扩增出呼吸道病原体;多重PCR结合毛细管电泳检测体系检出敏感性高;与其他呼吸道感染病原体未出现交叉反应,无明显的非特异峰,特异性较好。结论：成功建立一种能够快速筛查7种常见儿童呼吸道病原体的多重PCR结合毛细管电泳的检测方法。     

应用多重PCR检测细菌性阴道炎支原体

目的探讨多重PCR在检测细菌性阴道炎（BV）患者中3种常见支原体的应用价值,为生殖道支原体感染的监测和快速诊断提供理论依据。方法提取泌尿生殖道标本中解脲脲原体（Uu）、生殖支原体（Mg）、人型支原体（Mh）DNA,多重PCR扩增目的基因,电泳检测扩增产物。结果在31份BV标本中检测Uu阳性标本16例,Mg阳性标本4例,Mh13例。其中6例为Uu和Mh感染,1例为Uu和Mg感染。结论本研究初步验证了多重PCR技术能应用于BV标本3种常见支原体的快速检测,可望成为临床诊断与疾病监测的理想方法。     

多重PCR技术及其在病原体检测中的应用

多重PCR(Multiplex Polymerase Chain Reaction,MPCR)是在常规PCR基础上发展起来的新技术,在同一个反应体系中加入一对以上引物,分别扩增不同的模板,得到不同的目的片段。这种方法既保留了常规PCR方法的特异性、敏感性,又减少了操作步骤及试剂用量,可以在同一反应中检测多种致病菌的特异基因。利用一次多重反应,可同时检测、鉴别出多种病原体。不论在致病微生物引起的传染病诊断方面,还是在环境中致病     

多重PCR鉴定伤口中3种致病菌方法的建立

目的应用多重PCR技术,建立一种快速、准确检测伤口中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌等3种常见致病菌的方法。方法根据Gene Bank中3种致病菌的序列分别设计特异性引物,优化该反应体系的同时,对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行测试。结果经过优化的PCR体系可准确地鉴定出3种目的菌,且检测方法特异性强,灵敏度高。结论该方法操作简单,能显著缩短检测时间,具有较理想的应用前景。     

检测肺炎支原体的实时荧光PCR方法的建立

目的 采用Taqman探针技术,组建肺炎支原体荧光PCR基因检测方法.方法 对GenBank登录的肺炎支原体的基因序列进行生物信息学分析.针对16s核糖体蛋白基因的保守区域设计引物和探针,组建实时荧光PCR方法检测.采用流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒进行特异性评价.采用倍数稀释的方法进行灵敏度的评价.对来自南方医院的522份临床咽拭子样本进行检测.结果 用实时荧光PCR方法检测甲型流感病毒(甲型、乙型)、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒均无特异性反应.该方法可以检测出稀释浓度约为103/mL的肺炎支原体样本.对本院的临床样本检出39份.结论 实时荧光PCR检测肺炎支原体具有较高的特异性和灵敏度,可用于肺炎支原体感染的诊断.     

实验犬布氏杆菌的多重PCR检测与分型鉴定

目的建立实验犬及相关生物制品布氏杆菌的多重PCR检测与分型鉴定方法。方法选择布氏杆菌Omp2基因同源性较高的区域设计引物对布氏杆菌进行多重PCR扩增,扩增结果一致的样本进行酶切以区分不同型,同时进行序列测定,以确定该方法的准确性;然后验证该方法的特异性和敏感性。结果成功扩增得到目的条带,并通过酶切区分五种布氏杆菌;PCR产物与布氏杆菌DNA序列同源性达到99%,并验证了该方法的检测结果。实验结果证明该方法特异性较好,灵敏性为1.8×10-7μg/mL。结论成功建立布氏杆菌多重PCR检测与分型鉴定方法,所建立的方法特异性好,灵敏度高。本研究对保证实验犬群的质量,保护饲养人员、实验人员的身体健康具有重要意义。     

快速检测肺炎链球菌recA、ply及16SrRNA基因的多重降落PCR方法建立及应用

目的：建立快速检测肺炎链球菌recA,ply及16SrRNA基因的多重降落PCR方法并应用。方法：设计肺炎链球菌的特异基因recA,ply及其菌属保守序列16SrRNA基因的引物,建立多重降落PCR的反应体系及条件,通过该方法检测13株标准菌株的基因以判定recA、ply、16SrRNA基因的检测特异性;并通过对不同稀释度肺炎链球菌DNA的检测判定该方法的灵敏度。最后,应用多重降落PCR方法检测98份痰标本的肺炎链球菌,并与细胞培养法进行比较。结果：建立的多重降落PCR方法检测肺炎链球菌的特异性达100％,灵敏度达5pg／μL,该方法对98份痰标本中肺炎链球菌的检测结果与细胞培养法一致。结论：成功建立检测肺炎链球菌的多重降落PCR方法,灵敏度高,特异性强,可用于临床标本肺炎链球菌的快速检测。     

巴斯德杆菌属CODEHOP PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立巴斯德杆菌的CODEHOP PCR快速检测方法,为实验动物的呼吸道细菌的控制提供参考。方法应用CODEHOP在线简并引物设计工具,比对Genbank中13株巴斯德杆菌的RNA聚合酶β亚基(rpo B)氨基酸序列设计简并引物。对建立CODEHOP PCR方法用21株参考菌株进行特异性和敏感性评价,并应用于实验动物中的巴斯德杆菌检测。结果简并引物Past F6/PastR5扩增标准菌株的目的片段为200 bp左右。能够区分受试的巴斯德杆菌和主要的实验动物呼吸道病原菌。敏感性为0.2 pg/μL~2 pg/μL。在受试的609只实验动物中呼吸道样品中检测出巴斯德杆菌阳性率为19.1%。样品阳性片段经测序验证,准确率为100%。结论所建立的方法具有良好的特异性和敏感性,可用于动物样品中巴斯德杆菌的检测。     

实验树鼩空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR方法的建立

目的为实验树鼩微生物检测提供一种快速、简便、灵敏,并且特异性强的空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR检测方法。方法根据空肠弯曲菌的Hip O区域、沙门菌的in V区域和志贺菌的ipa H区域设计特异性引物和探针,并进行单病原定量PCR检测验证;后分析多重PCR的灵敏度和特异性,并使用该多重PCR方法检测实验树鼩样品。结果本研究的PCR要素可用于空肠弯曲菌、沙门氏菌及志贺菌等单种菌的实时荧光定量PCR扩增。多重定量PCR扩增出了空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺氏菌标准扩增曲线;该方法的灵敏度为1×103ng/μL;特异性检测未从其他参考菌株中检出阳性。结论该多重定量PCR方法在实验树鼩微生物检测中具有很好的应用和推广前景。     

培养法和PCR法用于实验大、小鼠细菌检测的比较分析

目的 比较培养法和PCR法对实验大、小鼠的细菌检测效果。方法 分别采用传统细菌分离培养结合生化鉴定方法和PCR方法, 对78只SPF级大鼠和422只SPF级小鼠进行检测, 对两种方法的检测结果进行比较分析。结果 78只SPF级大鼠均未检测出阳性。422只SPF级小鼠, 培养法检测阳性率7.11%(30/422), 其中金黄色葡萄球菌10只, 绿脓杆菌22只, 肺炎克雷伯杆菌2只。PCR法检测阳性率7.58%(32/422), 其中金黄色葡萄球菌10只, 绿脓杆菌25只, 肺炎克雷伯杆菌2只。结论 PCR法的敏感性高于培养法, 操作简便、快捷, 适用于实验动物细菌的快速诊断和大规模的质量筛查。     

小鼠多瘤病毒荧光PCR检测方法的建立及其在裸鼹鼠感染情况调查中的应用

目的建立多瘤病毒荧光定量PCR检测方法,并对裸鼹鼠中多瘤病毒感染情况进行调查。方法比较NCBI中小鼠多瘤病毒(Genbank:NC_001515)的核酸序列,选择保守区域设计引物和探针,建立多瘤病毒的荧光定量PCR方法,对方法的敏感性和特异性进行验证。人工感染9只1日龄KM乳鼠,21 d后采集心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、盲肠内容物和血液等组织脏器,用建立的荧光PCR方法进行检测,验证方法在应用中的有效性,最后用该方法检测62份裸鼹鼠的盲肠内容物样本。结果建立的检测方法特异性好,在以多瘤病毒为模板时出现明显的荧光信号,以猴空泡病毒、小鼠K病毒、小鼠微小病毒和大鼠细小病毒H-1株为模板时无荧光信号出现;方法的最低检出限为100 copies/μL;人工感染小鼠的心、肝、脾、肺、肾和盲肠内容物中均检测到多瘤病毒核酸,其中肺组织中含量最高,脑、胸腺和血液中未检出;62份裸鼹鼠的盲肠内容物样本经检测多瘤病毒为阴性。结论建立的多瘤病毒荧光定量PCR方法可有效检测动物组织中的多瘤病毒,对裸鼹鼠自然感染多瘤病毒的调查为实验用裸鼹鼠微生物标准的制定提供了参考。     

水貂阿留申病毒、肠炎病毒与犬瘟热病毒多重PCR检测方法的建立与应用

目的水貂阿留申病、病毒性肠炎与犬瘟热并称影响水貂健康的三大疫病,拟建立一种可同时检测三种病毒的多重PCR检测方法。方法针对三种病毒基因保守区分别设计了3对特异性引物,对貂阿留申病毒(ADV)和水貂肠炎病毒(MEV)的DNA模板和犬瘟热病毒(CDV)的RNA模板进行了多重PCR扩增和扩增条件优化。结果 PCR可同时扩增出601 bp(ADV)、205 bp(MEV)和451 bp(CDV)的特异性目的条带,敏感性试验表明最低核酸检出量为ADV每微升2.67×10~4拷贝、MEV每微升3.02×10~4拷贝和CDV每微升1.72×10~5拷贝。临床样品检测结果表明多重PCR和单一PCR检测结果一致。结论建立的多重PCR检测方法可快速地检测ADV、MEV和CDV单一或混合感染的临床样品。     

基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法的建立与评价

目的建立基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法,应用于实验动物沙门氏菌的检测。方法提取小鼠粪便DNA样本,分别针对16S r DNA区域、23S r DNA区域、16S~23S r DNA IS、23S~5S r DNA IS、gyr B优选区域设计通用引物,对各个引物进行测试分析,优化扩增条件并建库,利用Illumina高通量测序技术检测区分42个样本中的沙门氏菌,评价该方法的特异性和稳定性。结果筛选发现沙门氏菌的菌种分类优选区域为gyr B基因,gyr B基因引物序列为FP5’-AACCACCGCAATCAGACCTT3’,FP5’-AGCCACGAAACCTTCACYA-3’。对引物进行优化,确定最佳扩增条件及样品上样量并正式建库,通过高通量测序和序列分析能检测出42个样品中极微量的沙门氏菌,检测方法稳定,灵敏度高,检测限可达0~102的cfu。结论本实验利用高通量测序技术,建立了一套完整检测实验动物沙门氏菌的生物体系,能检测出实验动物体内极微量的沙门氏菌,检测方法稳定性好,灵敏度高,可沿用至其他种类病原微生物的检测。     

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的分布与耐药性分析

目的 了解耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）的分布特点及其耐药性,为指导临床合理使用抗菌药物提供依据。方法 收集2014年1月至2017年12月临床分离的CRKP菌株,采用自动化仪器法和纸片扩散法（K-B法）对上述菌株进行药物敏感性试验,药物敏感性结果严格按照美国临床和实验室标准化协会（CLSI）和美国食品药品管理局（FDA）标准判定。采用WHONET软件和SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。结果 共收集临床分离CRKP菌株403株,主要标本来源为痰/支气管肺泡灌洗液（169株,占41.9%）。CRKP首次分离标本来源不同,后续CRKP血流感染的发生率也不同,差异有统计学意义（P<0.05）。CRKP来源科室位列前3位的分别为烧伤重症监护病房（30.0%,121/403）、消化科（8.4%,34/403）和急诊重症监护病房（7.2%,29/403）。药物敏感性试验结果显示CRKP除对替加环素和磷霉素耐药率较低外,对其余抗生素的耐药率均>60.0%。结论 CRKP对多数常用抗生素呈现高度耐药。应加强对CRKP的耐药性监测,尤其是烧伤重症监护病房等重点科室,并采取有效措施预防和控制CRKP的传播。     

单管多重PCR鉴定HPV基因型方法的建立和临床评价

目的建立单管多重PCR鉴定低危和高危乳突瘤病毒（HPV）的方法以及用临床标本对该方法进行评价。方法设计HPV基因型特异的引物,在一个PCR反应管中PCR扩增来自上皮细胞提取的DNA,然后用毛细管电泳对PCR产物进行分离,根据扩增产物的大小确定相应的HPV基因型。对不同病理期的1094份临床宫颈标本和对照进行了分析。结果一共鉴定了16个HPV基因型,即HPV16,58,52,51,56,31,18,39,66,59,6,33,30,35,45和11。该方法具有高度的灵敏性和可重复性。同对照相比,未知重要意义的非典型鳞状细胞（ASCUS）、低级别表皮内损伤（LSILs）、高级别的表皮内损伤（HSILs）标本HPV检出阳性率分别为60．5％、77．1％和82．2％,而对照为14．4％,其中在HSILs标本HPV16和HPV58检出率最高,并与细胞恶性程度呈正相关。结论单管多重PCR鉴定HPV的方法是稳定的,且可以用于HPV的流行病学的调查。