甲状旁腺激素通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路诱导人近曲小管上皮细胞结缔组织生长因子表达

目的 观察甲状旁腺激素（PTH）对人肾小管上皮细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）的影响，并探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号途径在此过程中的作用。 方法 采用实时定量PCR、Western印迹、报告基因等技术，观察PTH诱导人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞CTGF表达的情况。使用信号通路抑制剂PD98059、U0126阻断信号通路以明确PTH发挥作用的信号途径。 结果 正常HK-2细胞有基础水平的CTGF mRNA和蛋白表达，PTH刺激后其表达水平显著增加。10-10 mol/L PTH作用12 h后，荧光素酶活性较对照组明显升高[（1.8884±0.0780）比（0.9891±0.0300） A，P ＜ 0.01]。正常HK-2细胞有少量p-ERK1/2表达，PTH刺激后p-ERK1/2表达明显升高，以10-10 mol/L PTH作用30 min时效应最强；MAPK通路抑制剂PD98059、U0126作用后，CTGF mRNA、蛋白、基因启动子表达均明显下降。 结论 PTH可诱导HK-2细胞CTGF表达，其作用可能是通过MAPK信号通路来实现的。     

金雀异黄素通过抑制NF-κB信号通路延缓甲状旁腺素诱导的肾间质纤维化

目的 探讨金雀异黄素（Gen）对甲状旁腺素（PTH）引起的人近曲小管上皮细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）的调控作用。 方法 应用实时定量PCR、Western印迹、报告基因等技术,观察Gen对PTH诱导人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞CTGF表达的影响。采用凝胶迁移实验（EMSA）技术检测PTH刺激HK-2细胞后NF-κB的DNA结合能力;使用信号通路抑制剂阻断信号通路以明确Gen发挥作用的机制。 结果 HK-2细胞有基础量的CTGF mRNA和蛋白表达,PTH刺激后其表达量显著增加（均P ＜ 0.05）,Gen能下调PTH诱导的HK-2细胞CTGF表达。10-10 mol/L PTH作用12 h后,荧光素酶活性较对照组显著升高（1.89±0.08比0.99±0.03,P ＜ 0.01）。正常情况下,胞核内NF-κB处于无活性状态,PTH刺激HK-2细胞后NF-κB的DNA结合能力明显增强,10-10 mol/L PTH作用30 min时NF-κB活性达到高峰。NF-κB通路抑制剂PDTC预处理HK-2细胞后,PTH诱导细胞CTGF表达较PTH组明显下降（P ＜ 0.01）。Gen抑制PTH所致的HK-2细胞NF-κB活化。 结论 Gen通过阻断NF-κB信号通路抑制PTH诱导的HK-2细胞CTGF表达从而延缓肾间质纤维化。     

甲状旁腺激素通过NF-κB诱导人近曲小管上皮细胞结缔组织生长因子表达

目的 观察甲状旁腺激素（PTH）对人肾小管上皮细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）的影响,并探讨其信号传导通路及NF-κB在此过程中的作用。 方法 应用荧光实时定量PCR、Western印迹技术,观察PTH诱导人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞CTGF mRNA和蛋白合成情况;从转录水平探讨PTH对CTGF基因启动子活性的调控作用。采用凝胶迁移实验（EMSA）技术检测PTH刺激HK-2细胞后NF-κB的DNA结合能力;NF-κB抑制剂PDTC阻断信号通路以明确PTH发挥作用的信号途径。 结果 HK-2细胞有基础量的CTGF mRNA表达和蛋白合成,PTH刺激后其表达及合成量显著增加。PTH最佳刺激浓度是10－10 mol/L,最佳刺激时间是72 h。10－10 mol/L PTH作用HK-2细胞12 h后,荧光素酶活性显著高于未刺激组（1.8884±0.0780比0.9891±0.0300,P ＜ 0.01）。正常情况下,胞核内NF-κB处于无活性状态,PTH刺激HK-2细胞后,NF-κB的DNA结合能力明显增强,10－10 mol/L PTH作用30 min时NF-κB活性达到高峰;而后随PTH浓度和作用时间增加,NF-κB活性有所下降。PDTC预处理HK-2细胞后,PTH诱导细胞CTGF mRNA表达显著低于PTH组（0.33±0.05比3.84±0.68,P ＜ 0.05）,CTGF蛋白表达亦显著低于PTH组（0.56±0.23比3.76±0.54,P ＜ 0.01）;PDTC亦显著抑制CTGF基因启动子活性,其萤火虫荧光素酶相对活性显著低于PTH组（1.1942±0.0107比1.8884±0.0780,P ＜ 0.01）。 结论 PTH可诱导HK-2细胞高表达CTGF,且在一定范围内呈时间、剂量依赖,其作用可能是通过NF-κB信号通路来实现的。     

丝裂原活化蛋白激酶类和蛋白激酶C在转化生长因子β1诱导肾小管细胞结缔组织生长因子表达中的作用

目的了解转化生长因子β1（TGF-β1）诱导肾小管细胞结缔组织生长因子（CTGF）表达的机制，特别是蛋白激酶C（PKC）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）在CTGF基因表达中的作用及其对Smad磷酸化的影响。方法分别应用PKC抑制剂G06850以及MAPK的3个组成成分ERK、JNK和p38MAPK的抑制剂PD98059、U0126、SP600125和SB203580阻断相应通路，观察其对TGF．131诱导的CTGF表达以及Smad2／Smad3磷酸化的影响。结果TGF-β1（5μg／L）以时间依赖方式诱导HK-2细胞中Smad2／Smad3的磷酸化，从基础值0．87±0．09上升至2h时高峰2．350±0.11。PKC抑制剂G06850（5μmol／L）和ERK抑制剂PD98059（10μmol／L）、U0126（10μmol／L）可部分抑制TGF-β1诱导的CTGF表达，而p38MAPK抑制剂SB203580（20μmol／L）和JNK抑制剂SP600125（10μmol／L）对TGF-β1诱导的CTGF的表达无影响。PKC抑制剂G06850（5μmol／L）可减少TGF-β1诱导的Smad2／Smad3磷酸化，而ERK抑制剂PD98059（10μmol／L）和U0126（10μmol／L）对Smad2／Smad3的磷酸化没有影响。结论在肾小管上皮细胞中，TGF-β1诱导CTGF的表达需要PKC和Ras／MEK／ERK的参与。PKC以Smad依赖的方式参与肾小管上皮细胞中TGF-β1诱导的CTGF的表达，而Ras／MEK／ERK对CTGF表达的调节不依赖于Smads。     

甲状旁腺激素对人近曲小管上皮细胞转分化及分泌结缔组织生长因子的影响

目的 探讨甲状旁腺激素（PTH）对人近曲小管上皮细胞系HK-2细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）及细胞转分化的影响。 方法 应用实时定量PCR和Western印迹观察PTH诱导HK-2细胞CTGF mRNA和蛋白表达情况，从转录水平探讨PTH对CTGF基因启动子活性的调控作用。应用免疫荧光技术检测PTH作用下HK-2细胞中α平滑肌肌动蛋白 （α-SMA）的表达。 结果 HK-2细胞有基础水平的CTGF mRNA和蛋白表达，PTH刺激后其表达量显著增加。PTH最佳刺激浓度是10－10 mol/L，最佳刺激时间是72 h。10－10 mol/L PTH干预HK-2细胞12 h后，荧光素酶活性较对照组显著升高（1.888±0.078比0.989±0.030，P ＜ 0.01）；光镜下可见细胞由立方形铺路石样转变为梭形，随作用时间延长转分化现象更显著。PTH刺激HK-2细胞12 h后，免疫荧光检测可见细胞质中有α-SMA表达；PTH刺激24 h后，α-SMA表达明显增多，与CTGF mRNA和蛋白表达的时间效应一致。 结论 PTH可上调HK-2细胞CTGF表达，并具有促进HK-2细胞转分化的作用。     

ERK1/2信号通路在甲状旁腺激素致人近曲小管上皮细胞分泌纤溶酶原激活物抑制剂1中的作用

目的 从体外观察ERK信号通路在甲状旁腺激素（PTH）致人近曲小管上皮细胞（HK-2）合成纤溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）中的作用。 方法 以HK-2细胞株为研究对象,用不同浓度PTH（10-8、10-9、10-10、10-11、10-12 mol/L）作用细胞48 h,以及10-10 mol/L PTH作用细胞不同时间（12、24、36、48、72 h）,分别用RT-PCR法检测PAI-1 mRNA表达,Western印迹法检测PAI-1蛋白表达。以10-10 mol/L PTH作用细胞48 h,分别观察细胞ERK1/2抑制剂预处理前后磷酸化（p）ERK1/2、PAI-1mRNA及蛋白的变化情况。 结果 10-12 mol/L PTH可促进细胞在基因及蛋白水平合成PAI-1,随着PTH浓度逐渐上升,PAI-1mRNA及蛋白浓度均相应增加,以10-10 mol/L PTH组刺激作用最显著,分别为对照组的4.01倍和3.81倍（均P < 0.01）。但随着PTH浓度进一步增加,PAI-1mRNA及蛋白浓度却随之下降。10-10 mol/L PTH作用细胞,12 h时有少量PAI-1表达,72 h时达峰值,并呈时间依赖性,分别为0 h组的4.06倍和4.03倍（均P < 0.01）。10-10 mol/L PTH作用细胞48 h,有大量的p-ERK1/2合成（P < 0.01）,经ERK1/2抑制剂预处理后,PAI-1及ERK均显著下降（均P < 0.01）,但仍高于对照组（均P < 0.05）。 结论 ERK信号通路部分参与PTH致HK-2细胞合成PAI-1的作用。     

结缔组织生长因子诱导人近端肾小管上皮细胞整合素连接激酶的表达及与激酶信号途径的关系

目的探讨结缔组织生长因子（CTGF）对人近端肾小管上皮细胞系HK-2整合素连接激酶（ILK）表达的影响，以及丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶（P13-K）途径对该因子表达的影响。方法用不同浓度的CTGF作用HK-2细胞24h及50μg／L的CTGF作用HK-2细胞不同时间，以实时PCR和Western印迹方法检测ILKmRNA及蛋白的表达。用信号通路特异性抑制剂预处理，观察其对CTGF的干预作用。结果CTGF呈时间及浓度依赖性诱导人近端肾小管上皮细胞ILK蛋白表达。5、20、50μg／L的CTGF可使ILK表达量分别增加为对照组的3．284、5．103、5．638倍。50μg／LCTGF使ILK的表达在6h开始升高，高峰在48h（为对照组5．740倍），MEK抑制剂PD98059和P13．K抑制剂LY294002显著降低CTGF诱导的HK-2细胞ILK基因和蛋白的表达（P均〈0．05）。p38MAPK抑制剂SB203580对CTGF诱导的ILK表达无显著影响。结论CTGF能诱导HK-2细胞ILK蛋白的表达，该作用可能与ERK1／2和P13-K信号途径激活有关。     

基于ERK/mTOR信号通路探讨六味地黄丸对氧化应激状态下成骨细胞自噬的影响

目的 从ERK/mTOR信号通路观察六味地黄丸对氧化应激状态下MC3T3-E1细胞自噬的影响,探讨其治疗绝经后骨质疏松症的作用机制。方法 用过氧化氢（H2O2）模拟氧化应激状态,六味地黄丸（LWDH）含药血清干预MC3T3-E1细胞,将细胞分为Model组（H2O2干预）、Blank组（空白血清）、LWDH组（LWDH含药血清）、Rap组（mTOR通路抑制剂）、U0126组（ERK通路抑制剂）、Rap+LWDH组（mTOR通路抑制剂、LWDH含药血清）、U0126+LWDH组（ERK通路抑制剂、LWDH含药血清）;以不做干预的Control组作为对照。通过细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测细胞ROS水平;检测自噬蛋白LC3B及ERK/mTOR信号通路相关蛋白mTOR、p-mTOR、ERK1/2和p-ERK1/2的表达。结果 ROS结果显示,与Model组相比,LWDH组、Rap组、U0126等各组细胞的ROS水平皆降低（P＜0.05）。Western blot结果显示,与Model组相比,LWDH组、Rap组、LWDH+Rap组蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ增高（P＜0.05）;与Model组相比,LWDH组、Rap组与Rap+LWDH组的p-mTOR蛋白表达下调（P＜0.05）,LWDH组、U0126组的p-ERK1/2蛋白表达下调（P＜0.05）。结论 六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症的机制可能与抑制ERK/mTOR信号通路诱导氧化应激状态下成骨细胞自噬相关。     

TLR4、TBK/IRF3信号通路介导肾小管上皮细胞与单核细胞相互作用

目的:探讨单核细胞与肾小管上皮细胞相互作用的分子机制。方法:体外建立单核细胞(U937)与肾小管上皮细胞(HK-2)共培养系统,观察HK-2细胞对U937细胞Toll样受体4(toll-like receptors 4,TLR4)及TANK结合蛋白激酶(TBK)/干扰素调节因子3(IRF3)信号通路的影响;观察阻断TBK/IRF3信号通路对单核细胞分化的影响。结果:HK-2细胞促进U937细胞TLR4及TBK/IRF3信号通路蛋白及mRNA的表达(P0.05);阻断TBK/IRF3信号通路抑制HK-2细胞诱导U937细胞发生M1型转化(P0.05)。结论:TLR4分子介导HK-2细胞与U937细胞相互作用,激活TBK/IRF3信号通路,导致U937细胞发生M1型转化,进一步诱导炎症因子产生,促进肾脏纤维化。     

ERK/MAPK通路参与肝癌产生多药耐药的胞内信号传导

目的探讨微环境诱导肝癌产生多药耐药的胞内信号传导途径。方法分别使HepG2细胞在缺氧、低糖环境下生长或稳定整合HBX基因,运用Western蛋白印迹法检测这些细胞内ERK／MAPK的活性。用ERK／MAPK特异性阻断剂U0126处理这些细胞后,用Western蛋白印迹法检测缺氧诱导因子-1α（HIF—1α）和多药耐药相关蛋白的表达变化,逆转录聚合酶链反应和免疫细胞化学技术分别检测HIF-1α在mRNA水平表达量和部位的改变。结果不同环境下生长的HepG2细胞中,磷酸肜非磷酸化ERK／MAPK比例均有不同程度的增高。用U0126处理12h后,这些细胞中HIF-1α和多药耐药相关蛋白的表达下降,且HIF-1α表达由胞核向胞质转位,其mRNA水平无显著变化。结论ERK／MAPK信号通路是微环境诱导肝癌产生多药耐药的重要胞内信号传导途径。     

转化生长因子β1对肾小管上皮细胞中结缔组织生长因子基因启动子活性的影响

目的探讨转化生长因子[β1（TCF-β1）对人近端肾小管上皮细胞系HK-2中结缔组织生长因子（CTGF）基因启动子活性的调控作用，以及丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）途径对该生长因子作用的影响。方法构建含有人类CTGF基因启动子的报告基因pCTGF-luc，将其瞬时转染HK-2细胞。通过检测荧光素酶的活性观察TGF-β1和MAPK途径抑制剂对CTGF基因启动子活性的影响。结果TGF-β1以剂量和时间依赖方式上调HK-2中CTGF基因启动子的活性。最佳刺激浓度是5ng／ml，最佳刺激时间为12h，荧光素酶相对活性分别为对照组的1．82倍和2．10倍（P〈0．05）。应用PD98059、SB203580和SP600125分别特异性抑制MAPK途径的胞外信号调节蛋白激酶（ERK）、蛋白激酶p38（p38MAPK）和c-Jun-氨基末端激酶（JNK）通路，对TGF-β1上调CTGF启动子活性的作用有不同影响。PD98059显著增加HK-2中pCTGF-luc的基础活性．并在一定浓度范围内（0．5～10μmol／L）促进TGF-β1的上调作用。SB203580对pCTGF-luc基础活性无影响，但以剂量依赖方式显著抑制TGF-β1的激活效应。而SP600125对基础状态和TGF-β1刺激下CTGF基因启动子活性无影响。结论TGF-β1以剂量和时间依赖方式上调HK-2中CTGF基因启动子活性，在转录水平调节CTGF表达。MAPK途径的ERK和p38MAPK通路可影响TGF-β1的这一调控作用。     

Role of β-catenin signaling pathway in the epithelial to mesenchymal transition induced by parathyroid hormone in renal tubular epithelial cells

Objective To investigate the effect of parathyroid hormone (PTH) on the epithelial to mesenchymal transition (EMT) in human renal proximal tubular epithelial cells (HK-2 cells), and determine the role of β-catenin signaling pathway. Method The expression of α-smooth muscle actin (α-SMA), E-cadherin and β-catenin in HK-2 cells was measured by real-time PCR, Western blotting and immunofluorescence technique. The signaling pathway by which PTH activated EMT in HK-2 cells was identified by using synthetic β-catenin siRNA. Results Parathyroid hormone (10-10 mol/L) increased α-SMA expression and decreased E-cadherin expression in HK-2 cells (P＜0.01, respectively). Untreated cells showed the expression of E-cadherin, whereas α-SMA staining was noticeably increased in cells treated with PTH. β-catenin activity was significantly increased after exposed to PTH. Theα-SMA expression was decreased strongly and E-cadherin expression was increased after β-catenin siRNA transfection (all P＜0.05). Conclusion PTH significantly induces epithelial to mesenchymal transition in HK-2 cells throughβ-catenin signaling pathway.     

晚期糖基化终产物诱导人肾小管上皮细胞表达结缔组织生长因子

目的观察晚期糖基化终产物（AGE）修饰的牛血清白蛋白（BSA）对体外培养的人近端肾小管上皮细胞株（HK-2细胞）表达结缔组织生长因子（CTGF）的影响，并探讨可能的作用途径。方法将HK-2细胞在体外与不同浓度的AGE-BSA和BSA共同培养。间接免疫荧光法检测糖基化终产物受体（RAGE）。免疫印迹法观察HK-2细胞表达的CTGF蛋白质，ELISA和免疫印迹法检测TGF-β1的合成和分泌。结果在HK-2细胞的胞膜和胞质存在RAGE的表达。AGE-BSA以时间和剂量依赖方式上调HK-2细胞CTGF的表达，8、24、48及72h组分别为0h组的117％、138％、257％及339％：20、50及100mg／L组分别为0mg／L组的186％、240％及287％。在一定的剂量和时间范围内，AGE—BSA能够诱导TGF-β1蛋白质的表达和分泌。抗RAGE和抗TGF-β1的单克隆抗体能够部分抑制AGE-BSA诱导的CTGF蛋白质表达。结论人肾小管上皮细胞表面存在RAGE的表达。AGE—BSA可能部分地通过RAGE介导TGF-β1表达上调。诱导HK-2细胞CTGF表达。