实验室条件下人角质形成细胞的培养技术

背景：随着角质形成细胞体外培养技术的建立和发展，皮肤不再被认为是单纯的生理屏障，其在机体免疫和内分泌等方面尤为重要。目的：探讨实验室条件下人体角质形成细胞的培养技术，为角质形成细胞的多方面应用提供可靠的细胞来源。设计：开放性实验。单位：解放军第四军医大学西京医院临床免疫科和皮肤科。材料：实验于2003-03／2005-03在解放军第四军医大学西京医院临床免疫科实验室完成。选取同年4月西京医院泌尿外科门诊收治的1例6岁正常男性术后的包皮为角质形成细胞的来源。方法：①对表皮细胞分离过程采取两步消化法：首先运用离散酶对全层皮肤进行低温消化，将包皮皮片浸入质量浓度为2．5g/L的Dispase酶中，4℃过夜，次日分离表皮；第二步采用胰蛋白酶和乙二氨基四乙酸的混合液进行消化。②采用改良的无血清培养技术进行人体角质形成细胞的培养，培养基为人角质形成细胞无血清培养基＋2．5mg/L牛垂体浸出液＋5μg／L表皮生长因子＋438mg／L谷氨酰胺，其中谷氨酰胺能促进角质形成细胞的生长。③将处于对数生长期的细胞进行人角质形成细胞的冻存和复苏，加入无血清培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为5&;#215;105／mL接种入75cm^2培养瓶中传代培养。置于显微镜和透射电镜下进行细胞形态观察。主要观察指标：①原代和传代细胞的生长情况。②不同代的角质形成细胞冻存和复苏情况。③角质形成细胞形态学观察结果。结果：①原代和传代细胞的生长情况：初期细胞悬于培养液中，逐渐细胞贴附于培养皿底部。一般在6～24h内开始贴壁，细胞以圆形为主，随着时间的延长伸展成椭圆型。3d左右可见数个角质形成细胞形成的小集落或小集簇，四周可见卫星样表皮细胞增殖，多数细胞为多角形，细胞的均质性和透明度加强。5d左右细胞融合范围可达70％，9d左右细胞融合达90％，11d左右细胞完全融合形成细胞膜片。角质形成细胞可在体外稳定培养2～3个月，细胞形态和生长速度无明显改变。②不同代的角质形成细胞冻存和复苏情况：将不同代的角质形成细胞分别冻存于液氮罐中，3个月后进行复苏，发现角质形成细胞的形态和生长速度无明显改变。③角质形成细胞形态学观察结果：显微镜下细胞呈典型上皮样特征，高核浆比例，细胞紧密排列，轮廓清楚折光性好。透射电镜下培养的表皮角质形成细胞胞浆内有大量束状张力丝和张力原纤维，可见线粒体和粗面内质网，胞质周边有短的突起，细胞间有桥粒相连等角化细胞所具有的特点。结论：培养的角质形成细胞在多次传代后仍能够保持正常的形态特征，提示改良的培养角质形成细胞的技术可为实验和临床提供可靠丰富的角质形成细胞来源。     

猪复合人工皮肤组织工程学研究:小型香猪角质形成细胞库的构建

目的:小型香猪与人的皮肤组织结构相似,是研究人皮肤良好的动物模型,构建贵州小型香猪角质形成细胞库,为构建猪组织工程皮肤做好准备工作。方法:采用分离酶和胰蛋白酶联合消化法分离小型香猪角质形成细胞,角质形成细胞培养基培养。结果:小型香猪角质形成细胞呈“铺路石”样生长,可连续传代,实验结束时成功地将角质形成细胞传至第13代。传代及冻存、复苏后的角质形成细胞保持了与原代细胞相同的生长状态,并具有继续传代能力。结论:作者通过细胞培养和组织工程学的方法,建立了小型香猪角质形成细胞库。     

人外根鞘细胞体外培养及其增殖或抑制情况下米诺地尔浓度的选择

目的:观察钾通道开放剂米诺地尔在不同浓度下对体外培养人外根鞘细胞增殖活性的影响。方法:实验于2005-04/11在解放军第四军医大学西京医院烧伤实验室完成。①实验材料:所有毛囊标本均来自解放军第四军医大学西京医院美容整形术后,供体为健康成年男性,年龄28～49岁,局部头皮无秃发、感染及其他皮肤疾病,均对本实验知情同意。以同一供体的毛囊标本为一个批次,至少取3批以上标本进行培养。米诺地尔(Sigma公司,美国,批号M20001001)。②实验方法:将头皮剪成0.3～0.5cm宽的皮条,再将真皮层剪去少许,消毒后以Dispase酶消化过夜,16～18h后揭去头皮表皮,拔出毛囊,使用无血清DMEM培养基清洗分离的毛囊。将毛囊置于胰酶 乙二胺四乙酸中消化8min,血清中止消化后离心,再加无血清DMEM培养基洗涤,然后置于预先铺Ⅰ型胶原作基质的角质形成细胞无血清培养基中培养,至外根鞘细胞长出并接近融合时按1∶传代。电子天平称取米诺地尔21mg,加入角质形成细胞无血清培养基20mL溶解,用稀释法分别配制成30,0.01,0.05,0.1,0.5,1.0mmol/L6个梯度浓度。③实验评估:取第2代外根鞘细胞,胰酶消化后计数,用相应培养基稀释成2×107L-1的细胞悬液,接种于96孔板。1d后细胞贴壁生长,分别换用含有0,0.01,0.05,0.1,0.5,1.0mmol/L的米诺地尔培养基,第4天加入四氮噻唑蓝在酶联免疫检测仪上检测吸光度值。结果:0,0.01,0.05,0.1,0.5,1.0mmol/L米诺地尔吸光度值分别为0.501±0.019,0.774±0.038,0.819±0.040,0.418±0.040,0.329±0.026,0.220±0.031。结论:①角质形成细胞无血清培养基有助于人外根鞘细胞的生长和传代,是较合适的培养基。②0.01～0.05mmol/L米诺地尔能够促进外根鞘细胞的增殖,而0.1mmol/L以上浓度反而抑制其生长。     

猪复合人工皮肤组织工程学研究：小型香猪角质形成细胞库的构建

目的：小型香猪与人的皮肤组织结构相似，是研究人皮肤良好的动物模型，构建贵州小型香猪角质形成细胞库，为构建猪组织工程皮肤做好准备工作。方法：采用分离酶和胰蛋白酶联合消化法分离小型香猪角质形成细胞，角质形成细胞培养基培养。结果：小型香猪角质形成细胞呈“铺路石”样生长，可连续传代，实验结束时成功地将角质形成细胞传至第13代。传代及冻存、复苏后的角质形成细胞保持了与原代细胞相同的生长状态，并具有继续传代能力。结论：作通过细胞培养和组织工程学的方法，建立了小型香猪角质形成细胞库。     

人脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性

背景:脂肪来源间充质干细胞取材于吸脂手术所获得的脂肪抽吸物,可反复取材,原料来源充足。目的:建立一种体外分离培养人脂肪来源间充质干细胞的方法,并分析其生物学特性。方法:采用胶原酶消化法分离获取人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态;观察分析传代第3,7,10代细胞生长曲线;采用流式细胞仪检测传代第5代细胞表面标志表达。取传代第4代细胞行体外成骨细胞诱导和成脂诱导,采用碱性磷酸酶染色及油红O染色鉴定。冻存传代细胞,分别于2,6个月后复苏,锥虫蓝染色计数复苏后细胞存活率。结果与结论:原代细胞3d贴壁,6d后开始快速增长并形成集落,11d左右达80%~90%融合,多呈纤维样;传代后细胞维持纤维样形态。传代细胞潜伏期24~48h,对数增殖期三四天,对数增殖期后第五六天进入平台期。间充质干细胞表面CD34、CD14、HLA-DR呈阴性表达,CD44、CD105、CD13呈阳性表达,HLA-ABC呈弱阳性表达。具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力,冻存复苏后细胞存活率达90%以上,且与未冻存传代细胞具有相同的生长特性。     

胰酶消化后新生鼠成肌细胞生长方式与规律以及模拟转基因电穿刺激对冻存和复苏细胞的损害

目的:采用原代培养技术进行大鼠原代细胞的培养与增殖,并模拟基因转染中的电穿刺激,探讨大鼠成肌细胞在基因转染技术中可能的应用前景。方法:实验于2000-04/10在四川大学华西医院病理实验室完成。①选取SD新生鼠10只,消毒后切开皮肤,分离大腿肌肉,高浓度磷酸盐缓冲液浸泡,5min后剪碎组织块至1mm3以下,加入胰酶使用液,37℃水浴消化,胎牛血清终止消化过程,弃上清。再加入生长培养基重悬细胞,置于CO2孵箱中进行接种。②弃去培养基,重新加入等量生长培养基,3～5d更换1次。显微镜下细胞若出现间隙或变圆即中止消化。细胞计数后按所需密度接种于培养瓶,1∶2或1∶3传代。③细胞的冻存与复苏:冻存液的配制比为二甲基亚砜:胎牛血清:Dulbecco改良的Eagle培养基=1∶4∶5。消化细胞后离心去上清,将沉淀细胞移至冻存管内,加入冻存液,-80℃过夜,第2天取出后先行液氮保存,后迅速投入37℃水浴中振荡,使其1min内完全溶解。收获进入对数生长期的细胞,1.5×106个/次,加入一次性电转杯内。电压0.3KV,电场强度0.5KV/cm,电容950μF,电阻250Ω条件下电击24ms。结果:①胰酶消化后新生鼠成肌细胞的生长方式:成肌细胞呈圆形,悬浮于培养液中,大约两三天开始贴壁生长,五六天后细胞几乎全部贴壁。②新生鼠成肌细胞的生长规律:胰酶消化五六天后,成肌细胞进入对数生长期,增殖明显加快,细胞间隙变窄,呈极性生长现象,数量可达1×106个/mL。传代培养可至20代以上,生长速度明显减缓。③模拟转基因电穿孔条件下对冻存和复苏细胞的损害:电穿孔后出现大量细胞碎片,约有一半左右细胞在一两天内死亡,10～14d后残留细胞开始增殖,贴壁生长。结论:以原代培养技术培养、冻存成肌细胞并模拟电穿孔刺激,大鼠成肌细胞的培养效率高、细胞胞膜稳定且存活周期长,提示成肌细胞是一种较理想的基因转染包装细胞。     

人脑神经干细胞对不同储存方式及分离培养和诱导分化条件的要求

背景近年来发现神经干细胞可于体外增殖并分化为神经细胞,是用来修复替代损伤神经组织的较为理想的来源,但是神经干细胞的培养中如何提高它的增殖能力,诱导分化成需要的表现型,尚处于研究探讨阶段.目的探讨细胞冻存和非冻存方法分离培养人脑神经干细胞及诱导其向成熟神经细胞分化的培养条件.设计以细胞为观察对象,单一样本研究.单位江西医学院泌尿外科研究所,江西医学院第二附属医院神经外科.材料实验于2003-12/2004-06在江西医学院泌尿外科研究所完成.取16周龄新鲜人胚脑组织.方法用胰蛋白酶消化法从人胚脑中分离单个细胞,细胞冻存1个月后复苏或/和新鲜细胞用无血清培养基进行体外培养,碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子刺激细胞生长,用血清诱导其分化;采用免疫荧光细胞化学染色方法检测培养的细胞神经巢蛋白抗原和分化后成熟神经细胞抗原神经元特异性烯醇化酶的表达.观察碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子及血清对分离培养的人脑神经干细胞增殖与分化的影响.主要观察指标①冻存与新鲜细胞后续培养的生长状况.②细胞形态变化.③神经干细胞标志物神经巢蛋白及成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶的鉴定.结果①从胚龄16周的新鲜人胚脑中成功分离出神经干细胞.人胚脑原代细胞为圆形亮球状,培养3d后可见细胞开始聚集成神经球,部分呈悬浮生长,2周后神经球增大,部分细胞增大数倍,具有极强折光性,可见分裂增殖.经传代后细胞仍保持原有特征,细胞形态不变.克隆细胞在有血清培养基中培养,24 h后可见大部分细胞贴壁生长,细胞从神经球游出分散,形态不规则;48 h后多数细胞分化为大量形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞,突起相互交织成网.②分离出的神经干细胞在体外培养条件下传代培养,并表达神经于细胞标志巢蛋白;含血清培养基培养48h分化后的细胞主要表达成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶.③冻存复苏的细胞95%以上为活细胞,与新鲜细胞比较,细胞生长状况无明显差别.结论用无血清培养条件下结合碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的作用,使干细胞体外得到了分离培养、增殖和纯化,证实其方法可行,同时冻存和新鲜细胞的比较,说明可用冻存方法保存人胚脑细胞,复苏后使用.     

人脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性

背景：脂肪来源间充质干细胞取材于吸脂手术所获得的脂肪抽吸物,可反复取材,原料来源充足.目的：建立一种体外分离培养人脂肪来源间充质干细胞的方法,并分析其生物学特性.方法：采用胶原酶消化法分离获取人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态;观察分析传代第3,7,10 代细胞生长曲线;采用流式细胞仪检测传代第5 代细胞表面标志表达.取传代第4代细胞行体外成骨细胞诱导和成脂诱导,采用碱性磷酸酶染色及油红O染色鉴定.冻存传代细胞,分别于 2,6 个月后复苏,锥虫蓝染色计数复苏后细胞存活率.结果与结论：原代细胞3 d 贴壁,6 d 后开始快速增长并形成集落,11 d左右达80%~90%融合,多呈纤维样;传代后细胞维持纤维样形态.传代细胞潜伏期24~48 h,对数增殖期三四天,对数增殖期后第五六天进入平台期.间充质干细胞表面CD34、CD14、HLA-DR 呈阴性表达,CD44、CD105、CD13呈阳性表达,HLA-ABC呈弱阳性表达.具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力,冻存复苏后细胞存活率达 90% 以上,且与未冻存传代细胞具有相同的生长特性.     

用于包装复制缺陷性腺病毒的低代次293细胞的培养

目的:建立体外培养低代次293细胞的方法.方法:细胞复苏,将冻存的低代次293细胞于37℃水浴中快速融解,移入75 cm2细胞培养瓶中,加入10 mL低代次293细胞培养基,6～8 h细胞贴壁后更换培养基.细胞传代,吸出培养基,用1×柠檬酸盐细胞消化液洗2遍,留取0.5 mL 37℃消化5～10 min,待细胞脱壁后加入3 mL培养基,轻轻吹匀以1:2比率传代培养.细胞冻存,以1×柠檬酸盐细胞消化液消化5～10 min,细胞脱壁后加入5 mL细胞培养基中和消化液,离心收集细胞,以1 mL的细胞冻存液(90% FBS+10% DMSO)重悬、冻存.结果:细胞传代后8h细胞完全贴壁;以腺病毒感染质粒感染293细胞14 d后可观察到腺病毒空斑形成.结论:该方法操作简便,对细胞损伤小且保持细胞生物学特性不变.     

人脑神经干细胞对不同储存方式及分离培养和诱导分化条件的要求

背景：近年来发现神经干细胞可于体外增殖并分化为神经细胞，是用来修复替代损伤神经组织的较为理想的来源，但是神经干细胞的培养中如何提高它的增殖能力，诱导分化成需要的表现型，尚处于研究探讨阶段。目的：探讨细胞冻存和非冻存方法分离培养人脑神经干细胞及诱导其向成熟神经细胞分化的培养条件。设计：以细胞为观察对象，单一样本研究。单位：江西医学院泌尿外科研究所，江西医学院第二附属医院神经外科。材料：实验于2003-12／2004-06在江西医学院泌尿外科研究所完成。取16周龄新鲜人胚脑组织。方法：用胰蛋白酶消化法从人胚脑中分离单个细胞，细胞冻存1个月后复苏或／和新鲜细胞用无血清培养基进行体外培养，碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子刺激细胞生长，用血清诱导其分化；采用免疫荧光细胞化学染色方法检测培养的细胞神经巢蛋白抗原和分化后成熟神经细胞抗原神经元特异性烯醇化酶的表达。观察碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子及血清对分离培养的人脑神经干细胞增殖与分化的影响。主要观察指标：①冻存与新鲜细胞后续培养的生长状况。②细胞形态变化。③神经干细胞标志物神经巢蛋白及成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶的鉴定。结果：①从胚龄16周的新鲜人胚脑中成功分离出神经干细胞。人胚脑原代细胞为圆形亮球状，培养3d后可见细胞开始聚集成神经球，部分呈悬浮生长，2周后神经球增大，部分细胞增大数倍，具有极强折光性，可见分裂增殖。经传代后细胞仍保持原有特征，细胞形态不变。克隆细胞在有血清培养基中培养，24h后可见大部分细胞贴壁生长，细胞从神经球游出分散，形态不规则；48h后多数细胞分化为大量形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞，突起相互交织成网。②分离出的神经干细胞在体外培养条件下传代培养，并表达神经干细胞标志巢蛋白；含血清培养基培养48h分化后的细胞主要表达成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶。③冻存复苏的细胞95％，以上为活细胞，与新鲜细胞比较，细胞生长状况无明显差别。结论：用无血清培养条件下结合碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的作用，使干细胞体外得到了分离培养、增殖和纯化，证实其方法可行，同时冻存和新鲜细胞的比较，说明可用冻存方法保存人胚脑细胞，复苏后使用。     

含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养建立大鼠胚胎神经干细胞克隆的实验

背景体外培养获得神经干细胞的有效方法是干细胞实验研究中很值得关注的问题.目的观察应用含有不同生长因子的培养基体外培养神经干细胞的有效方法.设计单一样本观察.单位四川大学生命科学院细胞生物学实验室.材料孕14 d SD大鼠10只,DMEM/F12 11,碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子;巢蛋白抗体IgG,β-微管蛋白Ⅲ抗体Ig G,胶质纤维酸性蛋白抗体Ig G,生物素标记二抗和三抗、异硫氰酸荧光素标记二抗.方法实验于1999/2001在四川大学生命科学院细胞生物学实验室完成.①从胎鼠前脑取出脑组织,采用酶消化、机械吹打、离心、培养原代神经干细胞克隆.②神经干细胞以2×108L-1密度接种培养,分4组,每组6瓶细胞,DMEM/F12组加入DMEM/F12(11)培养基含体积分数为0.1的小牛血清;碱性成纤维细胞生长因子组培养基为含20μg/L碱性成纤维细胞生长因子;表皮生长因子组培养基含30μg/L表皮生长因子;碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子组先用含碱性成纤维细胞生长因子的培养基培养2 h后再换成含表皮生长因子的培养基培养.培养24 h后更换培养瓶,培养14 d后显微镜下计数原代克隆数,免疫组化法检测干细胞特殊标记蛋白巢蛋白的表达.主要观察指标①神经干细胞的原代克隆.②单细胞克隆培养结果.③诱导分化结果.结果①从胎鼠脑中分离的细胞具有连续传代形成克隆的能力,免疫荧光化学显示细胞球内细胞巢蛋白表达阳性.②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法形成神经干细胞克隆率最高(0.630%).③培养的神经干细胞克隆能诱导分化成神经元和神经胶质细胞.结论①结果证实培养分离的细胞是神经干细胞.②采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子培养基先后作用培养的方法是获得神经干细胞的有效方法.     

正常人表皮细胞老化过程中的生物学特性

背景目前有关表皮细胞体外衰老的文献报道甚少,而表皮细胞是构建组织工程化皮肤所必需的种子细胞,文章拟对正常人表皮细胞老化过程中的生物学特性加以阐述,为组织工程化皮肤选择合适的种子细胞奠定基础.目的通过研究表皮细胞体外增殖与老化规律,为选择合适的组织工程化皮肤种子细胞提供依据.设计自身对照实验.单位潍坊医学院整形外科研究所,潍坊医学院附属医院普外科.材料实验于2000-09/2002-09在潍坊医学院整形外科研究所完成.实验样本来源于在潍坊医学院附属医院普外科行包皮环切术的6～8岁正常男性儿童20例切除的健康包皮组织,监护人获完全同意,将包皮标本用于表皮细胞增殖培养实验.方法取正常年轻人表皮细胞进行传代培养,以不同代龄细胞为实验对象,采用形态学观察、群体倍增时间、免疫细胞化学及β-半乳糖苷酶染色的方法,检测表皮细胞老化规律.主要观察指标①表皮细胞生长特性的改变.②表皮细胞形态学改变.③表皮细胞表型的改变.结果①表皮细胞生长特性的改变体外单层培养9代,P2的群体倍增时间最短,前5代增殖能力较强,P5以后群体倍增时间明显延长,P8细胞不再增殖.②表皮细胞形态学改变原代细胞接种3 d后开始增殖,4 d后细胞加速增殖,培养1周左右细胞接近融合.显微镜、免疫组化鉴定,符合表皮细胞的特点.③表皮细胞表型的改变随着细胞的连续传代培养,β-半乳糖苷酶组化表达呈现从弱(在年轻细胞中占9%)到强(在老化细胞中占65%)的趋势,β-半乳糖苷酶染色的阳性率和细胞代龄之间呈显著正相关(r=0.87,P＜0.01).结论①与年轻细胞相比,老化细胞具有衰老形态和酶细胞化学特征的增多;在细胞从年轻向老化发展的进程中,细胞群体倍增时间呈延长的趋势.②与年轻细胞相比,老化细胞中β-半乳糖苷酶的表达显著增强,且这种增强与细胞衰老表型的出现和细胞增殖能力的丧失相平行,反应细胞的老化程度.③本实验建立了体外培养正常人表皮细胞的衰老模型,第1～5代表皮细胞(供者年龄16～18岁)可作为构建组织工程化皮肤的种子细胞.     

人角膜缘干细胞体外传代及建系

背景：通过体外培养人角膜缘干细胞并进行传代、建系研究可为角膜缘干细胞移植的基础与临床研究提供足够的细胞储备。 目的：探讨一种体外培养人角膜缘干细胞传代、建系的方法。 设计：随机对照观察。 单位：赣南医学院。 材料：实验于2003—06／2004—04在赣南医学院科研中心与中山大学医学院眼科医院国家重点实验室完成。新鲜人角膜缘组织块分别取自2名健康人角膜组织供体，均经过供体者知情同意。RPMI-1640（Sigma R8755，含L-谷氨酰胺），200g／L胎牛血清（Gibco 16140—071）。DMEM培养基、硫酸软骨素、人表皮生长因子购自美国Sigma公司，HEPES、DMSO购自美国Gibco公司，100％甘油购自上海运佳黄浦制药有限公司，戊二醛购自德国E．Merk公司，乙醇、盐酸、丙酮、甲醛等购自北京化学试剂公司，0．25％胰蛋白酶液购自上海新华制药厂，上述试剂均为分析纯级。 方法：人角膜缘深部色素区组织块经消化后，分别在含有RPMI-1640、200g／L胎牛血清的培养瓶与以羊膜细胞外基质为培养载体的培养皿中进行体外培养。光镜及扫描电镜观察原代及传代培养细胞的生长情况；采用台盼蓝排斥实验计算冻存细胞逐代冻存处理后的复苏率。 主要观察指标：①人角膜缘干细胞体外原代及传代培养观察结果。②细胞冻存复苏率。 结果：①原代培养结果：经PRMI-1640培养基中培养1d后，倒置相差显微镜下可见培养瓶中细胞多已贴壁。均匀稀疏排列成单层并贴于培养瓶底部。②传代培养结果：传第2代时添加入表皮生长因子后，细胞分散成单层，贴壁生长旺盛。所有细胞传至第30代后形态的变异性增加明显，细胞体积明显增大，形态呈圆形或不规则圆形，密集成群。在培养液中传33代后，细胞仍然保持旺盛的分化、增殖能力，并且更适宜在羊膜细胞外基质上生长。③细胞冻存复苏率：冻存细胞的复苏率为82，2％。 结论：将人角膜缘干细胞经体外培养33代并逐代冻存后初步建立了人角膜缘干细胞系，人角膜缘干细胞更适合在含有羊膜细胞外基质为底物的培养基中生长。     

胚胎干细胞向胆管上皮细胞定向分化的体外实验

背景：在胚胎干细胞向肝细胞诱导分化的培养条件基础上增加向胆管上皮细胞分化的培养条件，使其向胆管上皮细胞方向分化在理论上是可行的。 目的：验证在细胞生长因子胚胎干细胞体外定向分化为胆管上皮细胞的可行性。设计：单一样本观察。 单位：中山大学附属第一医院。 材料：选用BALB／c系小鼠胚胎干细胞（BALB／c—ES）由中山大学实验动物中心建系和保存。分化生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、上皮生长因子、角化细胞生长因子均为美国Sigma公司产品，实验用抗小鼠细胞角蛋白7（CK7）和细胞角蛋白19（CK19）购自丹麦DAKO公司，间接免疫荧光试剂盒为美国Biodesign产品，IX70-S8F2倒置相差荧光显微镜为日本OLYMPUS产品。 方法：实验于2004—10／2005-06在中山大学附属第一医院中心实验室完成。①将小鼠胚胎干细胞进行拟胚体分化，在培养系统中按不同时间段分别添加分化生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、上皮生长因子、角化细胞生长因子，使胚胎干细胞向胆管上皮细胞方向分化。以培养液中不添加上述细胞生长因子为对照组，使胚胎干细胞自然分化。②采用倒置相差荧光显微镜动态观察细胞生长及三维的环状结构形成情况。③于细胞分化第10天开始采用免疫细胞化学方法检测胆管上皮细胞标记物CK7、CK19，γ-谷胺酰转肽酶（GGT）表达变化，同时观察γ-谷胺酰转肽酶阳性细胞的形态学特点。 主要观察指标：①细胞生长及三维环状结构形成情况。②胆管上皮细胞标记蛋白CK7、CK19的表达。③胆管上皮细胞标记酶GGT表达及其阳性细胞形态学情况。结果：①细胞生长及三维的环状结构形成情况：胚胎干细胞悬浮培养10h后即可见小的拟胚体形成并悬浮在培养液中。分化第10天在拟胚体细胞分化群落中出现～种三维的环状结构，细胞呈同心圆层状排列，内层细胞排列紧密，继续培养，内层细胞逐渐排列疏松，分化20d左右时细胞活力达到最好，其后活力开始下降，分化36d时三维结构裂解并呈条索状悬浮于培养液中。对照组环状结构于第13天出现，细胞结构于27d裂解。②CK7，CK19表达：胆管上皮细胞环状结构形成当日即有CK7表达，分化第13天时CK19表达，其后两者同时表达于三维结构细胞中并随培养时间增加而表达逐渐增强。对照组细胞在分化第13，15天开始出现CK7，CK19表达。③胆管上皮细胞标记酶GGT表达及其阳性细胞形态学变化：加入生长因子后，细胞环状结构形成初始即表达GGT，说明此结构中含有胆管上皮细胞。在环状结构形成初始，细胞间连接紧密，不能分清单个细胞结构，随着培养时间增长，单细胞结构逐渐清晰。GGT阳性细胞呈多角型或方形排列，核位于中央，细胞器较少，胞质染色较浅，符合立方上皮细胞特点，体现出胆管上皮细胞的形态学特点。 结论：胚胎干细胞在细胞生长因子的作用下可定向分化为胆管上皮细胞并可以形成类胆管样结构。     

人羊膜负载猪角朊细胞构建皮肤表皮替代物的实验研究

背景人羊膜为半透明的薄膜,含有多种促进细胞增殖的营养成分,是一种较好的负载角朊细胞的生物材料.目的将人羊膜负载培养猪角朊细胞构建皮肤表皮替代物,并观察猪角朊细胞在人羊膜上生长增殖的形态特点.设计以细胞为研究对象,单一样本研究,重复测量观察.单位解放军第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所.材料实验于2001-01/11在创伤、烧伤和复合伤国家重点实验室,第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所完成.猪角朊细胞取自3月龄贵州小香猪.方法将贵州小香猪的角朊细胞原代培养,传代扩增后,将角朊细胞以1.63×105/cm2的密度接种于人羊膜基质面,逐日于倒置显微镜下观察角朊细胞的生长增殖变化情况,并于培养3 d与15 d进行光镜、电镜观察,检测角朊细胞在人羊膜上的生长情况.主要观察指标角朊细胞在人羊膜上的生长情况.结果倒置显微镜下观察接种后30 min内明显见到角朊细胞在人羊膜上黏附,24 h内大部分黏附生长,3 d形成单层完全覆盖人羊膜.光镜下人羊膜负载角朊细胞3 d,可见角朊细胞在人羊膜基质面黏附呈单层生长,细胞扁平紧密排列.扫描电镜下可见胞体呈多边形,多见胞膜突起.透射电镜下可见角朊细胞与人羊膜黏附良好,生长在人羊膜上的角朊细胞内有许多角质丝.生长至15 d,在倒置显微镜和扫描电镜下均可见,细胞因过于拥挤而隆起,因老化而形成较多碎片,部分细胞有空洞形成.结论人羊膜是角朊细胞在体外培养的良好载体,对角朊细胞有明显的促增殖作用.但人羊膜负载角朊细胞生长至15 d,因老化部分细胞有空洞形成.     

非诱导条件下犬骨髓基质干细胞的生物特性

背景种子细胞的研究是组织工程众多研究领域中最重要的基础环节,骨髓基质干细胞以其诸多优点,成为理想的骨组织工程的种子细胞.目的观察骨髓基质干细胞在体外培养的生长特点和非诱导条件下的成骨特性.设计单一样本实验.单位福建医科大学附属口腔医院种植中心.材料实验于2003-05/12在福建医科大学附属口腔医院中心实验室完成.骨髓基质干细胞来自4只1岁龄的杂交犬的原代～第3代传代细胞.方法无菌条件下在杂交犬两侧股骨大转子部做骨髓穿刺,抽取5 mL肝素抗凝的骨髓,加入到含有50 mL含双抗Dulbecco's改良的Eagle's培养液的离心管中分离单个核细胞,进行首次提纯获取骨髓基质干细胞单细胞,置培养箱中培养传代,培养48 h后,吸除培养液,以后每3天换液1次.继续传代.采用倒置相差显微镜及苏木精-伊红染色观察骨髓基质干细胞形态;每天进行细胞计数,测定倍增时间,绘生长曲线;用钙钴法检测碱性磷酸酶;用茜素红法染色观察钙化结节生长情况.主要观察指标①犬骨髓基质干细胞光镜结构.②犬骨髓基质干细胞生长曲线.③成骨分化指标碱性磷酸酶及钙化结节的观察.结果①形态学观察表明,骨髓基质干细胞贴壁细胞呈集落生长,有成纤维样细胞外观,未加入成骨诱导剂,细胞形态发生变化.②碱性磷酸酶表达原代细胞呈强阳性,第1代细胞呈阳性,第2,3代细胞呈弱阳性.③钙沉积出现,原代细胞染色强于传代细胞.结论①骨髓基质干细胞在体外培养能大量扩增,具有自然向成骨细胞分化的能力,是骨组织工程理想的种子细胞.②3代内扩增的骨髓基质干细胞有成骨活性,但原代细胞传代活性优于传代后细胞.     

端粒酶逆转录酶基因修饰人骨髓间质干细胞的实验

背景:人骨髓间充质干细胞经过有限次的细胞传代后,就会停止增殖,发生衰老和死亡。有研究表明,端粒与细胞寿命的控制密切相关,是否可通过外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达,诱导人骨髓间充质干细胞的端粒酶活性,维持端粒长度的稳定,从而延长人骨髓间充质干细胞的生命周期并保持其多潜能分化特性?目的:观察外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达对人骨髓间质干细胞端粒酶活性及细胞生命周期的影响。设计:重复测量实验。单位:郑州大学医学院干细胞研究中心。材料:实验于2003-10/2005-12在郑州大学医学院干细胞研究中心完成。人骨髓间质干细胞采自郑州大学第一附属医院及第三附属医院小儿外科和门诊20名健康志愿者。增强型绿色荧光蛋白-C1质粒和增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒由加拿大Dr.ChantalAutexier馈赠。DH5α菌株由郑州大学医学院重点分子医学实验室侯卫红博士馈赠。方法:无菌条件下,抽取健康志愿者胸骨骨髓2mL,经离心、洗涤及传代培养后备用。①阳离子脂质体转染及阳性克隆的筛选和扩增结果:将第5代人骨髓间充质干细胞接种至24孔培养板中,将携带有增强型绿色荧光蛋白报告基因和人端粒酶逆转录酶目的基因的质粒pEGFP-人端粒酶逆转录酶通过脂质体转染法转入人骨髓间充质干细胞中,转染共分4组:正常对照组、脂质体组、增强型绿色荧光蛋白-C1质粒组、增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒组,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选与扩增。②人骨髓间充质干细胞转染前后人端粒酶逆转录酶mRNA的表达及端粒酶活性的检测:通过RT-PCR和PCR-ELISA对选用转染增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒的第5代人骨髓间充质干细胞(以下简称为转H人骨髓间充质干细胞第5代)、转染增强型绿色荧光蛋白-C1质粒的第5代人骨髓间充质干细胞(以下简称为转C人骨髓间充质干细胞第5代)、未转染的第10代人骨髓间充质干细胞、K562细胞(阳性对照)转染前后人端粒酶逆转录酶mRNA的表达情况,对转H第5及30代人骨髓间充质干细胞、转C第5代人骨髓间充质干细胞及未转染的第10代人骨髓间充质干细胞端粒酶活性的影响进行检测。③转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析:采用胰蛋白酶-Giemsa染色法转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析。④转H人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞及RT-PCR鉴定:将转染细胞在重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子的联合诱导下向神经元样细胞定向诱导分化,并用RT-PCR进行鉴定(蛋白微管相关蛋白和神经丝亚单位M表达)。主要观察指标:①不同转染组阳离子脂质体转染及阳性克隆的筛选和扩增结果。②不同转染组人端粒酶逆转录酶mRNA的表达及端粒酶的活性。③转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析结果。④转H人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞及RT-PCR鉴定结果。结果:①随G418浓度的下降,正常对照组、脂质体组细胞全部死亡,从而得到稳定表达增强型绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞;经G418加压筛选后得到1个连续传到第35代且生长旺盛的抗性细胞克隆,倒置显微镜下观察与未转染人骨髓间充质干细胞相比无明显差异。②转C第5代人骨髓间充质干细胞和未转染第10代人骨髓间充质干细胞的人端粒酶逆转录酶mRNA表达阴性,而K562和转H第5代人骨髓间充质干细胞的人端粒酶逆转录酶mRNA表达阳性。③转H第5代人骨髓骨髓间充质干细胞组和转H第30代人骨髓间充质干细胞端粒酶为阳性。④转H人骨髓间充质干细胞第10,20,30代的染色体总数均为23对,且含2条X性染色体,仍为正常2倍体,染色体形态和数目均正常。⑤较多转H人骨髓间充质干细胞出现了典型的神经元样形态,且经RT-PCR检测表明,神经元特征性蛋白微管相关蛋白和神经丝亚单位M表达增强。结论:外源性人端粒酶逆转录酶基因可以在人骨髓间充质干细胞中获得异位表达,并能诱导人骨髓间充质干细胞的端粒酶活性。外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达不仅可以使人骨髓间质干细胞的寿命明显延长而且不影响其维持干细胞的多向分化潜能特性。     

SD大鼠角朊细胞体外培养的实验

目的:观察SD大鼠角朊细胞在体外培养的生长特性。方法:采用dispase酶消化法从SD大鼠仔鼠皮肤获得角朊细胞,在体外进行培养并传代,采用倒置显微镜和MTT法观察细胞的形态学变化和生长曲线。结果:通过酶消化法可以获得较纯的角朊细胞,原代培养10d细胞即可以达到融合,传代后细胞部分发生变性,呈成纤维细胞样,传代次数高,成纤维样细胞比例也相应增高。结论:SD大鼠角朊细胞可以在体外培养分裂增殖,但传代后即发生变     

Thrombospondin-induced adhesion of human keratinocytes.

Human epidermal keratinocytes obtained from normal skin attached and spread on thrombospondin (TSP)-coated plastic dishes but failed to attach and spread on untreated plastic culture dishes or dishes coated with fibronectin or laminin. These cells produced minimal amounts of immunoreactive TSP. Keratinocytes established in culture on MCDB 153 medium and maintained for one to three passages in an undifferentiated state by continued cultivation in this low Ca2+-containing medium attached and spread on plastic dishes as well as on TSP-coated dishes. These cells also secreted significant amounts of TSP into the culture medium. When the keratinocytes were incubated for one day in MCDB 153 medium supplemented with high Ca2+ or in MEM (which also contains high Ca2+), there was decreased secretion of TSP into the culture medium concomitant with a reduction in attachment and spreading on plastic culture dishes. Proteolytic fragments of TSP were examined for stimulation of keratinocyte attachment and spreading. A 140-kd fragment produced by removal of the 25-kd heparin-binding domain had similar activity to the intact molecule while the 25-kd fragment was without effect. Further proteolytic treatment of the 140-kd fragment gave rise to a fragment consisting of 120 kd and 18-D moieties held together in disulphide linkage. This fragment did not support attachment or spreading. This study reveals that normal epidermal keratinocytes grown under conditions that maintain the undifferentiated state are able to produce TSP and utilize it as an attachment factor. When keratinocytes are grown under conditions that promote differentiation, ability to produce and utilize TSP is diminished. Since TSP is present at the dermal-epidermal junction and because TSP promotes keratinocyte attachment and spreading, this molecule may play an important role in maintaining normal growth of the basal cell layer and may also participate in reepithelialization during wound repair.     

Detection of transforming growth factor alpha in normal, malignant, and hyperproliferative human keratinocytes

Transforming growth factor alpha (TGF-alpha) is a 50-amino acid peptide, previously demonstrated only in transformed cell lines and human tumors, which is structurally homologous to epidermal growth factor (EGF). TGF-alpha expression in keratinocytes from normal individuals, patients with psoriasis, and patients with malignant skin diseases was investigated using an mAb raised against synthetic human TGF-alpha. mAb A1.5 reacted with TGF-alpha, but not EGF, in a sensitive ELISA. Keratinocytes in eight nodular basal cell carcinomas, one morpheic basal cell carcinoma, and one squamous cell carcinoma demonstrated intense membranous immunoperoxidase staining with mAb A1.5. Of even greater interest was the observation that the overlying normal epidermis, as well as the epidermis from five normal skin specimens, were stained by the mAb. Keratinocytes in plaques from 18 psoriasis patients were more intensely stained than those from normal skin. Cultured normal keratinocytes demonstrated membranous staining with mAb A1.5. Absorption of mAb A1.5 with synthetic human TGF-alpha completely removed the reactivity of mAb A1.5 with both basal cell tumors and normal epidermis. The demonstration of TGF-alpha in normal keratinocytes suggests that it plays a role in normal keratinocyte growth, wound healing, and in the pathogenesis of acanthosis.