siRNA干扰ARD1对人结直肠腺癌细胞株基因表达谱的影响

目的 探讨siRNA干扰抑制ARD1的表达对人结直肠腺癌细胞株基因表达谱的影响.方法 利用脂质体将筛选出的有效沉默ARD1的siRNA分别转染到SW620、HCT-8两株细胞中,提取两株细胞的总RNA并应用安捷伦人全基因表达谱芯片检测转染前后基因表达谱的变化.结果 两株细胞中,转染组相对于阴性对照组,21个基因共同上调...     

siRNA的设计、合成与转染及其在RNA干扰中的应用

基因阻断技术近年来发展迅速,已成为分子生物学研究的主要技术手段之一。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的过程。RNAi最初发现于某些植物中,随后在线虫、果蝇、斑马鱼中相续发现存在RNAi现象。最近,在哺乳动物细胞中的研究也取得满意结果。RNAi作为新兴的基因阻断技术,在人类基因功能研究、基因治疗方面已显示出巨大的前景。     

HLA-G基因siRNA真核表达质粒的构建及其对转染JEG-3细胞株HLA-G表达的抑制作用

目的:构建针对人类白细胞抗原-G基因(human leukocyte antigen-G,HLA-G)基因siRNA表达质粒,观察其对转染JEG-3细胞的HLA-G基因表达的抑制作用。方法:选择RNA干涉靶序列,体外合成两段互补的寡核苷酸,通过与线性化pSuppressor-U6-neo连接、转化大肠杆菌,扩增、纯化得到所需质粒,通过琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列。将重组真核表达质粒pSuppressor-U6-neo-HLA-G用脂质体法转染JEG-3绒癌细胞株。应用RT-PCR、Western-blot方法检测转染的JEG-3细胞中HLA-G基因的表达水平。结果:双酶切鉴定及测序图显示,插入的寡核苷酸序列与设计的序列完全相符。RT-PCR和Western-blot结果均表明瞬时转染重组pSuppressor-U6-neo-HLA-G质粒明显抑制了JEG-3细胞中HLA-G基因的表达。结论:本试验成功构建了针对HLA-G基因的siRNAs表达质粒pSuppressor-U6-neo-HLA-G,瞬时转染JEG-3细胞后可以明显抑制HLA-G基因的表达。     

siRNA的设计、合成与转染及其在RNA干扰中的应用

基因阻断技术近年来发展迅速，已成为分子生物学研究的主要技术手段之一。1RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的过程。RNAi最初发现于某些植物中，随后在线虫、果蝇、斑马鱼中相续发现存在RNAi现象。最近，在哺乳动物细胞中的研究也取得满意结果。RNAi作为新兴的基因阻断技术，在人类基因功能研究、基因治疗方面已显示出巨大的前景。     

mTOR特异性siRNA重组表达载体的构建及鉴定

目的构建mTORsiRNA重组表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制巨噬细胞mTOR基因的相关研究奠定基础．方法设计具有短发夹结构的DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGPU6／GFP／Neo中构建重组表达载体,转化DH5c~菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定。再转染人巨噬细胞RAW264．7,进行荧光摄像和阳性克隆筛选。Westernblot方法检测巨噬细胞mTOR蛋白表达。结果DNA测序结果及PCR鉴定证实成功构建小鼠mTORsiRNA重组表达载体。Westernblot结果显示转染该重组载体的巨噬细胞mTOR蛋白表达下降约4l％。结论mTOR靶向RNA干扰重组表达载体构建成功,可以进行稳定筛选,该载体对巨噬细胞mTOR蛋白表达有抑制作用。     

Smad3基因siRNA表达载体的构建及沉默效应

背景:研究提示抑制Smad3可望抑制纤维增生和胶原的大量产生.目的:构建针对Smad3基因的siRNA表达载体,观察RNA干扰对增生性瘢痕成纤维细胞Smad3基因表达的抑制作用.方法:根据siRNA设计原则,设计3条针对Smad3基因的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后与载体pRNAT-U6连接,然后进行酶切鉴定和DNA序列测定.用脂质体包裹转染增生性瘢痕成纤维细胞,荧光定量PCR和Western blot方法检测Smad3基因的表达情况.结果与结论:测序分析结果显示:克隆入pRNAT-U6载体的针对Smad3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段插入正确;荧光定量PCR和Western blot检测显示:转染的增生性瘢痕成纤维细胞Smad3基因的表达水平明显降低,尤以AGA CAG ACT GTG ACC AGT A(1156)为靶序列的siRNA沉默作用最强,抑制效率于转染后48 h可达45%.证实实验构建的沉默增生性瘢痕成纤维细胞Smad3基因表达的siRNA载体获得成功.     

Smad3基因siRNA表达载体的构建及沉默效应

背景：研究提示抑制Smad3可望抑制纤维增生和胶原的大量产生。目的：构建针对Smad3基因的siRNA表达载体,观察RNA干扰对增生性瘢痕成纤维细胞Smad3基因表达的抑制作用。方法：根据siRNA设计原则,设计3条针对Smad3基因的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后与载体pRNAT-U6连接,然后进行酶切鉴定和DNA序列测定。用脂质体包裹转染增生性瘢痕成纤维细胞,荧光定量PCR和Western blot方法检测Smad3基因的表达情况。结果与结论：测序分析结果显示：克隆入pRNAT-U6载体的针对Smad3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段插入正确;荧光定量PCR和Western blot检测显示：转染的增生性瘢痕成纤维细胞Smad3基因的表达水平明显降低,尤以AGA CAG ACT GTG ACC AGT A（1156）为靶序列的siRNA沉默作用最强,抑制效率于转染后48h可达45%。证实实验构建的沉默增生性瘢痕成纤维细胞Smad3基因表达的siRNA载体获得成功。     

Toll样受体4小干扰RNA表达载体的构建及鉴定筛选

目的构建并筛选到能有效抑制TLR4基因表达的小干扰RNA表达载体,用于研究TLR4基因功能。方法 RNA干扰采用体外构建小干扰RNA表达载体法,将构建好的表达载体转染单核细胞株,分别用流式细胞术和实时荧光定量RT-PCR法检测TLR4蛋白和mRNA表达变化,筛选抑制效率最高的小干扰RNA表达载体。结果成功构建了TLR4小干扰RNA表达载体,并经电泳及测序证实;编号为S8-1的载体转染入细胞后,TLR4阳性率为27.03%,显著低于对照组的35.12%;流式细胞术和实时荧光定量RT-PCR法检测均证实编号为S8-1小干扰RNA表达载体的抑制效率最高,可用于后续实验。结论本实验所构建的编号为S8-1小干扰RNA表达载体可有效抑制TLR4基因表达,小干扰RNA表达载体法能够抑制体外培养细胞株TLR4的表达,可用于研究TLR4基因功能。     

靶向Arnt的RNAi慢病毒载体的构建及其在HCCLM6中对Arnt基因表达的影响

目的：构建并鉴定Arnt基因特异性RNAi慢病毒载体，将其导入HCCLM6肝癌细胞中，筛选有效抑制ARNT表达的稳定细胞株。方法：针对已经筛选确定的Arnt基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与经HpaI和XhoI酶切后的pLVTHM载体连接[含U6启动子和绿色荧光蛋白（GFP）]产生LV-shArnt慢病毒载体，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定。用LV—shArnt载体，pCMV—dR8．74载体，pMD2G载体三质粒共转染包装细胞293T细胞，包装产生慢病毒，以293T细胞GFP蛋白表达水平测定病毒滴度，挑选细胞克隆，收获病毒上清，将病毒上清转染HCCLM6中，经过GFP筛选得到稳定抑制Arnt表达的HCCLM6细胞株，通过RT—PCR鉴定抑制Arnt表达的效果。结果：双酶切与测序鉴定证实成功构建了ArntshRNA的慢病毒载体，转染包装病毒细胞株获得的病毒上清成功转染了HCCLM6，并且抑制了Arnt的表达。结论：运用pLVTHM载体构建的LV—shArnt慢病毒载体可有效抑制Arnt在肝癌细胞株HCCLM6中的表达，为观察转染shRNA慢病毒表达载体的肿瘤细胞的恶性生物学行为变化奠定了实验基础。     

敲减Akt表达对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖的影响

目的:研究慢病毒介导Akt靶向的RNA干扰对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RAFLS)增殖的影响。方法:慢病毒表达载体pL/Akt转染RAFLS并表达靶向Akt的siRNA序列,采用RT-PCR和Western Blot检测Akt表达,MTT法检测RAFLS增殖能力的变化。结果:转染pL/Akt后,RAFLS中Akt1、Akt2的mRNA分别下降了65%和68%以上,Akt蛋白的表达量在48h后下降76.19%(P<0.05),RAFLS细胞增殖在48、72、96h分别下降了27.50%、44.69%和56.80%(P<0.05)。结论:慢病毒表达载体pL/Akt能够降低Akt蛋白表达水平,并显著抑制RAFLS增殖。     

FRAT1基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建FRAT1siRNA真核干涉表达载体pSINsi-FRAT1,并测序鉴定证实克隆正确。方法设计以FRAT1基因为靶标的RNAi序列和阴性对照片段序列,并克隆入载体pSINsi-hU6,用基因测序进行重组克隆验证。结果PCR检测证实siRNA插人pSINsi-hU6质粒,测序分析证实插入序列正确。结论成功构建FRAT1基因的RNAi载体,为研究FRAT1基因对结肠癌细胞增殖凋亡侵袭的影响提供了稳定转染的RNA干扰质粒。     

小鼠Qa-1基因有效shRNA干扰质粒的构建与筛选

本研究构建3个针对小鼠Qa-1基因的小发夹RNA（shRNA）表达质粒，观察其对Qa-1基因的沉默作用，筛选出有效靶位。通过美国Ambion公司提供的siRNA web设计工具，选择3段针对Qa-1的siRNA，交由晶赛公司合成3个小发夹表达质粒，采用脂质体转染法转染NIH3T3细胞，第1、2、3组细胞分别转染3个小发夹表达质粒，第4组细胞单纯加入脂质体作为阴性对照，收集转染后24、48、72小时的细胞，用RT-PCR技术及流式细胞术对Qa—1在RNA水平的变化和细胞表面表达进行分析，筛选最有效的干扰片段。结果表明：成功构建了3个针对小鼠Qa—1的小发夹表达质粒。RT—PCR及流式细胞术检测证实，转染后3个组shRNA载体均可抑制Qa-1基因的表达，但抑制程度不一：24、48、72小时3个组细胞表面Qa-1表达减低率分别为H2-T231：60．9％，81．9％，43．6％；H2-T232为：64．5％。73．9％。61．1％；H2-T233为：61．9％，71．2％，47．5％．其中H2-T232组在3个时间点抑制作用均最明显。结论：构建的3个针对Qa-1的小发夹表达质粒均能抑制Qa-1的表达，其中H2-T232具有最有效抑制作用。     

Bcr／abl特异性RNA干扰真核表达载体的构建

目的：构建特异性的抗慢性髓细胞白血病融合基因bcr／abl mRNA的siRNA真核细胞表达载体，探索RNA干扰(RNAi)分子靶向治疗慢性髓细胞性白血病(CML)的作用。方法：根据GenBank数据库提供的bcr／abl基因核苷酸序列，按照Tusehl设计原则，选择设计双链小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，再转化为能表达其小发卡结构RNA(Small hairpin RNAs，shRNA)的DNA序列，并与pTER质粒定向连接，构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的真核表达载体pTER／shRNA1、pTER／shRNA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果：构建慢性粒细胞白细胞bcr／abl融合基因siRNA真核表达载体pTER／shRNA1、pTER／shRNA2，经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。结论：抗慢性粒细胞白细胞bcr／abl融合基因siRNA真核细胞表达载体的构建成功。     

重组Mash1慢病毒表达载体的构建

目的:克隆小鼠Mash1基因的全长cDNA,构建其慢病毒表达载体Lentivirus-Mash1,为进一步研究Mash1在神经发育及干细胞神经分化中的作用奠定基础。方法:应用RT-PCR从小鼠13d胚胎中扩增出Mash1cDNA片段,经回收纯化与pGEM-T载体连接并转化感受态细菌J M109,通过蓝白筛选、PCR扩增和双酶切鉴定出阳性菌落,并对其进行基因测序。BamHⅠ和XholⅠ双酶切pGEM-T-Mash1和Lentivirus获得的目的基因双粘片段与Lentivirus双粘线性质粒相连接,转化J M109,酶切方法鉴定重组阳性菌落。结果:PCR扩增、酶切分析及序列测定证实成功获取Mash1cDNA克隆;酶切鉴定证实Lentivirus-Mash1含有大小正确的正向Mash1cDNA片段。结论:成功建立了小鼠Mash1cDNA克隆并构建了慢病毒表达载体Lentivirus-Mash1。     

小鼠Atrogin-1基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的：构建小鼠Atrogin-1基因真核表达载体,研究其功能,并探讨其在癌性恶液质骨骼肌萎缩中的作用机制。方法：提取小鼠C2C12细胞RNA,反转成cDNA,PCR合成含有酶切位点的Atrogin-1 cDNA全长,酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,经鉴定及测序证实cDNA片段大小和序列正确,然后用其转染293T细胞,Western blot法检测Atrogin-1蛋白的表达。结果：pcDNA3.1-Atrogin-1含大小、序列正确的Atrogin-1cDNA片段,转染pcDNA3.1-Atrogin-1的293T细胞裂解液中能检测到Atrogin-1蛋白高表达。结论：成功构建了Atrogin-1基因真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,并在真核细胞中表达了目的蛋白,其是研究癌性恶液质的重要工具。     

有效抑制T24细胞survivin表达的小RNA筛选及其载体构建

目的:筛选有效抑制T24细胞survivin表达的si RNA序列,并构建其质粒载体,为后续研究提供基础。方法:设计并合成针对survivin的si RNA,转染T24细胞。用RT-PCR方法测定干扰后细胞survivin mRNA表达,Western-blot方法测定干扰后survivin蛋白表达,比较其抑制率,筛选出有效抑制靶基因表达的si RNA,并构建相应的质粒载体(shRNA)。结果:si RNA转染T24细胞有较高的转染效率;②半定量RT-PCR:1号si RNA干扰T24细胞48h后survivin基因mRNA表达最低,有显著差异(P<0.05),抑制率70%左右。③Western-blot:1号si RNA干扰T24细胞72h后survivin蛋白表达最低,有显著差异(P<0.05),抑制率60%左右。④Western-blot方法测定T24细胞转染1号si RNA后连续7d survivin蛋白表达量变化:干扰后48~96h survivin蛋白表达量最低,有显著差异(P<0.05)。⑤以1号si RNA序列构建质粒载体并转染T24细胞成功,转染效率较高,质粒本身对细胞无毒无害。结论:所设计、合成的si RNA中,1号survivin-si RNA对T24细胞sur-vivin表达有明显抑制作用;②根据实验结果构建的质粒载体及其对照质粒可用于T24细胞转染,供进一步实验研究。     

大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒载体的构建与测序

[目的]构建测序大鼠视黄醇结合蛋白-1(CRBP-1)基因短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体.[方法]针对已经筛选确定的大鼠CRBP-1基因RNA干扰(RNAi)有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生shRNA慢病毒裁体,命名为Lv-shCRBP-1,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.[结果]PCR鉴定与DNA测序证实合成的Lv-shCRBP-1寡核苷酸链插入正确.[结论]成功构建大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒载体.     

小鼠SRY同源盒基因SOX1的克隆及其真核表达载体pEGFP-C3-SOX1的构建

目的:克隆小鼠SRY同源盒基因SOX1的全长cDNA,构建其携带增强型荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-C3-SOX1,为进一步研究SOX1在间充质干细胞神经分化中的作用奠定基础。方法:采用RT-PCR方法从小鼠早期胚胎中扩增带有EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点的SOX1 cDNA片断,与pGEM-T载体连接后转化感受态细菌JM109,然后通过蓝白筛选、酶切技术筛选、鉴定出阳性菌落并进行DNA测序。用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切获得目的片断,再与EcoRⅠ和HindⅢ双酶切过的pEGFP-C3质粒相连接,重组子转化JM109感受态大肠杆菌,酶切方法鉴定阳性菌落。结果:多酶切及DNA测序结果表明提取及纯化的pEGFP-C3-SOX1质粒含有SOX1 cDNA碱基片段,方向及大小正确。结论:从小鼠胚胎中可成功克隆SOX1全长cDNA,并构建其真核表达载体pEGFP-C3-SOX1。     

抑制cyclin D1基因小发夹RNA(shRNA)表达质粒的构建

目的:通过构建抑制cyclin D1基因小发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统,为肿瘤基因治疗提供实验依据。方法:利用基因重组技术构建靶向cyclin D1RNA干扰(RNAi)表达质粒,双酶切鉴定电泳及测序分析构建的质粒是否成功;Western Blot分析转染前后K562细胞cyclin D1蛋白表达的变化。结果:体外合成的64个碱基成功插入到预计位点,并且与设计序列完全一致;Western Blot分析结果显示转染所构建的质粒能明显下调K562细胞cyclin D1基因表达。结论:质粒的成功构建为研究其抑制cyclin D1基因表达,发挥抗肿瘤效应以及与放、化疗联合的协同效应打下基础。