大鼠脑微血管周细胞的分离和鉴定

目的探讨大鼠脑微血管周细胞的分离、培养和鉴定方法。方法10只3周龄Wstar 大鼠,无菌分离脑组织,采用2次酶消化和1次密度梯度离心法分离脑微血管片段,接种于35 mm培养皿进行原代培养。采用相差显微镜观察细胞形态,免疫荧光法鉴定α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、神经元-胶质...     

小鼠主动脉平滑肌细胞培养及钙化模型的优化

目的 通过改良后的酶消化法进行小鼠主动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）原代培养，提高VSMCs原代培养效率及质量，进而建立更快速有效的体外钙化模型。方法 剥离小鼠主动脉中膜并将其剪碎，分别采用改良组织贴块法及改良酶消化法进行小鼠VSMCs原代培养，免疫荧光染色鉴定细胞纯度后，分组（经典钙化组、改良钙化组）进行体外钙化诱导，采用vonKossa染色法评估各组钙化差异。结果 与改良组织贴块法相比，改良后的酶消化法培养原代VSMCs可在短时间内获得大量细胞，鉴定VSMCs纯度>98%，且细胞不易老化，传代存活率高。与传统体外钙化方法比，改良组的钙化更容易且稳定。结论 本研究通过改良的酶消化法提高了原代平滑肌细胞的存活率及培养效率，同时通过改良体外钙化诱导液配方，建立了良好的体外钙化模型。     

组织块贴壁法培养SD大鼠腹主动脉平滑肌细胞及鉴定

目的培养、鉴定SD大鼠腹主动脉平滑肌细胞。方法采用组织块贴壁法分离培养SD大鼠腹主动脉平滑肌细胞,胰蛋白酶消化传代,并应用相差显微镜和平滑肌肌动蛋白对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果培养出的平滑肌细胞呈长梭形生长,镜下可见培养细胞呈典型的"峰-谷"状生长,高倍镜下可见胞质内大量棕色、与细胞长轴平行的纤维细丝,免疫组化染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论组织块贴壁法体外培养SD大鼠腹主动脉平滑肌细胞操作简单、纯度较高、可行性高。     

大鼠血管壁中膜平滑肌细胞的原代培养及鉴定

目的探讨一种方便、快捷、大量原代培养大鼠血管壁中膜平滑肌细胞的方法,为心血管疾病的体外研究提供可靠的实验材料。方法利用改良的组织贴块法进行血管壁中膜平滑肌细胞原代培养,使用倒置相差显微镜观察细胞形态,并用免疫荧光染色鉴定分离培养的细胞。结果改良的组织贴块法成功培养出大鼠血管壁中膜平滑肌细胞,3 d~5 d可见细胞爬出,7 d~9 d即可传代。镜下见细胞以长梭形为主,呈典型"峰-谷"样生长,免疫荧光染色鉴定阳性细胞率在95%以上。结论本研究介绍的改良组织贴块法技术成熟,具有操作简单、方便等优点,使用该法不仅可以获得纯度高、活性好的血管中膜平滑肌细胞,而且缩短了培养周期。     

大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定

目的 改进大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)的培养方法.方法 采用机械刮除、差异贴壁等手段进行组织贴块法原代培养,胰蛋白酶消化传代,并应用相差显微镜和即用型SABC免疫组化染色试剂盒对细胞进行形态学和免疫组化鉴定.结果 镜下培养细胞呈典型的"谷峰状"生长,免疫组化染色显示胞浆内αactin阳性表达.结论 本法可获纯度高、结构和功能良好的VSMCs.     

小鼠胰星状细胞的分离培养及鉴定

目的:建立简单易行的小鼠胰星状细胞(PSCs)原代培养方法,为胰腺纤维化研究提供可靠的体外细胞模型.方法:采用植块法结合酶消化法进行培养,即在无菌条件下取小鼠正常胰腺组织,经过剪碎、胰蛋白酶消化后植入培养瓶中贴壁培养,并予限制性条件培养基进行纯化,通过倒置生物显微镜对传代前后所培养细胞进行形态学、自发荧光及油红染色脂滴的观察,并结合细胞免疫化学和免疫荧光等方法来鉴定小鼠PSCs.结果:小鼠原代PSCs培养3-4 d后油红染色阳性,并能观察到自发荧光现象;传代后的细胞形态主要表现为体积较大,伪足发达,呈"星芒状"或"乌贼样";细胞免疫荧光染色和细胞免疫化学染色显示α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达阳性.结论:植块与酶消化结合法分离小鼠胰腺星状细胞,简单实用、成功率高,能够满足体外实验的要求.     

大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定

目的探讨以简便、高效的方法获取血管平滑肌细胞,为相关研究提供实验材料。方法采用组织贴块法进行原代培养,胰酶消化法传代,并应用相差显微镜和平滑肌肌动蛋白对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果90%的组织块接种存活,培养5代的平滑肌细胞纯度达98%以上。镜下可见培养细胞呈典型的“峰-谷状”样生长,免疫组化染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论本法简便、可靠,短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞,可作为研究心血管疾病良好的体外模型。     

酶消化组织块法培养人心房成纤维细胞

目的 建立人心房成纤维细胞体外培养的有效方法。方法 无菌条件下将人右心耳标本剪成1 mm3大小组织块,经 1.25 g/L胰蛋白酶预消化15 min后,用组织块贴壁法培养。通过倒置显微镜观察培养细胞生长及形态学特点,使用免疫荧光法进行细胞鉴定。结果 培养3~4 d后可见细胞自组织块爬出,7~9 d后细胞可传代,传代后的细胞呈长纺锤形或多边形。免疫荧光染色发现其抗波形蛋白（vimentin）及抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）染色阳性,抗血管性血友病因子（vWF）染色阴性,鉴定为肌成纤维细胞。结论 酶消化组织块法培养人心房成纤维细胞/肌成纤维细胞简便、高效,方法可行。     

胰酶消化法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞

建立胰酶消化法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,并和其他大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养方法相比较.在无菌条件下分离雄性Wistar大鼠胸主动脉血管中膜,剪碎中膜,在37℃用10mL0.25%胰酶消化大约3.5h.中止消化后,在100g条件下离心5min,收集细胞种入25cm2细胞培养瓶.结果发现,胸主动脉平滑肌细胞至少可以传20代以上,并且细胞形态、生长特点、平滑肌a-肌动蛋白表达不发生明显的改变.结果提示,与目前的平滑肌细胞培养方法相比,胰酶消化法培养平滑肌细胞的方法重复性好,原代培养的平滑肌细胞具有数量多、生长迅速的特点.     

SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞组织贴块法培养及鉴定

目的建立SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)组织贴块培养法并进行鉴定。方法无菌条件下取大鼠胸主动脉,4⁶h后加入含20%胎牛血清的DMEM培养液,原代培养2周并用免疫荧光染色对培养的VSMC进行鉴定。结果组织贴块法成功培养了大鼠胸主动脉VSMC,56h后加入含20%胎牛血清的DMEM培养液,原代培养2周并用免疫荧光染色对培养的VSMC进行鉴定。结果组织贴块法成功培养了大鼠胸主动脉VSMC,5⁷d细胞迁出,107d细胞迁出,10¹4d细胞融合至80%进行传代。体外培养的VSMC可传至20代,培养的细胞呈典型的"峰谷"样生长,免疫荧光染色鉴定细胞纯度达95%。结论组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMC培养体系稳定,操作简单、方便,纯度较高,免疫荧光是鉴定VSMC的较佳方法。     

Ⅰ型胶原酶阶段消化法体外培养、纯化及鉴定大鼠成骨细胞

目的建立科学有效的大鼠成骨细胞体外培养模式,建立成熟合理的体外培养大鼠成骨细胞鉴定程序。方法采用I型胶原酶阶段消化法来消化新生大鼠乳鼠颅骨,来获得成骨细胞进行体外培养、扩增和鉴定。通过绘制成骨细胞生长曲线,倒置相差显微镜进行细胞形态学观察,基质钙结节形成观察;进行钙-钴法碱性磷酸酶(ALP)染色;I型胶原免疫组化染色来观察、鉴定大鼠成骨细胞。结果Ⅰ型胶原酶改良阶段消化法获得的大鼠成骨细胞纯度较高,增殖较快;ALP染色可见体外培养成骨细胞胞浆内棕褐色阳性颗粒;免疫组化法检测I型胶原可见成骨细胞胞浆呈棕黄色阳性着色,显微镜计数阳性细胞比例为87.3%;体外培养超过3w的成骨细胞可见基质钙结节形成。结论Ⅰ型胶原酶阶段消化法原代培养大鼠成骨细胞是一种科学有效的成骨细胞原代培养方法。     

三种原代小胶质细胞纯化培养方法的对比及分析

目的寻找简捷、高效的原代小胶质细胞纯化培养方法。方法以小胶质细胞原代培养的经典培养方法为基础,通过提高初次接种密度、减少细胞离心过滤、进行营养丧失培养等改进,培养后期分别采用经典机械分离法、低浓度胰酶消化法和利多卡因分离纯化法行细胞分离与纯化,记录形态变化并采用同倍数视野动态计数,借助CD68及OX42抗体间接免疫荧光标记进行鉴定、计算纯度。结果三种分离方法均获得了较高纯度和产量的小胶质细胞,其中利多卡因分离纯化法获得细胞数及纯度明显高于其他分离方法,低浓度胰酶消化法次之。结论小胶质原代细胞培养过程中,利多卡因分离纯化法及低浓度胰酶消化法均可有效提高培养产量及纯度,以利多卡因分离纯化法最佳。     

应用改良的组织块酶消化法体外培养人大肠癌原代细胞

目的探讨应用改良的组织块酶消化法体外培养人大肠癌原代细胞的方法.方法应用结合组织块法和Ⅳ胶原酶消化法的改良的组织块酶消化法体外原代培养人大肠癌细胞,通过对培养条件、促进贴壁、控制污染、细胞纯化等方面的探索得到了大肠癌细胞,并最终用形态学方法(瑞姬氏染色)、和免疫学方法(免疫细胞化学)鉴定所得细胞.结果经改良的组织块酶消化法体外培养的人大肠癌原代细胞,瑞姬氏染色进行细胞形态学鉴定,结果显示胞核呈紫红色,核质比明显增大,符合肿瘤细胞特征;细胞胃肠癌相关糖链抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9,C A19-9)进行细胞免疫学鉴定,结果显示胞浆呈棕色,细胞CA19-9阳性.结论改良的组织块酶消化法在培养方法改良、促进贴壁、控制污染和去除杂细胞四方面进行了改进,既可快速获得游离细胞,又充分利用了未彻底消化的组织块.采用该改良的组织块酶消化法原代培养细胞成功率高,所培养的细胞进行初步鉴定证明为大肠癌细胞.     

大鼠结膜杯状细胞的体外培养及鉴定

目的体外分离、培养大鼠结膜杯状细胞,观察其形态、结构等生物学特征。方法取大鼠穹隆部结膜,加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中行组织块培养,5~7 d后酶消化法传代。观察原代及传代细胞的形态及生长情况,并应用特殊免疫组化染色方法分别对原代、传代培养的杯状细胞进行鉴定,用Image J软件计算细胞纯度。结果倒置相差显微镜下可见杯状细胞呈鹅卵石样,5~7 d在组织块周围形成环状结节。免疫组化结果显示,培养的原代细胞角蛋白(CK)4染色阴性,CK7染色阳性,且CK7阳性细胞数占(97.3±2.0)%。传代杯状细胞中,绝大多数凝集素UEA-I染色为阳性,阳性细胞占(91.2±2.7)%。结论大鼠穹窿部结膜可以成功培养出杯状细胞,传代细胞仍保持原代细胞特性,且纯度较高。     

成年C57BL／6小鼠空肠Cajal间质细胞的分离、培养及鉴定

目的尝试优化体外培养成年小鼠小肠Cajal间质细胞的操作方法,为深入研究该细胞的生理功能提供一定细胞模型。方法6～8周龄C57BL／6小鼠禁食24h,无菌条件下截取3～5cm中段空肠,分离平滑肌肌条并剪至小块后使用Ⅱ型胶原酶消化20min,离心后进行组织块原代培养,观察不同时期细胞形态。使用c—Kit免疫荧光染色鉴定细胞表型是否为Cajal间质细胞。Fluo-3AM染色细胞内钙,观察细胞能否自发产生钙离子振荡。结果分离所得组织不含空肠上皮和固有层组织,仅为小肠肌层。联合使用胶原酶消化和组织块原代培养能够较方便地培养出原代细胞,该细胞呈梭形,且具有细胞突起,彼此交织成网状。该细胞免疫荧光染色呈c—Kit阳性,平滑肌标志物SMA阴性。钙成像分析显示其能够产生钙离子振荡。结论联合使用酶消化和组织块培养能够较方便地培养出成年小鼠的空肠Cajal间质细胞,该方法为后续探讨Cajal间质细胞的生理功能及机制提供了一定的细胞模型。     

脐动脉平滑肌细胞体外培养方法的改进

目的:建立并优化的人脐动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)的体外培养方法。方法:人脐动脉VSMCs的体外原代培养应用优化的组织块贴壁法进行。在分别应用传统细胞培养法和优化后细胞培养法贴壁培养提取的原代细胞10 d后,计数6孔板每孔细胞数目,并做统计比较分析相同时间内原代细胞的数量。以抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体和抗CD31抗体进行免疫荧光染色和倒置相差显微镜观察鉴定培养的细胞。结果:与传统细胞培养法相比,在相同的时间周期内优化实验方法后培养的原代细胞数量较传统多,我们可以在较短时间内得到实验所需的细胞量,因此优化后可缩短细胞的培养周期。原代和传代培养的脐动脉VSMCs生长良好,细胞经冻存、复苏后状态依然良好。光镜下细胞呈典型的"峰-谷"样生长,细胞多为长梭形,具有VSMCs的特征,且传代培养至第7代,细胞生长特性不变。经抗α-SMA、CD31抗体进行免疫荧光染色鉴定证实为VSMCs。结论:优化的组织块贴壁法可缩短原代人脐动脉VSMCs的培养周期,且细胞的生物学特性较稳定,为与平滑肌相关的疾病进展及心血管生长发育的研究奠定了实验基础。     

人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定

目的对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定,探讨一种高效的分离及纯化方法,为细胞移植提供种子细胞。方法使用酶消化法原代提取人成纤维细胞,快速贴壁法纯化细胞,对细胞进行形态学观察、HE染色,免疫细胞化学鉴定细胞标志物Vimentin。结果利用倒置显微镜及HE染色,可见细胞为散在分布的梭形贴壁细胞,当细胞汇流时,呈鱼群样或漩涡状排列,且细胞在15代内形态保持不变。结论成功地发现快速提取成人成纤维细胞的方法,为成人自体细胞移植的研究奠定了基础。     

三种培养原代支气管成纤维细胞方法的比较

目的 探讨建立适用于SD大鼠支气管成纤维细胞原代培养的方法.方法 取重量为150~180 g的SD雄性大鼠的支气管组织,采用Ⅰ型胶原酶、木瓜蛋白酶联合消化+组织块黏附法、胰酶+胶原酶联合消化(双酶消化法)+组织块黏附法、组织块黏附法进行原代支气管成纤维细胞的培养.利用镜下观察细胞的生长特点;免疫荧光染色法鉴定细胞的类型及纯度;细胞的增殖活性用CCK-8检测并绘制生长曲线.结果 酶消化+组织块黏附法培养使细胞游出速度更快、细胞数量产生更多.组织块黏附法培养的细胞爬出相对缓慢、培养周期更长、获得的细胞数量相对较少.CCK8增殖曲线呈S形.培养48 h,经酶消化法分离得到的成纤维细胞已经游出,约有60%以上细胞已经贴壁,培养6~7 d可传代.组织块贴壁法培养5 d时,细胞开始从组织块边缘缓慢爬出,随后从组织块周围延伸长,14 d左右可传代.使用酶消化法培养的支气管成纤维细胞中可混有杂细胞团,为提高成纤维细胞的纯度可通过差速贴壁法纯化.结论 双酶消化法+组织块黏附法可以更高效、快速的分离和获取支气管成纤维细胞,为研究慢性阻塞性肺疾病(COPD)气道重塑提供了充足的种子细胞.     

大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定

目的探讨大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养方法,了解生长特性,为血管增生性疾病的治疗研究提供试验材料。方法采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,用倒置相差显微镜观察其生长情况,用免疫组化染色做鉴定,台盼蓝染色进行活力检测。结果85%的组织块接种存活,原代培养后2周左右即可传代,至少可以传8代以上,并且细胞形态、生长特点不发生明显的改变,6代的血管平滑肌细胞纯度达97%以上。台盼蓝染色约有94%以上的细胞为活细胞。镜下培养的血管平滑肌细胞呈典型的"谷峰状"生长,免疫组化染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论正确地利用组织贴块法可以简单、经济、高效地培养出血管平滑肌细胞,为血管增生性疾病的治疗研究提供了理想的细胞模型。     

兔关节软骨细胞原代培养及生物学鉴定

目的探讨兔膝关节软骨细胞体外分离培养及鉴定方法,分析软骨细胞在体外不同阶段的生物学特性。方法取4周龄健康新西兰兔膝关节软骨,以机械分离和酶消化相结合的方法获取膝关节软骨细胞,经体外培养、传代。观察不同培养阶段细胞形态和生长,CCK-8法测定细胞增殖并绘制生长曲线,甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫荧光染色鉴定软骨细胞。结果兔软骨细胞经两步消化,可获取高纯度的软骨细胞,细胞活性率可达95%以上,甲苯胺蓝染色及免疫荧光呈阳性结果。原代细胞和第一代细胞呈多角形,传代4~5代后,细胞形态逐渐由多角形变为梭形,基质分泌氨基多糖和胶原染色变浅。结论成功建立了简单易行的软骨细胞分离、培养方法,通过传代可以获取大量实验细胞,但仅限于5代以内软骨细胞适用于组织工程研究。